1、未培養(yǎng)微生物和極端微生物的研究進展未培養(yǎng)微生物的研究和應(yīng)用第一部分經(jīng)典分類方法： 以形態(tài)學及其生化特征分類，不足是不能提供進化和自然的關(guān)系；經(jīng)典分類的進展： 以16SrRNA序列相似性為代表，序列同源性97以上定義為一個種；經(jīng)典培養(yǎng)方法： 純培養(yǎng)方法不足：約有50-100萬種原核微生物，目前記載不足5000種經(jīng)典微生物分類與培養(yǎng)黃石公園Obsidian Pool的故事75 95 OC, 富含F(xiàn)e(II)、H2S、H2、CO2Ward采用16SrRNA方法進行了研究，發(fā)現(xiàn)同源性只有94.7%Nanoarchaeum equitans來自冰島海底熱溢口的怪異新古菌球菌：直徑約為400 nm基因組：

2、500 kb與一特異古菌宿主共生極端嗜熱（90）特殊rRNA：古菌中新的一界N. equitansIgnicoccus一個“看不見”的事實微生物： 分布最廣 界定生物圈范圍 生物量最大 占總生物量的 60% 物種及代謝多樣性最為豐富未培養(yǎng)微生物（uncultured microorganisms): 無法采用現(xiàn)有常規(guī)方法在實驗室里培養(yǎng)的微生物。常規(guī)方法：溫度范圍：10-70；壓力范圍：常壓條件；pH范圍：2-10；耐鹽范圍：低鹽范圍 共同協(xié)作的自然生存方式的崩潰 互養(yǎng)和共代謝，共棲、互生與共生； 急劇改變的生態(tài)位 大多數(shù)微生物的復(fù)蘇不僅需要營養(yǎng)物質(zhì)，還需要提供其群落中的小生態(tài)環(huán)境，即生態(tài)位；1

3、、未培養(yǎng)微生物存在的生態(tài)原因生長環(huán)境的極度營養(yǎng)變化 對環(huán)境資源高親和性的K 型，適應(yīng)低營養(yǎng)含量和極低的生長率； 潛在外源活性物質(zhì)的缺乏 純培養(yǎng)很難提供對許多細菌潛在重要的外源活性物質(zhì)；1、未培養(yǎng)微生物存在的生態(tài)原因?qū)?例 Rondon等以細菌人工染色體作為載體構(gòu)建了兩個土壤未培養(yǎng)微生物基因組文庫，篩選到41個分別編碼脂肪酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，DNA序列與已知序列有很大的差異，其中一個編碼的抗菌肽結(jié)構(gòu)屬于新的基因家族；傳統(tǒng)培養(yǎng)和宏基因組流程比較3.1 用低濃度的培養(yǎng)基來進行分離培養(yǎng) 一般認為, 傳統(tǒng)的培養(yǎng)基營養(yǎng)太豐富, 不適合于那些原先生長在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境中的微生物,

4、如海洋微生物；實例1： Connon等用比實驗室中常用的培養(yǎng)基營養(yǎng)低3個數(shù)量級, 小體積、低營養(yǎng)的培養(yǎng)基來分離海洋中的微生物。從11個樣品中分離出20500個培養(yǎng)物，其中有4個單細胞系是以前從未培養(yǎng)過、也從未描述過的。通過這種方法，使海洋樣品中浮游細菌的可培養(yǎng)率提高到14%，比以前提高了141400倍。 3、未培養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)方法 讓培養(yǎng)條件盡量模擬成原先的自然狀態(tài)，如用土壤浸提物和海水濾過液來制作培養(yǎng)基, 該方法已趨成熟；實例2： Zengler K等設(shè)計了一個非常精妙的方法，將細胞包埋在凝膠微滴板中， 在低營養(yǎng)的流動培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，再用流動血細胞計數(shù)法檢測微滴板上有多少個微克隆。這是一

5、個開放流動的系統(tǒng)， 微生物間的代謝產(chǎn)物及信號分子可在凝膠空隙中進行擴散而被其他菌利用。這與自然環(huán)境有很多的相似之處， 因而新培養(yǎng)出來的微生物種類也大大增加。 這種方法可用于包括土壤和海水的各種環(huán)境； 3.2 根據(jù)微生物特性 特異添加營養(yǎng)成分變成可培養(yǎng)實例1： Kashefi 等根據(jù)嗜高熱微生物利用Fe ( III) 作為終端電子受體這一高度保守的特性，在培養(yǎng)基中添加非常微量的Fe ( III) 氧化物。該方法的前提是對微生物特性有一定的了解。實例2： Santini 等從澳大利亞金礦中分出以亞砷酸為電子供體，氧為受體，以CO2 為唯一碳源的化能自養(yǎng)菌（NT-26）。16SrDNA 序列分析表明

