1、基因工程研究的理論依據(jù)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎基因是可以切割的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對應關系遺傳密碼是通用的基因可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代第1頁，共144頁。DNA重組技術要有四個必要條件：工具酶、基因、載體、受體細胞第2頁，共144頁。DNA限制性內(nèi)切酶可分為三類： 、 、酶在基因工程中基本不用,why?第一節(jié)限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶是從細菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以識別并切開核酸序列特定位點分子手術刀Arber、Smith和Nathans因為在發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎。第3頁，共144頁。、限制性內(nèi)切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化

2、作用及依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性。類酶結合于特定的識別位點，但卻沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進行隨機切割，很難形成穩(wěn)定的、特異性切割末端。類酶在識別位點上切割DNA，然后從底物上解離下來。第4頁，共144頁。核酸內(nèi)切限制酶的類型及其主要特性特性I型II型III型限制和修飾活性單一多功能的酶分開的核酸內(nèi)切酶和甲基化酶 具有一種共同亞基的雙功能的酶核酸內(nèi)切限制酶的蛋白質(zhì)結構3種不同的亞基單一的成份 2種不同的亞基 切割位點在距寄主特異性位點至少1000bp的地方可能隨機地切割位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3，端2426bp處甲基化作用的位點寄主特異性的位點寄主特異性的位點寄主

3、特異性的位點識別未甲基化的序列進行核酸內(nèi)切酶切割 能 能能序列特異的切割不是是是DNA克隆中的用處無用十分有用用處不大第5頁，共144頁。一、II類限制性內(nèi)切酶的特點識別特定的核苷酸序列，其長度一般為4、5或6個核苷酸且呈二重對稱，但有少數(shù)酶識別更長的序列或兼并序列；具有特定的酶切位點 ，產(chǎn)生出特定的酶切末端5突出粘末端、3突出粘末端、平末端；類限制修飾系統(tǒng)是由兩種酶分子組成的二元系統(tǒng)；限制性內(nèi)切酶、獨立的甲基化酶。 被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫做 粘性末端。第6頁，共144頁。EcoRI特異識別GAATTC及其互補堿基組成的雙鏈

4、片段Sma特異識別CCCGGG,形成平末端5CCC GGG3 GGG CCC5CCC GGGGGG3CCC第7頁，共144頁。二、使用限制性內(nèi)切酶時應注意的問題1、仔細查閱酶的識別序列和切割位點。同裂酶：不同來源但是識別同樣順序和相同切割位點的限制性內(nèi)切酶。同尾酶：有時有兩種限制性內(nèi)切酶識別不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所產(chǎn)生的粘性末端卻相同，這類酶為具不同酶切位點的DNA片段重組提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA連接酶連接后，都不能再被其切割了。第8頁，共144頁。2、注意酶反應條件，相同反應條件的酶可以同時酶解DNA樣品。3、注意說明書中所列出的comments的內(nèi)容

5、，會提供有關限制性內(nèi)切酶識別序列中位點特異性甲基化的信息以及引起酶產(chǎn)生star activity的原因。star activity：指當酶的反應條件改變時，其在識別序列中的酶切位點發(fā)生改變。產(chǎn)生的原因：反應體系中甘油的濃度12；酶：DNA比率25u/g；缺少Nacl和存在Mn2。第9頁，共144頁。4、注意酶的濃度，酶切時不是酶加得越多越好。一般以在20l反應體積中，37，每小時水解1微克DNA的酶量定為一個酶單位。5、注意酶在保溫過程中的活性變化。ACC在5 小時內(nèi)具有全部活力BamH在第一個小時內(nèi)具有全部活力，在第二小時具有部分活力，而在2小時以后就無活力了。Cfo僅在第一個小時內(nèi)具有全部

6、活力，一個小時以后就沒有活力了。第10頁，共144頁。三、連接酶定義：用于將兩端乃至數(shù)段DNA片段拼接起來的酶。用途：（1）、連接帶匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的雙鏈DNA分子相互連接或與合成的寡核苷酸接頭相連接。這類反應要比粘末端之間連接慢得多，但單價陽離子（150-200mmol/LNacl）或低濃度的聚乙二醇（PEG）可提高連接效率。第11頁，共144頁。DNA連接酶連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）。第12頁，共144頁。第13頁，共144頁。四、修飾酶1、DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I：3種催化活性klenow 大片段酶：2種催化活性T4噬

