1、宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第1頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三1.宏基因組概述2.環(huán)境宏基因組學(xué)基本技術(shù)3.環(huán)境宏基因組學(xué)技術(shù)的主要瓶頸第2頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三1.宏基因組概述1.1.微生物資源開發(fā)應(yīng)用的新途徑據(jù)估計每克土壤樣品中可含有高達(dá)4,000種的不同微生物，1g土壤就包含6. 1107個基因。傳統(tǒng)途徑培養(yǎng)途徑 開發(fā)環(huán)境微生物基因資源較為傳統(tǒng)的研究途徑是:分離微生物,獲得純培養(yǎng),基因表達(dá)產(chǎn)物活性檢測、活性物質(zhì)的分離純化直至開發(fā)利用。這一途徑被證明是十分有效的,也獲得了諸多有應(yīng)用價值的活性物質(zhì)。但是,環(huán)境中僅有0. 1% 1%的

2、微生物能夠采用現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng),在今天采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法已很難發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì),極大地限制了未培養(yǎng)微生物基因資源的開發(fā)利用。第3頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三新途徑宏基因組途徑 近年來發(fā)展起來的宏基因組克隆技術(shù),直接提取環(huán)境樣品核酸進(jìn)行遺傳操作,避開了微生物分離培養(yǎng)問題,極大地擴(kuò)展了微生物資源的利用空間。已在土壤生態(tài)環(huán)境、海洋生態(tài)環(huán)境和各種極端環(huán)境中開展應(yīng)用。 第4頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三第5頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三1.2.宏基因組定義“1998年Handelsman等首次提出宏基因組的概念。一種以

3、環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象,以功能基因篩選和測序分析為研究手段,以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系、及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。第6頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三宏基因組文庫既包括了可培養(yǎng)的,又包括了未培養(yǎng)的微生物遺傳信息,因此增加了獲得新生物活性物質(zhì)的機(jī)會。采用構(gòu)建宏基因組文庫的策略篩選新的基因資源及其表達(dá)活性產(chǎn)物的一般流程可以歸納為:樣品和基因(組)的富集;提取特定環(huán)境中的基因組DNA或mRNA;構(gòu)建宏基因組DNA或cDNA文庫;篩選目的基因;目的基因活性產(chǎn)物表達(dá)。第7頁，共34頁，2022年，5月20日，

4、0點32分，星期三 圖2第8頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三第9頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三2.環(huán)境宏基因組學(xué)基本技術(shù)環(huán)境宏基因組學(xué)研究的基本思路是直接提取環(huán)境中所有微生物的基因組DNA,克隆到合適的載體,通過構(gòu)建宏基因組文庫,將環(huán)境中全部微生物的核酸信息收集在一起,運(yùn)用序列篩選或功能篩選方式從文庫中獲得有用的酶、抗生素等生物活性物質(zhì)及相關(guān)基因。其前端關(guān)鍵性技術(shù)是環(huán)境DNA(environmental DNA,eDNA)的提取,eDNA提取方法的精確程度將直接決定文庫中微生物信息的精確度;下游關(guān)鍵性技術(shù)是文庫的分析與篩選技術(shù)。第10頁，共34

5、頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三2.1環(huán)境樣品及目的基因組富集在宏基因組文庫篩選過程中目的基因僅占總DNA的一小部分,對環(huán)境樣品的預(yù)富集可以大大提高目的基因的檢出幾率。目前預(yù)富集技術(shù)主要分為細(xì)胞水平富集和基因組水平富集。第11頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三細(xì)胞水平富集主要是通過利用選擇培養(yǎng)基對目的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng),最常用的方法是底物選擇,此外還包括營養(yǎng)選擇及物理化學(xué)指標(biāo)選擇。但是由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長特性的菌群,因此導(dǎo)致大部分物種多樣性信息丟失。目前可以通過先在嚴(yán)格脅迫條件下短期處理,然后改為較溫和的處理條件,可以從一定程度上克服這種方

6、法的局限性。第12頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三基因組水平富集常用的技術(shù)為穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP),原理是采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記底物,其中的“重”原子摻入到具有代謝活性的微生物核酸中,采用密度梯度離心的方法將“重”的DNA與“輕”組分分離,被標(biāo)記的“重”核酸可以作為PCR的模板,用來構(gòu)建宏基因組文庫。此外,還有報道利用抑制性消減雜交技術(shù)、差異顯示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、親和捕獲技術(shù)及DNA微陣技術(shù)等技術(shù)來富集目的基因。第13頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三2.2.環(huán)境宏基因組文庫篩選技術(shù)環(huán)境宏基因組文庫的篩選策略主要分為序列篩選和功能篩選2種。序

7、列篩選策略是先從文庫中獲得目的基因,繼而對之異源表達(dá),得到具有生物活性的產(chǎn)物;功能篩選策略則是先獲得具有生物活性的陽性克隆子,再通過插入片段測序,得到相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)。2種分析策略對于充分利用宏基因文庫資源都是必要的。第14頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三2.3宏基因組DNA的提取獲得高濃度、大片段、無偏好的環(huán)境樣品總DNA是宏基因組文庫構(gòu)建的難點之一。第15頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三近年已有多種宏基因組DNA的提取純化方法陸續(xù)建立起來,大體可分為兩類:一類是直接提取法,又稱原位提取法。這類方法不經(jīng)過樣品中微生物的培養(yǎng)和分離,通過化學(xué)法、酶解