6、，NT-26 屬于 -Proteobacteria 土壤桿菌的一個根瘤菌分支，可能是一新種。 環(huán)境樣品混合基因組DNADNA文庫目標基因/基因簇細胞破碎、DNA提取克隆活性篩選同源篩選未培養(yǎng)微生物基因資源的開發(fā)基于培養(yǎng)非依賴（culture-independent）技術(shù)的嘗試克隆酶生物活性物質(zhì)PCR1.環(huán)境樣品DNA的提取和純化細胞收集法Agarose plug直接裂解法物理法：研磨、超聲波、凍融、bead beating化學法：溶菌酶、Proteinase K、SDS、酚等DNA提取DNA純化 CTAB、PVPP CsCl密度梯度離心、電洗脫、柱層析等2.文庫篩選測序/基因注釋活性篩選常規(guī)活

7、性檢測基于BAC的功能基因組學平臺同源篩選PCR方法、分子雜交微排列技術(shù)、DNA芯片Restriction digestion of three purified environmental DNA samples分離自環(huán)境樣品的純化DNA的酶切試驗Size distribution of inserts in randomly selected clones騰沖熱泉試驗文庫：庫容約1 Mb；插入片段為3-8 kb環(huán)境樣品DNA文庫構(gòu)建研究結(jié)果簡要分析研究結(jié)果簡要分析20個測序樣品中，14個為新序列；14個序列中12個含可預(yù)測功能的基因；樣品e6含編碼硫氧蛋白還原酶基因一部分；樣品9918含蛋

8、白二硫鍵異構(gòu)酶基因一部分；為相關(guān)酶的性能改造提供基礎(chǔ)Davies的工作(1997)土壤樣品混合基因組DNAPolyketide synthase基因PCR國外研究實例1J. Davies (1997) 從土壤中直接獲得全長KSb基因的策略J. Davies (1997)KSa和KSb基因產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育學關(guān)系Handelsman和Goodman的工作(1998)土壤樣品混合基因組DNA元基因組文庫（BAC文庫）酶、小分子活性物質(zhì)元基因組（metagenome): 環(huán)境中所有微生物基因組的總和。國外研究實例2 Handelsman & Goodman (1998) 兩個土壤元基因組文庫（庫容：1

9、Gbp） Handelsman & Goodman (1998) Handelsman & Goodman (1998)未培養(yǎng)微生物系統(tǒng)發(fā)育學分析與生物學分析的偶聯(lián)基因簇的克隆 Handelsman & Goodman (1998) Osburne et al. (2000) 抗細菌活性的篩選Diversa公司 (1995-)未培養(yǎng)微生物基因資源大規(guī)模開發(fā)的先驅(qū)采集全球各種生態(tài)環(huán)境樣品高效篩選新基因、基因簇針對不同應(yīng)用需要優(yōu)化基因及基因簇獲得高效、高穩(wěn)定性酶和小分子生物活性物質(zhì)5,000 genomes109 clones108109 clone.assays/dayDiversa產(chǎn)品“酶訂購

10、計劃”數(shù)百種新酶ThermalAce DNA polymerase (由Invitrogen銷售）Replicase微生物世界的淘金者DiversaARIAD Pharmaceuticals, Inc.TerraGen Discovery, Inc.Khosan Biosciences, Inc.Maxygen, Inc.新世紀的挑戰(zhàn)任務(wù)：了解自然界中微生物的種類、相互作用、對環(huán)境的影響；開發(fā)微生物資源解決方案代表性生態(tài)環(huán)境的系統(tǒng)生態(tài)學研究發(fā)展新的富集培養(yǎng)和分離策略，結(jié)合采用分子生物學和培養(yǎng)依賴方法，研究未培養(yǎng)微生物 微生物系統(tǒng)科學：技術(shù)集成、學科集成極端微生物及其生物技術(shù)價值第二部分一、極端

