1、關于流式細胞術課件課件課件第一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 流式細胞術概述第二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月流式細胞術流式細胞術（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性的技術，同時可以對特定群體加以分選第三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。 細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞術的特點第四張，PP

2、T共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月流式細胞儀 流式細胞儀 是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學性質（如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術。第五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月BD LSR第六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月通過流式細胞儀我們可以得到以下信息 - 相對細胞大小 - 相對細胞顆粒密度和內部復雜度 - 染色過細胞的相對熒光強度第七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞組成細胞功能大小細胞表面/胞漿/核-特異性抗原粒度細胞活性DNA,

3、RNA含量胞內細胞因子蛋白質含量激素結合位點鈣離子, PH值, 膜電位酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性第八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基礎研究 淋巴細胞功能、樹突狀細胞（DC）研究、造血干細胞研究、細胞周期分析、細胞凋亡分析、凋亡相關蛋白分析、細胞功能研究、多藥耐藥基因研究（MDR）、腫瘤相關基因表達研究、RNA測定、DNA測定、總蛋白測定、癌基因和抑癌基因表達產物測定、血管內皮細胞研究第九張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月臨床研究 淋巴細胞亞群測定、血小板分析、網織紅細胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH診斷、人類同種異體器官移植中應用、細

4、胞因子測定、AIDS診斷與治療和療效評價、flow-FISH法測定端粒長度第十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié)流式細胞儀工作原理第十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。 一、工作原理 第十二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基本工作原理第十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化

5、管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過程第十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月區(qū)別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡物鏡、光學放大統(tǒng)計計算機，5000人工，200結果多參數，綜合分析簡單，單參數流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別第十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月現代流式細胞儀包括液流系統(tǒng) 聚焦細胞以供檢測光學系統(tǒng) 激發(fā)和收集光信號 電子系統(tǒng) 將光信號轉化為電信

6、號，并使其數字化以供計算機分析細胞分選系統(tǒng) 第十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色 受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。1. 液流系統(tǒng)第十七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)將樣本懸液聚焦在光源的中心處第十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月噴嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液液流系統(tǒng)示意圖第十九張，

7、PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管第二十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）2. 光學系統(tǒng)第二十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector光學系統(tǒng)示意圖第二十二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 （

8、1）激光光源單波長、高強度、高穩(wěn)定性多采用氬離子激光器或氦氖激光器一般選配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光最多檢測13個熒光參數 第二十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Optical Filters460 500 540460 500 540460 500 540SP 500LP 500BP500/50LongpassShortpassBandpass第二十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 光收集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）第二十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年

9、6月流式細胞儀的光信號散射光信號熒光信號第二十七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 散射光信號前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信號細胞相對大小及其表面積。 側向角散射（SSC, Side Scatter）入射激光90角的散射光信號細胞粒度及細胞內相對復雜性。第二十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月前向角散射光 FSCForward Angle Light ScatterFALS SensorLaser第二十九張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月側向角散射光SSCSide ScatterFALS Sensor90

10、LS SensorLaser第三十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月散射光散射光能被用來區(qū)分不同細胞群體的基本形態(tài)上的差異 -通常使用“散點圖”來看散射光信號 -散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒的數據第三十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月散點圖Dot Plotlysed whole blood第三十二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。 此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒

11、別出某些亞群 第三十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數放大器（3）熒光測量第三十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光信號熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉換為振動能和熱能釋放較入射光波長更長的光量子熒光素與特異抗體結合熒光抗體與細胞抗原結合越多，產生的熒光信號越強第三十五張，P

12、PT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月雙色熒光散點圖第三十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光檢測器FluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)第三十七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光補償第三十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月光譜交叉Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection兩色以上熒光分析存在 光譜交叉第三十九

13、張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光補償方法所有補償調為“0”調節(jié)電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角”依單陽群體調節(jié)熒光補償第四十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月調與未調補償FL1FL2第四十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月注意！用來調節(jié)補償的FITC、PE抗體必須有明顯的陽性信號，否則就不會出現熒光滲漏現像，調節(jié)補償也無從入手。在正式數據采集前要調整好補償，一旦數據被獲取，BD、Coulter儀器無法再改變補償partec流式細胞儀提供軟件調節(jié)補償技術，無論何時都可重新調節(jié)多色熒光補償調節(jié)方法同雙色法第四十二張，PPT共一百二十五頁，

14、創(chuàng)作于2022年6月主要由計算機及其軟件組成3. 電子系統(tǒng)第四十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 細胞分選系統(tǒng)第四十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第四十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié)流式細胞術數據顯示第四十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月單參數直方圖雙參數直方圖:

15、點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數直方圖多參數分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置數據顯示方式第四十七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少 參 數第四十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。（一）單參數直方圖第四十九張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月單參數直方圖細胞相對數量信道(channel )X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數”表示，可以與光強度