7、菌體DNA聚合酶： 2種催化活性T7噬菌體DNA聚合酶： 2種催化活性耐高溫DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）反轉(zhuǎn)錄酶： 3種催化活性末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶等第14頁，共144頁。2、依賴于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌體及T7和T3噬菌體RNA聚合酶用途:在in vitro條件，合成單鏈RNA作為雜交探針第15頁，共144頁。3、T4噬菌體多核苷酸激酶：催化ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA片段的5末端。用途：標記DNA片段的5端，制備雜交探針；基因化學合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于測序引物的5標記。5 HOOH 3HOOH355突出末端5隱蔽末端532 POH 3HO32P3532P

8、 ATP第16頁，共144頁。4、堿性磷酸酶：用途：去除DNA片段5末端的磷酸，以防止在重組中自身環(huán)化，從而提高重組效率；在用32pATP標記DNA或RNA的5末端前，去除DNA或RNA片段的非標記的5磷酸。5 POH 3HOP355突出末端5隱蔽末端OHHO5HOOH 335第17頁，共144頁。第18頁，共144頁。第二節(jié)克隆載體基因工程載體應具備的條件：能自我復制并能帶動插入的外源基因一起復制；具有合適的限制性內(nèi)切酶位點： 在載體上單一的限制性酶切位點越多越好，這樣可以將不同限制性內(nèi)切酶切割后的外源DNA片段方便的插入載體；在細胞內(nèi)拷貝數(shù)要多，這樣才能使外源基因得以擴增；載體的分子量要小

9、，這樣可以容納較大的外源DNA插入片段：在細胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失；應該有一個或多個選擇標記。第19頁，共144頁。大腸桿菌表達載體應具備：強的啟動子，一個強的可誘導的啟動子可使外源基因有效的轉(zhuǎn)錄；在啟動子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個好的核糖體結合位點序列（SD）；在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個強的轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。第20頁，共144頁。一、質(zhì)粒(plasmid)定義：質(zhì)粒是能自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們在細菌中以獨立于染色體之外的方式存在。AOCSCL第21頁，共144頁。質(zhì)粒載體的基本要求具有復制起點應包含

10、一個可供選擇的標記基因具有多克隆位點具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)第22頁，共144頁。F質(zhì)粒：有些攜帶有幫助其自身從一個細胞轉(zhuǎn)入另一個細胞的信息的質(zhì)粒。R質(zhì)粒：表達對一種抗生素的抗性的質(zhì)粒。降解質(zhì)粒：攜帶參與或控制一些不同尋常的代謝途徑的基因的質(zhì)粒。穿梭載體：在大腸桿菌的載體上放上第二個復制起始位點，使它在另一個宿主細胞中也能進行復制。第23頁，共144頁。1、質(zhì)粒載體pBR322特點1）大小為4363bp；2）含有兩個抗生素基因（抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素）；3）有單一的BamH、Hind和Sal的識別位點（在四環(huán)素抗性基因內(nèi)）、Pst識別位點（在氨芐青霉素抗性基因內(nèi)）； 外源片段在BamH、

11、 Hind、 Pst位點插入時，可引起抗生素失活來篩選重組體。4）帶有一個復制起始點，可以保證這個質(zhì)粒只在大腸桿菌里行使復制功能，在大腸桿菌里pBR322以高拷貝數(shù)存在。第24頁，共144頁。第25頁，共144頁。2、質(zhì)粒載體pUC191）特征大小為2686bp；乳糖操縱子半乳糖苷酶帶有pBR322的復制起始位點，一個氨芐青霉素抗性基因；一個大腸桿菌乳糖操縱子半乳糖苷酶基因的調(diào)節(jié)片段（lacZ）,一個調(diào)節(jié)lacZ基因表達的阻遏蛋白的基因lacI；含有多個單克隆位點。第26頁，共144頁。第27頁，共144頁。第28頁，共144頁。2）pUC19的篩選：培養(yǎng)基中含有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，

12、lac操縱子的一個誘導物）時，lacI的產(chǎn)物就不能與lacZ的啟動子區(qū)域結合，質(zhì)粒pUC19的lacZ就可以轉(zhuǎn)錄，進而翻譯，lacZ蛋白會與染色體DNA編碼的一個蛋白形成具有活性的雜合半乳糖苷酶；在底物5溴4氯3吲哚半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal會被雜合半乳糖苷酶水解成藍色的產(chǎn)物，沒有插入外源DNA序列的pUC19質(zhì)?？寺【统仕{色；由于pUC19的單克隆位點的序列是整合在lacZ之中的，若pUC19質(zhì)粒中插入有目的DNA片段，就會破環(huán)lacZ的結構，導致細胞無法產(chǎn)生功能性的lacZ蛋白，也就無法形成雜合的半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。第29頁，共144頁。第30頁，共144頁?；パa

