1、 重組人胰島素的研究歷史 和生產(chǎn)工藝BY: 王騰 時(shí)佳 孫玉新 瑪依努爾 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2011年全球糖尿病患者2.8億，在中國(guó)，已突破9200萬人，發(fā)病率達(dá)10%，同時(shí)由于老齡化等因素，國(guó)內(nèi)還有9000多萬的潛在糖尿病患者。加之中國(guó)糖尿病患者整體治療率不足三成，且人均胰島素使用量偏低，僅為美國(guó)糖尿病患者人均使用量的0.8%，所以中國(guó)胰島素市場(chǎng)潛力巨大。 重組人胰島素 胰島素定義： 胰島素是由胰島細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。 胰島素結(jié)構(gòu)： 胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。A鏈有11種21個(gè)氨基酸，B鏈有15種30個(gè)氨基酸，共26種51個(gè)

2、氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個(gè)二硫鍵。 3D Structure of Insulin胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer ）Ins的性質(zhì) 胰島素的功能 穩(wěn)定性Ins在弱酸性水溶液中或混懸在中性緩沖液中較穩(wěn)定還原劑及多種重金屬使Ins失活 紫外線、光氧化、超聲波會(huì)引起Ins變性。 胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。藥理作用 治療糖尿病、消耗性疾病。1921年-從動(dòng)物胰

3、腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療的歷史。1926年-重結(jié)晶胰島素1930s-傳統(tǒng)中、長(zhǎng)效動(dòng)物胰島素1970s-單峰胰島素和 單組分胰島素 70年代末-半合成胰島素重組胰島素的研究歷史基因重組人胰島素研 制成功 基因重組人胰島素實(shí)驗(yàn)基因重組來源的胰島素（27種）藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)APIDRA SANOFI AVENTIS US LANTUS SANOFI AVENTIS US EXUBERA PFIZER LEVEMIR Novo Nordisk HUMALOG LILLY MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS HUMALOG MIX 50/50

4、LILLY NOVOLIN 70/30 Novo NordiskHUMALOG MIX 75/25 LILLY NOVOLIN L NOVO NORDISK INC HUMALOG PEN LILLYNOVOLIN N NOVO NORDISK INC HUMULIN 50/50 LILLY NOVOLIN R NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 LILLY NOVOLIN R（Purified）NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 PEN LILLYNOVOLOG NOVO NORDISK INC HUMULIN BR LILLYNOVOLO

5、G MIX 70/30 NOVO NORDISK INC HUMULIN L LILLYVELOSULIN BR NOVO NORDISK INC HUMULIN N LILLYVELOSULIN BR HUMANNOVO NORDISK INC HUMULIN R LILLYHUMULIN U LILLYHUMULIN R PEN LILLY胰島素給藥方式的發(fā)展注射給藥非注射給藥一種新的注射給藥方式:NIS泵 通過一條與人體相連的軟管向體內(nèi)持續(xù)輸注胰島素的裝置。它模擬人體健康胰腺分泌胰島素的生理模式。俗稱“人工胰腺”。 維持血液中INS水平 縮短控制高血糖的時(shí)間 減少低血糖發(fā)生， 減輕病人多

6、次皮下注射INS的痛苦 INS泵是強(qiáng)化治療的最佳手段非注射給藥口服給藥：由于采用了包裹的方法來保護(hù)胰島素制劑，口胰島素在胃及小腸內(nèi)不被破壞，在大腸內(nèi)分解、釋放出來，通過腸黏膜進(jìn)行吸收。肺部給藥：巨大的肺泡表面積、極薄的肺泡、豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)、狹小的氣血通路、低酶活性、肺深處較慢的清除速率等，這些良好的生理環(huán)境為蛋白多肽的吸收提供了有利條件。眼部給藥：INS主要通過眼結(jié)膜和鼻淚管黏膜吸收進(jìn)入體循環(huán)兩達(dá)到降糖效果。一般眼內(nèi)容量少，INS作用時(shí)間短，生物利用度低因此人們致力于研究能延長(zhǎng)INS作用時(shí)間的滴眼劑，并選擇刺激性小的滴眼劑。鼻腔給藥黏膜內(nèi)血管豐富黏膜上蛋白酶含量也比胃腸道中少，減少了INS被