16、之間線性關系或對數關系Y軸：代表該通道內所出現具有相同光信號特征性細胞的頻率第五十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。（二）雙參數直方圖第五十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度便于數據統(tǒng)計不同的細胞群可以用不同的顏色標記主要表達方式第五十二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 二維等高

17、圖由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線) 所代表的細胞數愈多。等高線越密集則表示細胞數變化率越大。第五十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二維等高圖第五十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 假三維等高圖第五十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三參數直方圖第五十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數分析第五十七張，PPT

18、共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月數據分析設門設定陰性與陽性群體的界限確定陽性與陰性細胞群體統(tǒng)計陽性或陰性細胞群體的百分率，平均熒光值，絕對數或抗體結合數第五十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 三、設門分析技術第五十九張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月A 淋巴細胞B 單核細胞C 中性粒細胞A、B、C均為任意門第六十張，PPT共一百二十五

19、頁，創(chuàng)作于2022年6月線性門第六十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 Region設置: 區(qū)閾（region, R）與門(gate, G ) 是兩個相關的概念，區(qū)閾可與門對應，但是也可以包含于門。第六十二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構成，即G=D1+D2+D3+D4。 第六十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié)流式細胞樣品制備第六十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月標本來源：外周血、骨髓、組織塊、

20、培養(yǎng)細胞、脫落細胞及其他實驗的不同，選用不同的抗凝劑。EDTA： 2mg/ml枸椽酸鈉：0.38%肝素：15IU/ml可選的抗凝劑有：第六十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月標本處理時間：新鮮樣本分析時，樣本采集后應立即分析樣本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分鐘。注：不同的實驗，所用的固定方法不完全相同。第六十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月樣本處理標準試劑：一、10%Bovine Serum Albumin BSA1. 溶解10g BSA至100ml蒸餾水中2. 4C，20000 g離心30分鐘3. 分裝后-20C保存第六十七張，PPT共一百二

21、十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、0.1% BSA-PBS緩沖液 1. 準備500ml，PH7.3 PBS2. 加入5ml 10% BSA3. 使用0.45um濾網過濾三、氯化銨溶血劑 1. 在一升蒸餾水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 調節(jié)PH值至7.23. 在使用前配置該溶血劑，并用0.45um濾膜過濾第六十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月方法一：溶血法取100 ul抗凝全血；2. 快速加入 2ml NH4CL溶血劑,混勻；3. 室溫孵育5分鐘；4. 4C，400g離心10分鐘。去上清，加入2ml BSA-PBS；5. 4C，40

22、0g離心10分鐘。去上清，加入2ml BSA-PBS；6. 4C，400g離心10分鐘。去上清，調整細胞濃度至5x106/ml。收集白細胞第六十九張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月方法二：密度離心法提取單個核細胞 Histopaque 1077為Ficoll與Sodium diatrizoate(泛影酸鈉)混合物，其密度為1.1191.077。通過離心可將全血中的粒細胞與單個核細胞分離。粒細胞沉積于1.1191.077的血漿層，而單個核細胞則在1.077以下的血漿層中。第七十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 1. 準備2ml抗凝血（根據實驗要求確定用血量）， 等量PB

23、S稀釋；2. 準備1ml Histopaque 1077 (Sigma)；3. 室溫下700g離心30分鐘；4. 仔細將含有單個核細胞血漿層吸出；5. 加4ml BSA-PBS，400g離心10分鐘；6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。操 作第七十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 淋巴節(jié)、扁桃體、脾、胸腺等淋巴組織由于結構松散，容易分離成單個細胞。一般對樣本進行切剪、研磨、過濾便可。從組織獲取淋巴細胞將樣本置于陪替氏培養(yǎng)皿，加入15ml BSA-PBS；將樣本切成3-4mm3大小，用鑷子將其分離；將樣本經濾網過濾，用密度法分離、提純淋巴細胞。方 法：第七十二張，PPT共一百

24、二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月其他標本：通常在其他組織中分離淋巴細胞需用酶進行消化。對于不同標本，處理方法也各不相同。第七十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）第七十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體染色一般方法外周血白細胞分析：100ul全血血小板分析：15ul全血（根據樣本血小板數量）紅細胞分析：1ul全血（根據樣本中紅細胞數稀釋后使用）骨髓：100ul其他樣本，計數后決定使用體積目標細胞數量及檢測終濃度：1106/ml第七十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月

25、細胞計數方法傳統(tǒng)手工計數：耗時、準確度差流式細胞儀計數：BD，Coulter儀器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec儀器:最為精密的細胞計數器，直接報告細胞濃度第七十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月反應體積樣本中加完抗體后， 1106細胞反應體積應 不小于100ul。第七十七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月上機檢測樣本染色及溶血過程處理完后應立即上機檢測打開流式細胞儀：預熱及進行質控程序選擇相應的方案或新建方案加載或重新調節(jié)各參數上樣檢測第七十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié)流式細胞熒光標記第七十九張，PPT共一