13、原理載體：含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和N端146個氨基酸的編碼序列，并在編碼序列中插入了一個MCS受體菌：為半乳糖苷酶C端序列編碼互補：宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質(zhì) lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補第31頁，共144頁。穿梭質(zhì)粒:人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質(zhì)粒載體。第32頁，共144頁。二、噬菌體噬菌體可以進入裂解循環(huán)，20分鐘后就可使宿主細胞發(fā)生裂解，同時釋放出大約100個噬菌體顆粒。噬菌體也可以進入溶源循環(huán)，即注入的DN

14、A整合到大腸桿菌的染色體中，以前噬菌體的形式潛伏起來，永久保留。第33頁，共144頁。第34頁，共144頁。第35頁，共144頁。第36頁，共144頁。噬菌體DNA大約長50kb，其中大約20kb對于整合切割過程極為關鍵，稱為整合切割（I/E）區(qū)域。 對于構建文庫，可將這20kbDNA片段去掉，強迫重組的噬菌體進入裂解循環(huán)。整合切割區(qū)域尾部基因頭部基因粘性末端粘性末端負責DNA復制的基因細胞裂解基因噬菌體的DNA示意圖左臂右臂第37頁，共144頁。噬菌體頭的大小足以裝下50kb單元的線性DNA， DNA52kb,則無法包裝進頭部cos位點（cos site）就是保證在超長線性DNA分子上每兩個

15、cos位點之間為50kb,使DNA分子能正確的裝配進噬菌體 在頭的入口處有一種酶，它能識別雙鏈線性DNA分子上的cos序列，并在cos序列處切斷DNA分子，使適當大小的DNA進入噬菌體的頭部第38頁，共144頁。噬菌體DNA分子示意圖第39頁，共144頁。第40頁，共144頁。三、柯斯質(zhì)粒（cosmid）可攜帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)勢?？滤官|(zhì)粒上帶有多個單克隆位點、兩個cos位點、DNA復制起始位點和抗生素抗性基因，在兩個cos位點之間含有一個限制性內(nèi)切酶位點（RE）。第41頁，共144頁。第42頁，共144頁。應用柯斯質(zhì)粒載體進行

16、基因克隆的一般程序第43頁，共144頁。利用柯斯質(zhì)?？寺〈笃蜠NA第44頁，共144頁。四、YAC載體1、目前能容納最大外源DNA片段的載體是YAC（酵母 人工染色體，yeast artificial chromosome）。2、真核生物染色體三個關鍵部分：著絲粒（centromere,CEN）,它主管染色體在細胞分裂過程中正確的分配到各子細胞中；端粒（telomere,TEL）, 位于染色體的末端，對染色體末端的復制以及防止染色體被核酸外切酶切斷具有重要的意義；自主復制序列（autonomously replicating sequence,ARS）,即在染色體上的多處DNA復制起始位點。

17、第45頁，共144頁。3、作為真核基因表達載體應具備如下條件：含有原核基因的復制起始序列（如ColE1起始序列ori）篩選標記；含有真核基因的復制起始序列（如SV40病毒的復制序列、酵母的2質(zhì)粒的復制起始序列ARS、以及真核細胞篩選標記（如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母細胞中與自養(yǎng)有關的基因）；含有有效地啟動子序列（可包含增強子序列等各種順式作用元件）；RNA聚合酶所需的轉(zhuǎn)錄終止和poly(A)加入的信號序列；合適的供外源基因插入的限制性內(nèi)切酶位點。第46頁，共144頁。4、YAC 的主要功能成份有三： 1）著絲粒：mitosis姊妹染色單體和減數(shù)分裂同源染色體分離之必需2）端粒3）自主復制

18、序列（ARS）元件4）構建YAC需要4個短序列：2個端粒，著絲粒，ARS元件，選擇標記，與外源DNA連接成線性DNA分子，導入酵母細胞克隆第47頁，共144頁。pYAC4結構圖第48頁，共144頁。第49頁，共144頁。第三節(jié) 受體細胞接受遺傳物質(zhì)的細胞能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定存在，具有重要的應用價值和理論價值第50頁，共144頁。一、原核生物細胞表達系統(tǒng)優(yōu)點大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA導入沒有核膜，染色體DNA沒有固定結合的蛋白質(zhì)基因組小，遺傳背景簡單繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快第51頁，共144頁。一、原核生物細胞表達系統(tǒng)問題真核基因修飾DNA與細胞分

