1、實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離第1頁，共62頁。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基本進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)。3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實(shí)驗(yàn)原理。 第2頁，共62頁。微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單,形體微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用. 原核生物界 原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識(shí)： (一)微生物第3頁，共62頁。細(xì)菌的外形與大小細(xì)菌：單細(xì)胞不分枝的原核微生物。細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色后顯微鏡觀察圖1-1 常見

2、的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌 B.桿菌 C.弧菌第4頁，共62頁。細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中又有液泡、儲(chǔ)存性顆粒、核質(zhì)等。細(xì)菌的構(gòu)造第5頁，共62頁。*細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：堅(jiān)韌且有彈性細(xì)胞壁有哪些功能？ 固定細(xì)胞外形； 保護(hù)細(xì)胞免受外力的損傷； 阻攔大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞；使細(xì)胞具有致病性及對(duì)噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素第6頁，共62頁。芽孢 有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)

3、境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌.第7頁，共62頁。菌落：單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。第8頁，共62頁。細(xì)菌的菌落特征因種而異 第9頁，共62頁。細(xì)菌的營養(yǎng)類型 根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。1.自養(yǎng)菌:2.異養(yǎng)菌: 腐生菌 寄生菌 大部分病原菌光合自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌第10頁，共62頁。放線菌1、結(jié)構(gòu)：單細(xì)胞原核分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）第11頁，共62頁。鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素

4、、慶大霉素 微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生的 應(yīng)用:第12頁，共62頁。病毒的結(jié)構(gòu)第13頁，共62頁。病毒的增殖：第14頁，共62頁。（二）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基用于菌種保存及分離、鑒定菌落、活菌計(jì)數(shù)等，半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運(yùn)動(dòng)，液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途第15頁，共62頁。液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第16頁，共62頁。固體

5、培養(yǎng)基：菌落，菌苔第17頁，共62頁。半固體培養(yǎng)基：無動(dòng)力 有動(dòng)力(彌散)(是否運(yùn)動(dòng)) 第18頁，共62頁。選 擇 培 養(yǎng) 基加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細(xì)胞第19頁，共62頁。2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方 (參考教材附錄內(nèi)容) 3.不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源和氮源、 無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)， 另外還需要滿足微生物生長對(duì)pH

6、、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。 第20頁，共62頁。培養(yǎng)基內(nèi)所含的基本物質(zhì)(1)水(2)碳源 (3)氮源(4)無機(jī)鹽第21頁，共62頁。(2)碳源可作為碳源的物質(zhì)有:含碳無機(jī)物: 、 、含碳有機(jī)物：蛋白質(zhì)脂肪酸不同微生物所利用的碳源不同異養(yǎng)型微生物的碳源為自養(yǎng)型微生物的碳源為碳酸鹽碳酸氫鹽二氧化碳糖類（主要）含碳有機(jī)物（有機(jī)碳）含碳無機(jī)物（無機(jī)碳）第22頁，共62頁。(3)氮源可作為氮源的物質(zhì)有:含氮無機(jī)物： 、 、 、含氮有機(jī)物：蛋白胨牛肉膏尿素固氮微生物所利用的氮源是氮?dú)獍睔庀跛?/p>

7、鹽氨鹽氮?dú)獾?3頁，共62頁。培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件(1)pH值如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性(2)特殊營養(yǎng)物質(zhì)- ?如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素(3)氧氣的含量如:培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)需要提供無氧的條件(4)滲透壓生長因子第24頁，共62頁。(三)無菌技術(shù)1、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵: 2、無菌技術(shù) 的四個(gè)方面(參看教材20頁)防止外來雜菌的入侵第25頁，共62頁。無菌技術(shù)的四個(gè)方面（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒 ；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌 ；（3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料

8、用具與周圍物品相接觸。 第26頁，共62頁。第27頁，共62頁。3、消毒與滅菌(1)消毒：概念：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物。包括芽孢和孢子嗎？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法 :如牛奶的消毒化學(xué)藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外線消毒(不包括芽孢和孢子)第28頁，共62頁。（2）滅菌概念：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a 灼燒滅菌 b 干熱滅菌 c 高壓蒸汽滅菌灼燒滅菌微生物的接種工具 (接種環(huán)、接種針)或其他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒注意適用范圍第29頁，共62頁。配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平

9、板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程第30頁，共62頁。實(shí)驗(yàn)流程配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄第31頁，共62頁。1計(jì)算、稱量2溶化3調(diào)pH：pH764過濾：這一步可以省去。5分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6加塞7包扎操作步驟第32頁，共62頁。配制培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基市場常見瓊脂條第33頁，共62頁。配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程第34頁，共62頁。包器材第35頁，共62頁。包器材第36頁，共62頁。配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培

10、養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程第37頁，共62頁。條件：121、100kPa20-30min滅菌第38頁，共62頁。接種前準(zhǔn)備用肥皂洗手并使用酒精消毒。順序： 點(diǎn)燃酒精燈酒精棉擦拭雙手酒精棉擦拭桌面第39頁，共62頁。配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程第40頁，共62頁。菌種擴(kuò)增接種擴(kuò)大培養(yǎng)： 靠近酒精燈火焰將大腸桿菌接種到三角燒瓶的液體培養(yǎng)基中，三角燒瓶在37搖床振蕩培養(yǎng)12h。第41頁，共62頁。菌種擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)用具LB固體培養(yǎng)基大腸桿菌菌液（LB液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)皿接種環(huán)酒精棉酒精燈鑷子、火柴、記號(hào)筆第42頁，共62頁。菌種擴(kuò)增搖床震蕩培養(yǎng)12h（于LB液體培養(yǎng)基中）本圖來自

11、十一學(xué)校第43頁，共62頁。配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程第44頁，共62頁。配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程第45頁，共62頁。倒平板第46頁，共62頁。配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程第47頁，共62頁。接種、劃線灼燒接種環(huán)取菌液劃線分離燒至暗紅第48頁，共62頁。接種、劃線灼燒接種環(huán)取菌液劃線分離菌液膜第49頁，共62頁。接種、劃線第50頁，共62頁。 平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法 第51頁，共62頁。劃線分離為什么通過劃線分離可得到單菌落？每劃完一個(gè)區(qū)域要不要灼燒接種環(huán)？第52頁

12、，共62頁。倒置后做好標(biāo)記，寫在培養(yǎng)皿側(cè)面劃線分離第53頁，共62頁。6、培養(yǎng)為什么要倒置培養(yǎng)？恒溫37培養(yǎng)第54頁，共62頁。單菌落第55頁，共62頁。菌種的保存 1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法第56頁，共62頁。問題討論 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線

13、次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第57頁，共62頁。 2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。第58頁，共62頁。問題討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？ 應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。第59頁，共62頁。平板冷凝后，為什么要將平板倒置？在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比