11、微生物的概念研究的需求： 許多工業(yè)過程需要高壓、高溫、低溫、高鹽堿或耐輻射條件，一般生物催化劑難以勝任苛刻條件下的工作；定義： 是依賴于一種或多種極端物化因子的極端生命形式，在100以上或0以下、近飽和的鹽度、pH10或pH2、高壓和放射條件等極端環(huán)境下的極端生命形式.二、極端微生物的類型嗜熱菌(thermophiles)嗜冷菌(psychrophiles)嗜堿菌(alkaliphiles)嗜酸菌(acidophiles)嗜鹽菌(halophiles)嗜壓菌(barophiles)三、極端微生物的應(yīng)用潛力PCR技術(shù)中的高溫Tag DNA聚合酶；洗滌劑中的高溫蛋白酶和脂肪酶、堿性蛋白和脂肪酶；極

12、端嗜鹽菌生產(chǎn)PHB、核苷酸，將大大簡化后處理工藝，降低生產(chǎn)成本；油田的油層多為極端環(huán)境（高溫、高壓、高鹽、厭氧），一般微生物難以發(fā)揮作用，極端微生物將會帶來采油技術(shù)的一場革命極端微生物的應(yīng)用潛力在含硫的低品位礦床中，硫桿菌可產(chǎn)生大量硫酸，使pH降得很低，溶出很多貴重金屬。對極端嗜酸菌特別是嗜酸嗜熱菌的深入研究，已實現(xiàn)了濕法冶金；污染環(huán)境中，鹽堿度高、毒物濃度高、環(huán)境溫度低，普通的生物技術(shù)治理難有作為，而極端微生物可在高鹽堿、低溫條件下行使最佳功能，在環(huán)境整治中將大有作為。極端微生物的應(yīng)用潛力極端微生物具有多樣的代謝類型，通過對代謝途徑的認識與改造，極端微生物可過量積累有機酸、氨基酸等，實現(xiàn)超級

13、生產(chǎn)；嗜熱微生物可實現(xiàn)酒精的真正高溫發(fā)酵，實現(xiàn)酒精在發(fā)酵過程中的分離蒸餾，引發(fā)酒精生產(chǎn)工藝的劃時代變革；極端微生物的應(yīng)用潛力農(nóng)產(chǎn)品加工中，一般生物過程無法實現(xiàn)對纖維素、半纖維素的有效轉(zhuǎn)化。在極端條件下行使功能的極端微生物及其極端酶可在高溫、酸、堿等條件下對秸桿、廢渣等進行處理，為解決資源的有效轉(zhuǎn)化利用提供新途徑。極端微生物已經(jīng)適應(yīng)了各種各樣的極端環(huán)境，因而提供了一個特有的遺傳信息來源，從中發(fā)掘新型產(chǎn)物極具潛力.四、極端微生物的國內(nèi)外研究進展美國近年來非常注重極端微生物的研究，不僅在基礎(chǔ)研究方面開展了系統(tǒng)的工作，在極端微生物的生物技術(shù)利用方面已經(jīng)開始實用化，高溫DNA聚合酶、堿性酶及極端采油菌已

14、在產(chǎn)業(yè)上產(chǎn)生了重要影響，為推動整個生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展、協(xié)調(diào)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展等方面作出了重要貢獻。在基因芯片、新材料、新藥等方面，對極端微生物的作用也有很高的期望。極端微生物的國內(nèi)外研究進展歐洲是開展極端微生物研究較早的地區(qū)，他們主要研究極端微生物生命機理的分子基礎(chǔ)及新酶、新產(chǎn)物的開發(fā)。歐盟于97年啟動一個耗資1200萬美元的計劃“極端細胞工廠”，探索極端微生物在不同工業(yè)中的可能用途，已于99年11月結(jié)束。作為歐盟的整體策略，極端微生物項目的目的是“利用生物技術(shù)改造現(xiàn)在的化學工業(yè)過程”，項目協(xié)調(diào)人Antrinikan教授認為，極端微生物工業(yè)的時代已經(jīng)到來。極端微生物的國內(nèi)外研究進展日本對極端微生