7、酶破壞失活。提高了藥物的生物利用度。許多藥物動(dòng)力學(xué)研究表明，鼻黏膜吸收INS的機(jī)制與體內(nèi)內(nèi)源性的INS釋放極為相似，為鼻腔INS給藥提供了理論依據(jù)。鼻腔給藥需要加入吸收促進(jìn)劑才能增加吸收效果口服給藥、局部給藥 人胰島素分類傳統(tǒng)中長(zhǎng)效胰島素 長(zhǎng)效人胰島素類似物速效人胰島素類似物非注射胰島素 Lispro （賴脯胰島素 ，Humalog ）是第一個(gè)用于臨床的速效胰島素類似物,由美國(guó)禮來公司研制生產(chǎn)，將人胰島素的B28與B29位的氨基酸對(duì)換。 Aspart（門冬胰島素，Novolog ）由丹麥諾和諾德公司研制生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)與人胰島素的區(qū)別在于用天冬氨酸取代了B鏈28位上的脯氨酸。APIDRA （賴谷胰島

8、素，Apidra ）安萬特公司研制，以賴氨酸和谷氨酸分別取代了人胰島素B3位的天冬氨酸和B29位的賴氨酸。長(zhǎng)效胰島素-人胰島素類似物1. 甘精胰島素（ glargine ）： 商品名Lantus-甘氨酸替代胰島素A鏈21位門冬氨酸、并在B鏈末端增加兩個(gè)精氨酸。使胰島素結(jié)合更多帶正電的氨基酸殘基，改變等電點(diǎn)，使等電點(diǎn)由5.4上升至中性。這樣，胰島素類似物在酸性條件下可溶，在生理的近中性條件下結(jié)晶。2. Insulin Detemir：商品名Levemir -胰島素B鏈29位賴氨酸側(cè)鏈通過?；B接一個(gè)N-16-烷基 酸的14碳游離脂肪酸該游離脂肪酸能與白蛋白結(jié)合，延緩與胰島素受體結(jié)合，從而延長(zhǎng)其

9、半衰期。 胰島素肺部吸入制劑-Exubera輝瑞、萬安特以及Nektar 共同研發(fā)于2006.1.27被FDA批準(zhǔn)一種作用快的胰島素干粉吸入劑適用于餐前給藥，其胰島素吸收具有速效化的特征胰島素制備工藝 以動(dòng)物胰臟為原料提取胰島素 -酸醇提取法 半合成胰島素-以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素 AB鏈合成：分別表達(dá)AB鏈，化學(xué)方法連接 逆轉(zhuǎn)錄法：表達(dá)胰島素原，酶切得到重組人胰島素Ins A鏈Ins B鏈轉(zhuǎn)化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素質(zhì)粒Ins mRNA反轉(zhuǎn)錄Ins cDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切 提取質(zhì)粒限

10、制性內(nèi)切酶酶切 反轉(zhuǎn)錄酶法合成人胰島素 離子換，分子篩色譜，反相色譜結(jié)晶CNBr裂解，去除保戶多肽發(fā)酵胰島素原融合蛋白胰島素原（ SSO3 ）粗品亞硫基化胰島素原純化胰島素原純品酶切解離A,B鏈胰島素粗品純化的人胰島素基因重組大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素工藝流程破碎菌體 包涵體 尿素溶解 復(fù)性酵母系統(tǒng)生產(chǎn)重組胰島素優(yōu)點(diǎn)：二硫鍵的結(jié)構(gòu)與位置正確，不需要復(fù)性加工處理缺點(diǎn)：表達(dá)低，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)基因組成：信號(hào)肽、前肽序列、MCS 和微小胰島素原。 前肽序列引導(dǎo)目的蛋白通過正確的分泌途徑至胞外。宿主：貝克酵母。分泌量大，形成二硫鍵，培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，高密度發(fā)酵，無熱原和有毒物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素設(shè)備重組胰島素的質(zhì)量控制測(cè)定生物活性效價(jià)測(cè)定控制產(chǎn)品中雜質(zhì)或潛在有害物質(zhì)保證產(chǎn)品安全性和有效性長(zhǎng)期重復(fù)大劑量使用通化東寶 1998年12月研制出中國(guó)第一支基因重組胰島素“甘舒霖” 甘舒霖 R- 常規(guī)重組人胰島素注射液 甘舒霖 N- 低精蛋白重組人胰島素注射液 甘舒霖 30R- 30/70混合重組人胰島素注射液 （ 30%常規(guī)重