1、細胞培養(yǎng)技術(shù)與安全溫超瑋11-3-2016主要內(nèi)容一. 細胞培養(yǎng)的條件及環(huán)境二. 細胞培養(yǎng)前的實驗準備三. 細胞原代和傳代培養(yǎng)四. 體外培養(yǎng)細胞分型五. 細胞培養(yǎng)基本技術(shù)六. 常見細胞污染及其處理方法七. 實驗安全一. 培養(yǎng)細胞需要什么？條件：培養(yǎng)基（碳水化合物、無機鹽、必需氨基酸、微量元素等）、血清（激素、生長因子等）、消化液（ 0.25胰蛋白酶）、緩沖液（磷酸鹽等）、抗生素（青霉素、鏈霉素等）環(huán)境：恒定溫度（37）、CO2 （抑制NaHCO3CO2反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH）、無菌（提供細胞生長的潔凈環(huán)境）二. 前期試驗準備？培養(yǎng)基（DMEM、1640、DMEM/F12、L-15等）配制和除菌（0.2

2、2um過濾）。血清、胰酶、抗生素的購買和分裝。緩沖液的配制（PBS、Hanks等）和滅菌（高壓或0.22um過濾）。培養(yǎng)器皿（槍頭、滴管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、試劑瓶等）的滅菌（高壓）。隔離服（高壓滅菌-干燥-紫外）、移液器（75%酒精-紫外）。細胞培養(yǎng)用器皿的清洗和消毒 一般玻璃器皿的清洗分為四個步驟：1、自來水浸泡2、洗滌劑刷洗(如有必要進行超聲處理）3、泡酸（濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水）4、流水沖洗過夜，依次用蒸餾水、三蒸水漂洗，最后烘干備用 常用消毒方法：1、濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌），121攝氏度，1530min2、過濾除菌(如：血清的除菌）三. 原代培養(yǎng)和傳代原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組

3、織或細胞并置于體外條件下生長，到第一次傳代之前的階段。特性：一般可持續(xù)培養(yǎng)1-4周?？梢娂毎至?，但不旺盛，呈二倍體核型。與體內(nèi)細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。三. 原代培養(yǎng)和傳代傳代培養(yǎng)細胞在體外環(huán)境中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中在進行培養(yǎng)的過程。特性：細胞增殖旺盛，在細胞全生命期中持續(xù)時間最長。30代內(nèi)大部分可維持二倍體核型，為有限細胞系。傳代30-50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，甚至完全停止或衰退凋亡?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化獲得無限繁殖能力，成為無限細胞系。 （一）貼壁型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按照體內(nèi)組織學標推判定，僅大致分成以下四型

4、： 1.成纖維細胞型 2.上皮型細胞 3.游走細胞型 4.多型細胞型四. 體外培養(yǎng)細胞的分型胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。包括成纖維細胞，中胚層起源的心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞，以及培養(yǎng)中細胞形態(tài)與成纖維類似者。 1. 成纖維細胞型成纖維細胞 心肌細胞細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。 2. 上皮型細胞 腎小管上皮細胞 乳腺上皮細胞 3、游走細胞型： 呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞

5、不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。 4、多型細胞型： 有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 多型細胞型（神經(jīng)細胞） 游走細胞型 見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖，可聚集形成細胞團。 （二）懸浮型細胞 懸浮型細胞分析多個STR基因座，可以準確判斷交叉污染和細胞類型。高度靈敏，可以檢測最低0.1ng DNA。人類細胞16個的基因座檢測。小鼠細胞8個高度多態(tài)性位的基因組檢測。人-鼠細胞交叉污染檢測。細胞懸液（細胞數(shù)106個）或基因組DNA（ 20L，濃度 50ng/L）。細胞鑒定STR基因分型五

6、. 細胞培養(yǎng)基本技術(shù)換液消化和傳代凍存復(fù)蘇貼壁細胞 直接換液：棄去舊培養(yǎng)液PBS洗滌細胞加入新培養(yǎng)液懸浮細胞 半定量換液：棄去1/3-1/2的舊培養(yǎng)液加入新培養(yǎng)液1. 細胞換液貼壁細胞 棄去舊培養(yǎng)液PBS洗滌細胞 加入胰酶消化，棄去胰酶加入新培養(yǎng)液，吹打混勻細胞懸液分瓶（皿），補充培養(yǎng)液懸浮細胞 全部細胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管，1000rpm離心5min棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞1000rpm離心5min，棄去PBS 加入新培養(yǎng)液，吹打混勻細胞懸液分瓶（皿），補充培養(yǎng)液2. 細胞消化和傳代3. 細胞凍存貼壁細胞 棄去舊培養(yǎng)液PBS洗滌細胞 加入胰酶消化，棄去胰酶加入培養(yǎng)液終止消化，吹打混勻并行