15、物研究起始于1968年，K. Horikoshi教授有極端微生物研究之父之稱，正是他的工作使人們認識到了極端微生物的價值。他們開發(fā)了大量的嗜堿菌及其堿性酶，獲得了20多種堿性酶的專利，堿性纖維素酶、環(huán)糊精酶、蛋白酶等都在工業(yè)中得到了實際應(yīng)用。1991年日本開始實施了著名的深海之星（Deep-star）計劃，耗資50億日元進行為期5年深海極端微生物的研究，現(xiàn)在每年仍維持300萬美元的資助，從深海中獲得了1000多株嗜壓、嗜冷、嗜熱、嗜堿及耐有機溶劑的多類型的極端微生物，最引人注目的則是耐有機溶劑菌，可耐受的溶劑濃度可達50。極端微生物的國內(nèi)外研究進展極端微生物菌株發(fā)現(xiàn)獲得了產(chǎn)生耐熱、鹽、堿、酸的

16、酯酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、過氧化氫酶等酶的極端微生物237株，完成了其中183株菌的系統(tǒng)發(fā)育學分析，獲得新的分類單位。發(fā)現(xiàn)了一些極端微生物類群與產(chǎn)酶關(guān)系,如首次證明了Halomonas和Bacillus rRNA 第7類群是堿湖中主要的多糖水解酶產(chǎn)生者.我國的研究進展實例鹽湖分離的部分嗜鹽古菌產(chǎn)酶分析淀粉酶：35 株, 酯酶：65株, 蛋白酶：24株產(chǎn)水解酶嗜堿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析 建立環(huán)境基因文庫168M 環(huán)境基因文庫構(gòu)建技術(shù)和高通量篩選技術(shù) 分離新酶基因6個環(huán)境基因文庫構(gòu)建與酶基因篩選環(huán)境基因文庫LibrarySourceVectorE. Coli Host strainNo

17、. clonesInsert sizeTC1, TC3 TC5 TC7 & TC9Chinese geothermalpCRT7/CT-TOPOTop 10 F60,0000.5 kbTC1, TC3 TC5 TC7 & TC9Chinese geothermalpCRT7/CT-TOPOBL 21(DE3)pLySs60,0000.5 kbLP3, TC1, TC5, TC7, TC9Chinese geothermalpCRT7/CT-TOPOTop 10 F4003 kbEN2Chinese halophile pCRT7/CT-TOPOTop 10 F70002 kb 熱泉樣品DNA文

18、庫120Mb 載體為pCRT7/CT-TOPOLibraryE. coli Hostcloning vector No. of clones1HT-EcoRITOP10pUC19-EcoRI1.0002HT-HindIIITOP10pUC19-HindIII2.0003TC11TOP10pUC19-HindIII5.0004TC12 isolateDH5apUC1840.000 鹽堿湖樣品DNA文庫48Mb 載體為pUC19，插入片段2-6kb1.1 kb2.8 kb11.5 kb5.0 kb1，高溫alpha-glucosidase gene： 2.2kb, 與其它酶的相似性小于51，2，堿

19、性-mannanase gene， 1479bp, 與其它酶的相似性小于59 3， 堿性- amylase gene： 1761bp, 與其它酶基因相似性小于30 4，高溫6-phosphate-beta-glucosidase 2.4kb, 與其它酶的相似性小于51 5，酸熱-mannanase gene ， 27% partly to endo-1,4-beta-mannocidase6，堿熱酯酶基因新基因獲得6個新基因極端酶純化表征與結(jié)構(gòu)功能堿性過氧化氫酶 分子量140kd 溫度20-40,pH11堿性淀粉酶 分子量 60kD 溫度50 ，pH10堿性甘露聚糖酶 分子量 50kD 溫度7

20、0 ，pH9.5酸性甘露聚糖酶 分子量 38kD 溫度65 ，pH5.5 高溫葡萄糖苷酶 分子量 92kD 溫度65 ，pH5.7 分子量102kD 溫度90 ，pH6結(jié)構(gòu)與功能研究位點突變與酶特性的關(guān)系野生型甘露聚糖酶及其突變型特性比較 野生型甘露聚糖酶及其突變型預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)的比較已獲得結(jié)晶，為揭示酶結(jié)構(gòu)與功能、酶多樣性的結(jié)構(gòu)機制奠定了基礎(chǔ)。收集不同種屬的海綿5種 從繁茂膜海綿分離的放線菌，大部分屬于鏈霉菌屬Streptomyces，一些分屬6個稀有放線菌屬。其中一株與Actinoalloteichus cyanogriseus，相似度為96.7%，可能是一新種。放線菌300株細菌100株

