1、植物DNA 分子標記植物DNA 分子標記 分子標記的概念廣義的分子標記（molecular marker）：可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白。包括蛋白質(zhì)標記和DNA標記（狹義的分子標記）。蛋白質(zhì)標記包括動植物蛋白、同工酶及 等位酶 分子標記的概念理想的分子標記： 1.高多態(tài)性 2.共顯性遺傳 * 3.能明確辨別等位基因 4.遍布整個基因組 5.無基因多效性 * 6.檢測手段簡單快速 7.成本低廉 8.重復性好* 雜合子的一對等位基因各自都具有自己的表型效應，稱為共顯性（codominance）* 基因多效性（gene pleiotropism）：一個基因產(chǎn)生多種表型效應的現(xiàn)象。 理想的分子標

2、記： DNA分子標記（DNA molecular marker）直接在DNA分子水平上檢測生物間的差異，是DNA水平上遺傳變異的直接反應。 隨著分子生物學技術的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標記技術已有數(shù)十種，廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。 DNA分子標記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，分為非PCR依賴的分子標記(基于Southern 雜交技術的分子標記)和PCR依賴的分子標記。植物DNA分子標記課件非PCR依賴的分子標記(基于Southern 雜交技術的分子標記)包括：限制性片段長度多態(tài)性標記 （restriction fragment length

3、 polymorphism, RFLP）原位雜交（in situ hybridization）非PCR依賴的分子標記PCR依賴的分子標記：隨機擴增多態(tài)性DNA標記 （random amplification polymorphism DNA, RAPD）DNA擴增指紋印記 （DNA amplification fingerprinting, DAF）簡單序列重復標記（simple sequence repeat, SSR）隨機引物聚合酶鏈式反應 （arbitrarily primed PCR, AP-PCR）擴增片段長度多態(tài)性標記 （amplified fragment length poly

4、morphism, AFLP）PCR依賴的分子標記：基于分子雜交技術的分子標記技術此類標記技術是利用限制性內(nèi)切酶解及凝膠電泳分離不同的生物 DNA 分子，然后用經(jīng)標記的特異 DNA 探針與之進行雜交，通過放射自顯影或非同位素顯色技術來揭示 DNA 的多態(tài)性。分子雜交：由具有互補堿基順序的任何兩條單鏈核酸分子片斷形成雙鏈的過程。基于分子雜交技術的分子標記技術染色體原位雜交是指DNA探針與染色體上的DNA雜交，并在染色體上直接進行檢測的分子技術，其原理是兩條核苷酸單鏈片斷在適宜的條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA雙鍵分子，用帶有標記的DNA或者RNA片斷作為核

5、酸探針，與細胞內(nèi)染色體雜交，用放射自顯影等方法予以顯示，在熒光顯微鏡下觀察目的mRNA或者DNA的存在與定位。染色體原位雜交In situ hybridization For in situ hybridization, a tissue sample is incubated with a labeled nucleic acid probe, excess probe is washed away and the location of hybridized probe is examined. The technique enables the spatial localization

6、of gene expression to be determined as well as the location of individual genes on chromosomes. In situ hybridization植物DNA分子標記課件bcdaFig. 5 GISH images of chromosomes of tetraploid and diploid Festulolium progenies. The DNA of L. perenne was used as probe, and shown as blue color. The chromosomes of

7、F. pratensis were shown as pale blue color. Translocation breakpoints are indicated in a and c by arrows. (a) Bx350-184, a 28-chromosome genome with at least 14 intergeneric translocations, some of which have two breakpoints in an arm (arrows). Bar: 10 m. (b) Bx351-160, a 28-chromosome genome with i

8、ntergeneric translocations. Bar: 20 m. (c) Bx350-177 with fertile pollen, a 28-chromosome genome comprising approximately equal amount of Lolium and Festuca DNA with 9 intergeneric translocations, some of which have two breakpoints in an arm (arrows). Bar: 20 m. (d) Prior-57, a 14-chromosome genome

9、with intergeneric translocations. Bar: 10 m.Guo et al. 2005 bcdaGuo et al. 2005 RFLP標記：限制性片段長度多態(tài)性RFLP指應用特定的核酸內(nèi)切酶切割有關的DNA分子所產(chǎn)生的DNA片段在長度上的變化。包括基因組DNA限制性酶切，Southern印記，DNA探針制備，同位素/非同位素標記，DNA分子雜交等步驟。RFLP標記：限制性片段長度多態(tài)性 生物能快速、精確地復制自身的DNA，但這種精確性是相對的。實際上，在植物的自然群體中存在大量的DNA序列變異。如：堿基對的代換、缺失等。幾乎不可能有兩個生物體DNA的堿基序列是