7、細胞計數(shù)加入凍存培養(yǎng)液（含30%血清+10%DMSO），吹打混勻轉(zhuǎn)移至凍存管，緩慢降低溫度至-196 。懸浮細胞 全部細胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管，1000rpm離心5min棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞1000rpm離心5min，棄去PBS 加入新培養(yǎng)液，吹打混勻并行細胞計數(shù) 加入凍存培養(yǎng)液（含30%血清+10%DMSO），吹打混勻轉(zhuǎn)移至凍存管，緩慢降低溫度至-196 。貼壁細胞與懸浮細胞一致。 迅速取出凍存管，于37-40水浴1-2min內(nèi)快速攪動，以融化細胞冷凍塊將細胞全部轉(zhuǎn)移至15ml離心管，補充新培養(yǎng)液至總體積約10ml1000rpm離心5min，棄上清加入新培養(yǎng)液，吹打混勻細胞懸液分瓶（

8、皿），補充培養(yǎng)液4. 細胞復(fù)蘇細胞凍存和復(fù)蘇 細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。低溫保護劑的應(yīng)用 在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存細胞存活率。 常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，

9、提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。*DMSO在常溫下對細胞有毒性，且需常溫避光保存。慢凍程序： -4，20-40min；-20，40-60min；-80，過夜；液氮（-196 ）長期凍存?？烊诓襟E： 37-40水浴快速攪動，在1min內(nèi)融化細胞轉(zhuǎn)移細胞至15ml離心管，補充新培養(yǎng)液至總體積約10ml，稀釋DMSO的影響1000rpm離心5min，棄上清，加入新培養(yǎng)液細胞計數(shù)細胞計數(shù)結(jié)果以每ml細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)的原理和方法與白細胞計數(shù)相同。 細胞數(shù)(個/mL)=(4大格的總數(shù)/4) 104

10、稀釋倍數(shù)注：計上不計下，計左不計右六. 細胞污染白色念珠菌污染 絲狀菌（霉菌）污染六. 細胞污染細菌污染（瑞氏染色） 細菌污染六. 細胞污染 支原體污染 支原體污染細胞污染怎么辦？丟棄！無法丟棄？ 原則：排除后續(xù)外來污染；無限地稀釋細菌的濃度；抗生素抑制霉菌或真菌生長；加強無菌操作。細菌污染-貼壁細胞倒掉污染培養(yǎng)基，瓶口或皿接觸部位火焰滅菌。新鮮PBS晃動清洗，棄PBS，火焰滅菌，重復(fù)3-5次。加入雙抗，晃動清洗，靜置3-5min后吸出，重復(fù)2次。新鮮PBS晃動清洗1-2次。加入含有10-20%雙抗的培養(yǎng)液，培養(yǎng)5h。棄培養(yǎng)液，新鮮PBS清洗2次，胰酶消化，1000rpm離心3min。棄上清-

11、PBS重懸-離心2次，加入含有10-20%雙抗的培養(yǎng)液，換皿培養(yǎng)24h后觀察。根據(jù)污染情況，考慮是否重復(fù)以上步驟，或放棄細胞。其他污染-貼壁細胞霉菌或真菌：雙抗改為兩性霉素B（終濃度一般為2.5g/ml ）或制霉菌素或放線菌素D（3g/ml ），其余操作同前。支原體：泰樂菌素（終濃度一般為2.5g/ml ）。小竅門-貼壁細胞形態(tài)不好？傳代前，細胞生長匯合度不要超過70%（特定實驗要求除外）。持續(xù)傳代超過3個月（或者代數(shù)超過50代）：復(fù)蘇代數(shù)較低的細胞?！岸鳌奔毎合埃瑹o血清培養(yǎng)基預(yù)“吹洗”一次；PBS清洗+胰酶消化，加入全培養(yǎng)基后分皿；根據(jù)細胞貼壁情況（2-6h），吸棄未貼壁細胞，無血清

12、培養(yǎng)基“輕洗”一次，再加入全培養(yǎng)基。24-48h換液。分皿前盡可能吹打成單個細胞，無細胞抱團現(xiàn)象。更換較好的血清，適當提高培養(yǎng)基內(nèi)血清濃度。小竅門-背景不干凈（排除污染）？細胞狀態(tài)不好（參見前面）。PBS 洗滌后，胰酶“潤洗”一次（注意控制時間），吸棄上清。收集消化的細胞，1000rpm離心3min，吸棄上清，加入全培養(yǎng)基輕柔吹打懸浮細胞后分皿。七.實驗安全儀器操作試劑1.儀器操作CO2： 打開順序：培養(yǎng)箱開氣瓶開減壓閥開。 關(guān)閉順序：氣瓶關(guān)減壓閥關(guān)培養(yǎng)箱關(guān)。液氮罐： 佩戴防凍手套和護目鏡；稍提起冷凍架，傾斜片刻使液氮流回罐內(nèi)后再將架子拎出；速度輕柔且迅速，取物時記得關(guān)閉液氮罐蓋子。1.儀器操作酒精燈： 酒精燈的燈芯要平整，如以燒焦或不平整，要用剪刀修正。添加酒精不得超過總?cè)莘e的2/3，且不少于1/4。 禁止向燃著的酒精燈里添加酒精。 禁