8、法或物理法直接破碎環(huán)境中的微生物細(xì)胞而使DNA得以釋放,并對DNA進(jìn)行純化。該法操作簡便、省時、成本低,所獲得DNA具有較好的完整性,并能夠代表某一生境的微生物群落多樣性。但常會出現(xiàn)細(xì)胞裂解不完全或DNA與土壤雜質(zhì)成分產(chǎn)生共沉淀而無法有效地去除等問題,所以一般需要進(jìn)一步的DNA純化處理,同時所提取獲得的DNA片段較小(1kb50kb),主要適用于小片段文庫的構(gòu)建。第16頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三另一類是間接提取法,即異位提取法,是利用離心介質(zhì)或者梯度離心等方法先把微生物從環(huán)境樣品中分離出來,再按處理純培養(yǎng)細(xì)胞的方法裂解微生物細(xì)胞提取DNA。該法獲得的宏基因組DNA

9、受到胞外雜質(zhì)污染干擾較少,純度較高、DNA完整性好(20kb500kb),適合構(gòu)建大片段的宏基因組文庫。但該法操作較繁瑣、費時、成本高、偏差大、DNA得率較低,其產(chǎn)率只是直接裂解法的1%10%,且獲得的DNA往往不能完全代表樣品所在生境的生態(tài)學(xué)多樣性。第17頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三2.4宏基因組文庫的構(gòu)建載體的選擇載體選擇在宏基因組技術(shù)中占有十分重要的地位。載體系統(tǒng)的選擇主要依賴于DNA提取質(zhì)量、插入片段、質(zhì)粒拷貝數(shù)、宿主菌及篩選方法。根據(jù)克隆載體的不同宏基因組文庫可分為質(zhì)粒文庫、細(xì)菌/酵母人工染色體文庫、噬菌體類載體文庫。第18頁，共34頁，2022年，5月2

10、0日，0點32分，星期三早期宏基因組文庫主要以質(zhì)粒載體和大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建而成的小片段(15kb)文庫。該文庫操作簡便、拷貝數(shù)高、對DNA質(zhì)量要求不高,適合純度低或剪切較嚴(yán)重的DNA模版。但插入片段小,篩選量大,活性比率低,對大基因簇?zé)o能為力,主要適用于分析新的基因序列信息及篩選編碼代謝相關(guān)的單一基因或小操縱子。然而,很多微生物活性物質(zhì)是其次生代謝產(chǎn)物,代謝途徑由多基因簇調(diào)控,因此盡量插入大片段DNA以獲得完整的代謝途徑多基因簇是很有必要的。第19頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三目前多采用細(xì)菌人工染色體(BAC)和粘粒(Cosmid)載體,前者插入片段大(可達(dá)350k

11、b),但克隆效率低,后者插入片段中等(2040kb),克隆效率高。BAC和Cosmid載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性高,但拷貝數(shù)低,宏基因的擴(kuò)增困難,表達(dá)量低。Fosmid載體的插入片段與Cosmid相當(dāng),但Fosmid插入片段在E. coli中的克隆效率和穩(wěn)定性更高。外源基因的表達(dá)受宿主細(xì)胞的遺傳類型、細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞的生理狀態(tài)及初級代謝產(chǎn)物等的影響,利用穿梭載體擴(kuò)大宿主范圍有利于促使和提高外源基因的表達(dá)。為提高和調(diào)控外源基因的拷貝數(shù)與表達(dá)量,常需構(gòu)建不同類型的載體。第20頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三此外,-噬菌體和其他病毒也可以作為構(gòu)建宏基因組克隆文庫的載體。噬菌體展示

12、庫是一種十分有效的高通量篩選技術(shù),該技術(shù)通過對表面展示表達(dá)產(chǎn)物的親和選擇分離相應(yīng)的DNA序列,能夠從宏基因組中富集稀有DNA序列,但其局限性在于只能表達(dá)分子量小于50 kD的蛋白。第21頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三宿主細(xì)胞的選擇宿主菌株的選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性、宏基因的表達(dá)、目標(biāo)性狀(如抗菌)缺陷型等因素。研究經(jīng)驗表明不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型有明顯差異,不同的研究目標(biāo)應(yīng)選擇不同的宿主菌株,如70%的抗生素來源于放線菌,如以尋找抗菌抗腫瘤活性物質(zhì)為目標(biāo),選擇鏈霉菌為宿主較理想,而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。第22頁，共34頁，2

13、022年，5月20日，0點32分，星期三其中E.coli是最常用的宿主細(xì)胞,其優(yōu)點是操作簡單、繁殖迅速、培養(yǎng)代謝易于控制。但是由于環(huán)境樣品的總DNA有很大一部分為真核基因組DNA,其在細(xì)菌宿主中往往不能表達(dá),大大限制了這部分基因的篩選。最近的生物信息學(xué)研究表明,對于一個插入子(100 kbp土壤eDNA的提取技術(shù)尚未突破,運(yùn)用原位裂解法構(gòu)建更大片段環(huán)境宏基因組文庫(現(xiàn)有的土壤宏基因組文庫中,平均插入片段最大為44.5 kbp)仍是一個難點。第31頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三從DNA所包含信息的廣泛度分析,eDNA提取技術(shù)已經(jīng)具備區(qū)別提取樣品中微生物胞外與胞內(nèi)DNA、活細(xì)胞與死細(xì)胞DNA的能力,然而,運(yùn)用現(xiàn)有DNA提取技術(shù)到底能回收環(huán)境中多少類型微生物的核酸信息仍不清楚。第32頁，共34頁，2022年，5月20日，0點32分，星期三不可避免地,環(huán)境宏基因組文庫所包含微生物基因組信息的偏差將直接導(dǎo)致“基因遺漏”現(xiàn)象發(fā)生。如海洋中普遍存在的微生物固氮基因,卻在測序量高達(dá)1.6Gbp的馬尾藻海水宏基因組文庫中被遺漏,表明僅僅運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)同樣會忽略部分的微生物資源。第33頁，共34頁，2022年，5月20日，0點