19、裂的關系細胞的特異性分化熱源、內(nèi)毒素不易除去、產(chǎn)品難純化包涵體提純繁瑣蛋白質(zhì)復性困難，易出現(xiàn)肽鏈的不正確折疊第52頁，共144頁。二、真核生物細胞表達系統(tǒng)真核生物由多細胞組成，有明顯的細胞分化和細胞核真核細胞的一條成熟的mRNA只能翻譯出一條多肽存在大量的重復序列和內(nèi)含子第53頁，共144頁。1、真菌細胞表達系統(tǒng)基因結構相對簡單培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)表達產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工不產(chǎn)生毒素酵母菌第54頁，共144頁。2、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達水平僅為細菌表達量的5%能夠指導蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復雜的N端糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能第55頁，共144頁。

20、3、昆蟲細胞及其幼體表達系統(tǒng)良好的翻譯后修飾功能表達產(chǎn)物接近天然的蛋白質(zhì)構型第56頁，共144頁。三、受體細胞的選擇避免外源DNA被修飾和降解無重組能力，重組DNA分子能穩(wěn)定維持和表達具有較高的可轉(zhuǎn)化性含有與載體的選擇性標記相匹配的基因型，便于重組子的篩選感染寄生缺陷型，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染第57頁，共144頁。第三節(jié) 重組基因的導入和篩選第58頁，共144頁。DNA克隆的基本過程分：分離目的基因切：對目的基因和載體適當切割接：目的基因與載體連接轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌篩：篩選出含有重組體的受菌體第59頁，共144頁?；蚬こ碳夹g策略分： 基因載體 目的基因 質(zhì)粒 噬菌體 病毒

21、 直接分離 cDNA 人工合成 基因文庫切： 限制性內(nèi)切酶 有缺口的載體 目的基因接： 連接酶 粘端連接 平端連接 尾接法 重組體轉(zhuǎn)： 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 體外包裝 帶重組體的宿主篩： 表型篩選 電泳法 核酸雜交第60頁，共144頁?；虿僮鞯幕静襟E第61頁，共144頁。1、 細胞內(nèi)總DNA的提取分離 細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序第62頁，共144頁。 紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。第63頁，共144頁。2、基因重組的方法：1）根據(jù)外源DNA片段末端的性質(zhì)同載體上適當?shù)拿盖形稽c相連實現(xiàn)基因的體外重組。第64頁，共144頁。外源DNA片段所具末端克隆所需條件注明平端需高濃度的DNA和連接酶

22、1)非重組體克隆的背景可能較高2)外源DNA與載體DNA結合處的酶切位點可能消失3)重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝不同的突出端用限制性酶酶解后，需純化載體去除小片段，以提高有效連接效率1)載體與外源DNA結合處的酶切位點?？杀Ａ?)非重組克隆的背景較低3)外源DNA只以一個方向插入到重組質(zhì)粒中相同的突出端酶切后的線狀載體DNA常用磷酸酶處理去磷酸化1)載體與外源DNA結合處的酶切位點常可保留2)外源DNA會以兩個方向插入3)重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝外源DNA片段與載體的連接第65頁，共144頁。2）當在載體的以及外源DNA片段兩端的限制酶切位點之間，不可能找到恰當?shù)钠ヅ鋾r，可采用

23、下述方法解決： 在線狀質(zhì)粒的末端或外源DNA片段的末端用DNA連接酶接上接頭或銜接頭，這種接頭可以是含單一的或多個限制性酶切位點，然后通過適當?shù)南拗泼附夂筮M行重組。第66頁，共144頁。第67頁，共144頁。使用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段部分補平3凹端。3凹端轉(zhuǎn)變成粘端。5TCGAAGCT5xho I5GATCCTAG5Sau3A I5TCGAAGCT5CTTC5GATCCTAG5AGGCdCTP、dTTP、dATP、dGTPKlenown酶第68頁，共144頁。使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3凹端完全補平或用S1核酸酶、綠豆核酸酶、Klenow酶、T4DNA聚合酶去