26、百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇合適的熒光染料必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內熒光素光譜的重疊應當盡量減少第八十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體使用原則根據儀器型號和抗原表達強弱合理選擇熒光抗體低表達抗原標記高S/N（信噪比）熒光素，如PE、APC使用雙標以上抗體必做熒光補償第八十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類幾種常見的熒光染料第八十二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)

27、作于2022年6月名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠 525易敏感易溶于水，與抗體結合不影響特異性得州紅Texas red568紅 615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯后量子產額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數和量子產額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料第八十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產生熒

28、光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料第八十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制第八十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光染料與細胞成分的四種結合方式結構親和式嵌入結合共價鍵結合熒光標記抗體特異性結合免疫熒光標記方法直標:干擾少,但需購買多種單抗間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體組合標記（二）免疫熒光標記第八十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠

29、微球混合后再加入待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結合，經激光照射后不同待測特產生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱 。三、免疫膠乳顆粒技術的應用第八十七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）第八十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十九張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現FCM對可溶性物質的定量分析第九十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié)流式細胞術質

30、量控制第九十一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月適當的制備方式處理紅細胞實體組織來源標本用機械法溫度2537，pH7.07.2（一）單細胞懸液制備的質控第九十二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月溫度pH染料濃度固定劑（二）免疫熒光染色的質控第九十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月光路與流路校正: 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準: 保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。絕對計數校準: 保證計數的準確性。Flow-checkFlow-setFlow-count（三）儀器操作的質控第九十四張，PPT共一百二十五頁

31、，創(chuàng)作于2022年6月同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的未標記單抗作為對照調整和設置電壓，以保證特異性。全程質量控制：與待測標本一起標記和檢測，結果達靶值，提示本次實驗結果可靠。（四）免疫檢測的質控第九十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月關于同型對照例：一個雙色染色的實驗 抗體A FITC，抗體B PE 對應的同型對照是IgG1 FITC,IgG1 PE那么需要準備的是陰性對照：細胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE單陽性對照： FITC: 細胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 細胞加上Ab B PE, IgG1 FITC第九十六張，PPT共

32、一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié)凋亡細胞的檢測第九十七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 Apoptotic Cell Death - a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis第九十八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death細胞散射光 在細胞調亡中，細胞收縮，從而FSC下降，SSC上升或是沒有明顯

33、變化第九十九張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death熒光吸收細胞的胞膜對于DNA染料的通透性和細胞的活性、死亡和凋亡相關，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用來區(qū)分活細胞、死細胞和凋亡細胞第一百零一張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell deathFCM of Caspases通過抗體和活化的caspase-3片斷相結合來檢測 使用特異性的caspase-3熒光底物新的抗原決定

34、基CK18第一百零二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death線粒體功能的變化 TMP會在調亡中產生，可以通過一些標記用流式細胞儀檢測。使用有膜穿透性的親脂性陽離子熒光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos等，可作為流式檢測的探針。 當細胞發(fā)生調亡時，一個線粒體膜表面蛋白7A6抗原會出現Bcl-2/bax family of proteins. 第一百零四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作

35、于2022年6月第一百零六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death鈣離子流和 pH值變化 胞漿內Ca2+ 水平的上升和由于細胞內環(huán)境酸化造成的選擇性的pH值的調節(jié)降低是伴隨著細胞凋亡產生的后果之一。使用Ca2+ 選擇性熒光探針，如 Quin-2, Fluo-3, Indo-1 通過流式檢測是測定細胞內Ca2+濃度的最佳方案酸化的檢測同樣可以用對pH敏感的熒光探針，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等進行檢測 第一百零七張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow

36、 cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution第一百零八張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零九張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell deathDNA 鏈的斷裂細胞凋亡晚期中，核酸內切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。 斷裂的末端可以通過末端轉脫氧核苷酰酶(TdT)連接上dUTP。第一百一十張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十一張，PPT

37、共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十二張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十三張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow cytometry of apoptotic cell death細胞DNA含量 在凋亡細胞中，用PI染色，通過流式檢測DNA含量，可以發(fā)現一種亞群的細胞，其染色熒光強度下降。這是由于隨著調亡的進行，核酸內切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細胞內DNA含量下降造成的。第一百一十四張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Flow Cytometry of Apoptotic CellsPI - Fluorescence# EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells第一百一十五張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 第八節(jié)流式細胞術在不同領域的應用第一百一十六張，PPT共一百二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標記分析，可區(qū)別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。 一、