10、相同的。 限制性內(nèi)切酶酶解DNA長鏈，是識別DNA上的特異的位點并在這些位點上切斷的過程。酶識別位點堿基對越少，DNA分子中被識別的位點越多，所產(chǎn)生的限制片段越短。 來自一個完整的純合子的個體的每一種同源DNA分子，都會在同樣的位點被準確切割。但是在不同物種、不同品種、甚至同一品種的不同的兩個個體之間，DNA會發(fā)生變異，其中有些變異導致了限制性酶切位點的更動，從而產(chǎn)生了限制片段長度的多態(tài)性。 來自一個完整的純合子的個體的每一種同源DNA分子，都會 用限制性酶來酶解植物核DNA會產(chǎn)生數(shù)萬個片段，其大小變化是連續(xù)的，如進行電泳分離，只能看到彌散狀的連成一片的電泳結果。然而，各限制片段在凝膠中還是分

11、開的，但不能分辨。 進行Southern印跡轉(zhuǎn)移操作，用特定的探針與濾膜上的DNA雜交，經(jīng)過放射自顯影就能檢測到高等植物核DNA的RFLP。 用限制性酶來酶解植物核DNA會產(chǎn)生數(shù)萬個片段，其大小變0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb(1)0.3kb0.4kb0.5kb(2)0.2kb0.3kb0.5kb品系1 品系20.4kb0.1kb+0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb(1)0.3kb0.RFLP標記方法與步驟（1）DNA的分離：可用CTAB法或SDS法（2）酶切：一般根據(jù)基因組總DNA的復雜性選 用限制酶。（3）瓊脂糖凝膠電泳（4）Southern印跡轉(zhuǎn)移（5）DNA雜交及放射自

12、顯影RFLP標記方法與步驟RFLP標記優(yōu)點 （1）不受性別、年齡局限，不會受表達的組 織、發(fā)育階段或外界環(huán)境的不同而受影 （2）標記座位的等位基因間是共顯性的，通過 雜交后電泳帶型可直接區(qū)別雜合子和顯性 純合子 （3）RFLP標記源于基因組DNA自身變異，在 數(shù)量上幾乎不受限制。RFLP標記優(yōu)點RFLP標記缺點 （1）DNA需要量大。 （2）所需儀器較多 （3）技術較為復雜 （4）多數(shù)RFLP表現(xiàn)為二態(tài)性，提供的信息量較低 （5）與內(nèi)切酶選用密切相關RFLP標記缺點RAPD標記1990年，美國杜邦公司科學家Williams推出。RAPD方法是在PCR技術基礎上發(fā)展起來的，它利用一系列單個隨機引

13、物（通常為10個核苷酸），對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，引物與基因組DNA某一區(qū)段互補時，就與其結合，就可對引物下游DNA進行合成，即擴增。 RAPD標記RAPD的基本概念和原理RAPD的引物： （1）為隨機引物 （2）序列較短（通常為10個核苷酸） （3）為一個寡核苷酸單鏈引物RAPD的基本概念和原理0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.3kb0.5kb品系1 品系20.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kbRAPD的基本實驗程序1. DNA的提取2. 模板DNA濃度和質(zhì)量的檢測3. PCR擴增4. 電泳檢測：PCR結束后每個樣品

14、加4ul凝膠上樣緩沖液，每個泳道點樣20ul。5. 將凝膠浸于1ug/ml的EB中30min60min，用水清洗約10min，觀察、拍照。6. 統(tǒng)計分析：記錄條帶清晰的RAPD條帶，計算帶紋相似率；計算帶頻率、群內(nèi)遺傳純度；DNA片段大小。RAPD的基本實驗程序 RAPD結果Timothy genetic variation (Guo et al. 2002) RAPD結果Timothy genetic variatRAPD的優(yōu)缺點優(yōu)點： （1）不需DNA探針，設計引物不需知道序列信息。覆蓋整個基因組。具有廣泛適用性和通用性。 （2）用一個引物可擴增出多片段。 （3）技術簡單，需要樣品量少，成

15、本低。 （4）每個RAPD標記相當于基因組分析中的靶序列位點，簡化信息的轉(zhuǎn)移過程。（5）可以對RFLP難以分析的基因組區(qū)域做遺傳連鎖圖。（6）分析自動化。RAPD的優(yōu)缺點RAPD的優(yōu)缺點缺點：（1）顯性標記，無法區(qū)別顯性純合體和雜合體。（2）對反應條件敏感，重復性差。模板濃度、 Mg 2+濃度，PCR反應中條件的變化等。（3）存在共遷移問題。不同個體相同分子量的片段 不一定同源；一條帶可能包含不同的產(chǎn)物。RAPD的優(yōu)缺點AFLP標記AFLP：擴增片段長度多態(tài)性 （amplified fragment length polymorphism） AFLP技術是1992年由荷蘭Keygene公司的科