24、除3突出端產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA分子相連。3）可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體酶切位點處和外源DNA片段的3端加上相互補的同聚尾同聚物加尾法，常用于雙鏈cDNA的分子克隆。第69頁，共144頁。Pst1質(zhì)粒pGCTGCAACGTCGpCTGCAGGGGGGpGGpGGGGGGACGTCAAAAAAAmRNAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAACCCCCCTTTTTTTCCCCCC用末端轉(zhuǎn)移酶加（dG）殘基用末端轉(zhuǎn)移酶加（dC）殘基以oligo(dT)作引物合成cDNA第一鏈合成cDNA第二鏈退火第70頁，共144頁。CTGCAGGGGGAAAA

25、AAACCCCCC G G CCCCCCTTTTTTTGGGGGGACGTC轉(zhuǎn)化適當?shù)拇竽c桿菌菌株選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化過程中，DNA上的缺口為宿主酶所修復，從而在cDNA兩端恢復Pst1位點Pst1Pst1cDNA第71頁，共144頁。4）多聚酶鏈反應（PCR）為基因定向重組和構建外源基因高效表達治理提供了一個通用方法。 根據(jù)載體上的克隆位點設計PCR引物，使引物上帶有與載體克隆位點相匹配的限制性內(nèi)切酶識別序列。第72頁，共144頁。3、重組DNA分子導入受體細胞1)轉(zhuǎn)化：由于外源DNA的進入而使細胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化采取一些方法處理細胞，經(jīng)處理后的細胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細胞，再與

26、外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率第73頁，共144頁。2)轉(zhuǎn)導：通過噬菌體或病毒的感染作用將一個細胞的遺傳信息傳遞到另一個細胞的過程用噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進入宿主細菌或細胞，使目的序列得以復制繁殖第74頁，共144頁。3)轉(zhuǎn)染：重組的噬菌體DNA也可像質(zhì)粒DNA的方式進入宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過CaCl2等處理成感受態(tài)細菌再接受DNA，進入感受態(tài)細菌的噬菌體DNA可以同樣復制和繁殖也可用人工脂質(zhì)膜包裹DNA，形成的脂質(zhì)體可以通過與細胞膜融合而將DNA導入細胞第75頁，共144頁。具體

27、方法：氯化鈣法電穿孔： 將宿主細胞置于一個高強電場中，通過電場脈沖在細胞壁上打孔，DNA分子隨即進入細胞聚乙二醇介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法： 常用于轉(zhuǎn)化酵母以及其他真菌細胞活躍生長的細胞或菌絲體用消化細胞壁的酶處理變成球形后，在適當濃度的聚乙二醇6000（PEG-6000）的介導下將外源DNA轉(zhuǎn)化入受體細胞中第76頁，共144頁。磷酸鈣或DEAE葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染： 將外源基因?qū)氩溉轭惣毎兴矔r表達的常規(guī)方法 磷酸鈣和DNA共沉淀：將被轉(zhuǎn)染的DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過內(nèi)吞作用進入受體細胞 DEAE葡聚糖作用：可能是其與DNA結合從而抑制核酸酶的作用或與細胞結合從而促進DNA的

28、內(nèi)吞作用第77頁，共144頁。原生質(zhì)體融合： 通過帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細胞直接融合脂質(zhì)體法： 將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜融合將基因?qū)爰毎说娘@微注射法： 即將目的基因重組體通過顯微注射裝置直接注入細胞核中 第78頁，共144頁。4、 一般克隆基因的檢查和鑒定方法瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團帶負電荷酶解片段向陽極移動電場驅(qū)動力和凝膠阻力 不同遷移率分子量標準參照物 酶切和電泳方法第79頁，共144頁。1）、重組質(zhì)粒的快速鑒定：根據(jù)有外源基因插入的重組質(zhì)粒同載體DNA之間大小的差異區(qū)分。2）、重組質(zhì)粒的限制酶解分析。3）、

29、通過互補使菌落產(chǎn)生的顏色反應來篩選重組體。第80頁，共144頁。 標志補救（marker rescue）若目的基因能夠在宿主菌表達，且表達 產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補，就可利用對 營養(yǎng)素的依賴表型來篩選。宿主生長 依賴Leu重組體 + 目的基因 能夠合成Leu 在沒有Leu存在時 能生長（已轉(zhuǎn)化） 重組體轉(zhuǎn)化的細菌中 在沒有Leu存在時 不生長（沒有轉(zhuǎn)化）第81頁，共144頁。4)、外源DNA片段插入失活如果載體帶有兩個或多個抗生素抗性基因并在其上分布適宜的可供外源DNA插入的限制性內(nèi)切酶位點時，當外源DNA片段插入到一個抗性基因中去時可導致此抗性基因失活。第82頁，共144頁。第83頁，共1

30、44頁。5)、分子雜交篩選法：原位雜交點雜交和southern雜交第84頁，共144頁。A.核酸的分子雜交技術在大多數(shù)核酸雜交反應中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細管作用或電導作用按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印” 轉(zhuǎn)移到濾膜上的常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）第85頁，共144頁。B.兩個步驟將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上 核酸印跡(nucleic acid blotting)轉(zhuǎn)移 主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑

31、印跡法(colony and plaque blotting) 將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。第86頁，共144頁。（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉(zhuǎn)移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析Southern雜交第87頁，共144頁。 A. DNA體外重組實驗 B. 抗生素篩選轉(zhuǎn)化子細胞 C. 培養(yǎng)突變株細胞 D. Southern雜交實驗結果顯示，外源目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入突變株細胞中Southern雜交分析示例第88頁，共144頁。6)、表達文庫的免疫學篩選：絕大多數(shù)構建噬菌體的cDNA文庫選用g

32、t11、ZAP或ORF8作為表達載體這些噬菌體帶有一拷貝的大腸桿菌LacZ基因，克隆位點位于翻譯終止密碼子上游53bp處cDNA插入方向和閱讀框正確時，可以表達氨基端為半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列將暴露出可用特異抗體檢測的抗原表位第89頁，共144頁。LacZ+EcoRIEcoRIEcoRILacZgt11重組文庫感染第90頁，共144頁。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落轉(zhuǎn)膜菌落的蛋白質(zhì)裸露出來一抗與裸露的蛋白質(zhì)結合二抗與一抗結合顯色找出陽性克隆裂解加一抗洗去游離的一抗，加二抗洗去游離的二抗，加顯色劑第91頁，共144頁。第92頁，共144頁。7)、利用PCR方法來確定基因的

33、重組體克隆PCR產(chǎn)物；通用引物：pUC/M13 primer第93頁，共144頁。8)、DNA的序列分析： 這是最后確定分離的基因是否具有與天然基因相同序列的唯一方法，也是最確定的方法 第94頁，共144頁。第四節(jié) 獲得真核生物目的基因的方法鳥槍法cDNA的方法DNA的化學合成利用PCR或RT-PCR分離基因第95頁，共144頁。一、鳥槍法（shot gun）A.染色體DNA的切斷 超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使 目的基因斷開，大小不可控部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整B.與載體連接 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位

34、雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體.第96頁，共144頁。C.轉(zhuǎn)化受體細胞 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞D.篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）第97頁，共144頁。鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離

35、.第98頁，共144頁。鳥槍法操作的改進1、使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA 使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率 .第99頁，共144頁。2、在連接前將DNA片段進行分級分離例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接2.0 kb1.6 kb1.8 kb第100頁，共1

36、44頁。鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構第101頁，共144頁。二、cDNA的方法1、分離表達目的基因的組織或細胞：所用材料要盡量新鮮2、mRNA的分離3、第一鏈cDNA鏈的合成4、第二條cDNA鏈的合成5、cDNA的甲基化和接頭的加入6、雙鏈cDNA與載體相連：插入片段：載體1：13：17、基因文庫的建立 第102頁，共144頁。1、mRNA的分離 poly(A)尾巴可以用來把mRNA同rRNA和tRNA分離開來： 1)、先提取真核細胞的總RNA； 2)、把總RNA通過一個用纖維素填充的柱子； 在

37、纖維素上結合有許多長度大約為15個核苷酸的短鏈寡聚dToligo(dT)或dT15，真核基因mRNA分子的poly(A)尾巴通過堿基配對作用與oligo(dT)結合，而其它的RNA成分因為沒有poly(A)尾巴而不能結合 3)、真核生物mRNA可以用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫下來。第103頁，共144頁。2、第一鏈cDNA鏈的合成mRNA純化以后，樣品中加入短的oligo(dT)或隨機引物分子作為引物，同時加入逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液和4種脫氧核糖核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。 優(yōu)點：可以最大限度的減少poly(A)模板合成 cDNA的可能性； 缺點：cDNA合成總是從mRN