16、學家Zabeau Mare和Vos Pieter發(fā)明并發(fā)展起來的一種選擇擴增限制酶切片段的方法。AFLP標記 AFLP的基本原理植物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化形成相對分子量大小不等的隨機限制性酶切片段，隨后將特定的接頭連接在這些DNA片段兩端，接頭序列和鄰近限制性酶切位點作為引物進行PCR擴增，最后通過PAGE分離擴增的特異限制性片段。在不需要DNA序列的情況下，利用一套特定引物可在一次單個反應中檢測到大量的片段。 AFLP的基本原理 AFLP的基本原理AFLP引物是一種人工合成的單鏈寡核苷酸，一般長度為1820個核苷酸。引物主要由3部分組成：（1）核心序列（CORE），該序列與人工接頭互

17、補；（2）限制性內(nèi)切酶識別特異序列（ENZ）；（3）選擇性延伸序列（EXT），即引物3端的選擇堿基，選擇堿基延伸到酶切片段區(qū)。 AFLP的基本原理如：EcoRI引物和MseI引物EcoRI 5 -GACTGCGTACC AATTC NNN-3 MseI 5 -GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3COREENZEXT如：EcoRI引物和MseI引物EcoRI 5AFLP的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）少量引物可獲得較多標記，50150條帶（2）多為顯性標記或共顯性標記，受環(huán)境影響 小，無復等位效應（3）帶型清晰，具高分別率（4）由于用兩種引物經(jīng)兩步選擇擴增，帶型穩(wěn)定，帶紋豐富，靈敏度高，重復性好（

18、5）不需事先知道DNA序列信息缺點：操作復雜，費用較高AFLP的優(yōu)缺點SSR標記SSR：簡單重復序列（simple sequence repeat）多態(tài)性，也叫微衛(wèi)星標記。微衛(wèi)星：即短串聯(lián)重復(Short Tandem Repeat，STR)，它是由2-6bp重復單位構成的DNA序列，通常多態(tài)性片段長度在100-300bp。以人類基因組為例，平均每15-20kb就存在1個STR座位，據(jù)此估計整個人類基因組中大約有50,000-100,000個STR位點。由于微衛(wèi)星DNA具有高度的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性，所以非常適合作為遺傳學DNA分子標記。 SSR標記 真核生物基因組中散布著大量的微衛(wèi)星DNA，微

19、衛(wèi)星DNA由更短的重復單位串聯(lián)而成，重復長度一般為26bp，一個SSR總長度可達幾十到幾百bp。許多微衛(wèi)星間的不等交換或復制過程中的DNA滑動而高度可變，因而顯示出了豐富的限制性片段多態(tài)性。正因為真核生物中富含簡單重復序列，而重復序列兩端往往是相對保守的限制酶位點，所以通過特異引物進行PCR擴增反應、瓊脂糖凝膠電泳和放射自顯影，就可檢測到簡單重復序列單位數(shù)不同的DNA區(qū)域多態(tài)性。 真核生物基因組中散布著大量的微衛(wèi)星DNA，微衛(wèi)星DNABx 351-241 (2n)Bx 351-229 (2n)Bx 351-200 (2n)Bx 351-231 (2n)Bx 351-217 (2n)Bx 351

20、-238 (2n)Bx 351-175 (4n)Bx 351-214 (4n)Bx 351-185 (4n)Bx 351-184 (4n)Bx 351-267 (4n)Bx 351 (wt, 4n)D-12 (parental line)Tomosakae (parental line)NC105150250bpFig. 6 SSR profiles of Festulolium progenies with primer LPSSR K10F08 showed amplified polymorphism among the diploid and tetraploid Festuloliu

21、m progenies and showed two tetraploid-specific band of 110 bp and 115 bp (arrows) which also appeared in the amphidiploid Festulolium wild type plant (2n=4x=28) and putative parental D-12 (Lolium perenne) plant, respectively. NC, negative control.Bx 351-241 (2n)Bx 351-229 (2n)RFLPRAPDAFLPSSRSNP遺傳特性共顯性顯性顯性/共顯性顯性顯性/共顯性多態(tài)性低中等高高低檢測基礎分子雜交隨機RCP專一PCR專一PCR專一PCR檢測基因組部位單/低拷貝整個基因組整個基因組重復序列區(qū)整個基因組技術難度難易易易易DNA質(zhì)量高低