38、A3端開始，在最后的cDNA文庫中，代表mRNA3區(qū)域的組分所占的比例會高，而且對于一些較長的mRNA分子來說，由于反轉(zhuǎn)錄酶在cDNA合成過程中易從mRNA分子上脫開，從而造成第一條鏈合成不完整。第104頁，共144頁。 優(yōu)點：合成的cDNA文庫可能更好地代表最初RNA模板 所代表的組份； 缺點：由于cDNA在RNA鏈上的合成是隨機的，易產(chǎn)生較大量的非全長的RNA模板轉(zhuǎn)錄物，從而影響到全長的cDNA分子的獲得率。因此用總體RNA和oligo(dT)引物是最有效的組合。用逆轉(zhuǎn)錄酶在體外合成的DNA鏈往往不完整，但有一個特點：在合成停止前，DNA鏈會自己折轉(zhuǎn)回來幾個核苷酸形成一個發(fā)夾結構。隨機引物

39、第105頁，共144頁。3、第二條cDNA鏈的合成自身引導法：利用經(jīng)一條鏈上的3端序列的折回或發(fā)卡自引導法來合成效率低，目前已不多用。cDNA第二條鏈的置換合成法：作為第一條鏈合成反應產(chǎn)物的cDNA：mRNA雜交分子充當切口平移的模板。RNaseH在雜交分子上的mRNA鏈上造成切口，產(chǎn)生一系列的RNA引物，它們被E.coli的DNA聚合酶I用以合成第二鏈效率高，直接利用第一鏈反應產(chǎn)物，無須進一步處理和純化；省去S1酶的處理，改善了cDNA的質(zhì)量，使產(chǎn)生全長的cDNA的機率大大提高。引物銜接頭法合成雙鏈cDNA：通過將cDNA兩端加上限制性內(nèi)切酶位點，使其較方便的克隆入相應的載體。第106頁，共

40、144頁。自身引導法第107頁，共144頁。反轉(zhuǎn)錄酶RNaseH（部分降解）DNA聚合酶DNA聚合酶DNA連接酶RNA55cDNA第一鏈33RNA55555555cDNA第一鏈3cDNA第二鏈置換合成法第108頁，共144頁。4、基因文庫的建立基因文庫：指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后（必要時對這些DNA片段進行密度梯度離心或經(jīng)制備型凝膠電泳進行分級分離，以選擇長度適合于插入載體的片段）所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機地同相應的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。第109頁，共144頁?；蚪MDNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。

41、簡稱G文庫。第110頁，共144頁。 cDNA文庫用細胞總mRNA制備全套雙鏈cDNA后，建立的基因文庫。簡稱c文庫。第111頁，共144頁。三、DNA的化學合成1、基因片段的全化學合成特點：首先合成組成一個基因的所有片段，相鄰的片段間有46堿基的重疊互補，在適當?shù)臈l件下經(jīng)退火后，用T4DNA連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的共價鍵形式連接成一個完整的基因?；瘜W合成的DNA片段純化后其5和3端都為羥基，在組建基因前要將DNA片段的5端磷酸化（處于基因5端的兩個寡核苷酸片段不進行磷酸化，以防止基因本身在DNA重組時自身環(huán)化）。第112頁，共144頁?；瘜W合成的不足之處在于：（）要已知基因的核苷酸順序；

42、（）基因不能太大，這一方面是測定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因為每次僅能合成幾百的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；（）價格昂貴。 第113頁，共144頁?；虻幕瘜W合成及克隆圖解535353退火DNA連接酶退火DNA連接酶退火DNA連接酶退火T4DNA連接酶EcoRBamH合成的DNA全基因AmpTetEcoRBamH合成的基因轉(zhuǎn)化EcoRBamHAmpr TettAmpEcoRBamHAmpr Tett合成的基因第114頁，共144頁。2、基因的化學酶促合成特點：不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片斷，相鄰的3末端有一短的序

43、列互補，在適當?shù)臈l件下通過退火形成模板引物的復合體，然后在存在四種dNTP的條件下，用E.coli的DNA聚合酶大片段（klenow大片段）去填補互補片段之間的缺口，最后用T4DNA連接酶連接及適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體。第115頁，共144頁?；虻幕瘜W酶促合成圖解磷酸化退火DNA多聚酶Iklenow片段dNTP限制性內(nèi)切酶分子克隆5555第116頁，共144頁。1、PCR技術的發(fā)明PCR的發(fā)明是DNA操作技術的革命美國Mullis教授 開汽車時的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路DNA雙螺旋 行駛的汽車一小段DNA引物 1988年發(fā)明了PCR技術 1993年獲得諾貝爾獎四、利用PCR或RT-PC

44、R分離基因第117頁，共144頁。2、PCR原理根據(jù)已知的待擴增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補的兩段寡核苷酸引物，在體外有模板DNA和4種脫氧核糖核苷存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促作用擴增DNA。第118頁，共144頁。Mullis開車的時候, 瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA， 第119頁，共144頁。第120頁，共144頁。PCR 動畫1st cycle2nd cycle3rd cycle過 程變 性引 物 退 火DNA 復制第121頁，共144頁。1、反應體系具備的條件：要有與被分離的目的基因5和3

45、端序列互補的DNA 引物（約20個堿基左右）；具有熱穩(wěn)定性的酶，如Taq DNA聚合酶；dNTP；作為模板的DNA分子。 第122頁，共144頁。2、過程：變性：模板DNA置于95的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈；退火：將反應體系的溫度降至55左右，使得一對引物能分別與變性后的兩條模板鏈相配對；延伸：將反應體系溫度調(diào)整到Taq DNA聚合酶作用的最適溫度72，然后以目的基因為模板，合成新的DNA鏈。第123頁，共144頁。3、引物設計原則：3末端序列不能有明顯的互補性易造成引物間二聚體，導致非特異DNA片段的合成；避免引物分子內(nèi)序列互補導致引物分子內(nèi)雙鏈區(qū)或發(fā)夾環(huán)結構的形成，引物3端形

46、成的發(fā)夾環(huán)會引起引物內(nèi)延伸，而發(fā)生在近5端對PCR的影響不大；注意熔點溫度。注意引物內(nèi)穩(wěn)定性：5末端穩(wěn)定而其3末端不穩(wěn)定的引物是進行PCR合成的好引物。當利用哺乳動物類基因組序列作為PCR模板時，對所用的引物要檢查其同Alu序列或其它短的重復序列的互補性。第124頁，共144頁。4、逆轉(zhuǎn)錄PCR（retrotranscription PCR,RT-PCR）以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得與RNA互補的DNA鏈即cDNA,然后以cDNA鏈為模板進行的PCR反應。帽子AAAAA mRNA35TTTTT以其為模板進行PCR擴增逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA互補鏈并退火寡聚dT引物第125頁，共144頁。優(yōu)點：是檢測

47、RNA分子的良好方法，也是獲取測序用模板DNA的有效手段，同時還是克隆mRNA之cDNA的重要步驟RT-PCR具有很高的敏感性,可以用來分析不同組織或是相同組織不同發(fā)育階段中mRNA表達狀況的相關性可以用來研究低表達活性基因的mRNA生理變化動態(tài)第126頁，共144頁。判斷 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳中樣品條帶的強度比較，便能確定兩種PCR反應產(chǎn)物之間的數(shù)量關系前提條件 所測定的mRNA分子必須來自由一個或數(shù)個間隔子的基因第127頁，共144頁。5、錨定PCR特別適合預擴增那些只知道一段序列的目的DNA對于一端序列已知，一端序列未知的DNA片段，可以通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶給未知序列的那一端加上一段多聚d

48、G的尾巴，然后用多聚dC和已知序列作為引物進行PCR擴增第128頁，共144頁。53DNA序列GGGGG 353GGGGG5GGGGG 353GGGGG5錨定引物CCCCC（多聚dC引物）進行PCR擴增5GGGGG 3CCCCC加多聚dG尾巴加入引物已知序列擴出的未知序列第129頁，共144頁。6、反向PCR特別適合用于擴增已知序列兩端的未知序列方法：選擇一個在已知序列中沒有，而在其兩側(cè)都存在的限制性內(nèi)切酶位點，用相應的限制性內(nèi)切酶酶解后，將酶切的片段在連接酶的作用下環(huán)化，使得已知序列位于環(huán)狀分子上，根據(jù)已知序列的兩端序列設計兩個引物，以環(huán)狀分子為模板進行PCR，就可以擴增出已知序列兩側(cè)的未知序列。第130頁，共144頁。53LR酶切位點酶切位點LR已知序列限制性內(nèi)切酶酶解環(huán)化REabadcdc直接測序或克隆后再測序第131頁，共144頁。五、外源基因在宿主細胞中的高效表達有效的轉(zhuǎn)錄起始外源基因能否在宿主細胞中高效表達的關鍵步驟之一選擇強的可調(diào)控的啟動子及相關的調(diào)控序列在發(fā)酵的早期階段表達載體的啟動子被緊緊地阻礙，可避免出現(xiàn)表達載體不穩(wěn)定，細胞生長緩慢