21、真菌100株甲殼素降解酶過氧化物酶海洋微生物多樣性Effect of organic solvents （50）on the activity of YP1A protease50%(V/V)organic solvent, 40 C, 200 rpm for 2 h. The tube with the addition of buffer instead of solvents was used as control. Effect of organic solvents on substrate specificity of YP1A proteaseDMFDMSO異丙醇L-Glutam

22、ic acid-（4-nitroanilide）N95.3NL-Alanine-4-nitroanilide hydtochloride4.22.70.0L-Leucine-nitroanilide20.612.533.7L-Lysine-nitroanilide dihydrobromide1.20.033.7Z-L-Phe-nitroanilide0.00.0100NundissolvedThe YP1A protease showed different substrate specificity responding with the different solventsEffect

23、of organic solvents on the activity of LP8 lipase A novel lipase with high activity in organic solvents from Pseudomonas aeruginosa YJ0125%(V/V)organic solvent, 40 C, 140 rpm for 3 h五、極端微生物的商業(yè)應(yīng)用1997年Genecor公司推出了堿性纖維素酶103作為洗滌劑的添加劑，預(yù)計該酶的年市場銷售額可達到6億美元。美國Diversa公司自1994年底成立以來，已獲得340多種新型極端克隆酶。這些酶具有在某些極端條件

24、下（高溫、低溫、極端pH、高鹽、有機溶劑等）穩(wěn)定的特性，因而可以滿足某些工業(yè)應(yīng)用的特殊需要。 六、極端微生物的研究進展60年代主要研究極端環(huán)境微生物生態(tài)、新菌種的分離鑒定、理化特性及酶的篩選應(yīng)用；90年代后期，極端微生物的研究蓬勃發(fā)展，對極端微生物的系統(tǒng)分類、生態(tài)、生理、生化、遺傳以及生物技術(shù)利用開展了系統(tǒng)的研究；研究主要類群包括低溫、高溫菌，嗜鹽菌，嗜堿菌、嗜酸菌，嗜壓菌，及有機溶劑、輻射等因素相關(guān)的其它極端菌。1、嗜熱微生物的研究發(fā)現(xiàn)的嗜熱菌已有20多個屬，包括古菌及細菌，一般最適生長溫度在90以上的微生物，溫度的上限已到113C，在系統(tǒng)進化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能及熱穩(wěn)定酶的應(yīng)用等方面的貢獻突

25、出；如斯坦福大學學者發(fā)現(xiàn)的古細菌，最適生長溫度為100，降到80以下即失活；美國的巴羅斯發(fā)現(xiàn)一些從火山口分離出的細菌可以生活在250的環(huán)境中；嗜熱菌的適應(yīng)機理蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性高：氨基酸組成以Leu、Pro 、Glu和Arg為主，具有較高荷電氨基酸組成和平均疏水性，有利于高溫下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；另稍長的螺旋結(jié)構(gòu)、三股鏈組成的折疊結(jié)構(gòu)、以及C末端和N末端氨基酸殘基間的離子作用，有利于形成緊密而有韌性的結(jié)構(gòu)；細胞被膜結(jié)構(gòu)：除具有肽聚糖外還有六角形排列的外膜蛋白組成的類似鞘的外層結(jié)構(gòu)，如能在110生長的細菌具有蛋白表面層（PS）或糖蛋白表面層（GPS）組成，其中GPS在堿性2%的SDS煮沸下都不破壞，

26、可保持細胞的形態(tài)；嗜熱菌的適應(yīng)機理不同的代謝途徑：嗜熱脂肪芽孢桿菌中的磷酸甘油脫氫酶在90仍穩(wěn)定； 菌體內(nèi)特有酶：超嗜熱古細菌含有一種逆促旋酶，90活性最高，形成的正性超螺旋能增加DNA分子雙鏈的拓撲環(huán)數(shù)目，有助于DNA在特殊高溫下維持狀態(tài)，避免變性；2、嗜冷微生物的研究嗜冷菌的研究遠不如嗜熱菌那樣廣泛，主要分布在南北極、高山、土壤及深海微生物中；嗜冷微生物主要有：真細菌、藍細菌、酵母菌等；生長溫度：嗜冷型0-15，耐冷型0-5，高于10無法生長；嗜冷菌的適應(yīng)機理膜組分的變化：脂類組成脂肪酸隨溫度變化，不飽和脂肪酸在低溫下向飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變；重要代謝產(chǎn)物的生成：細胞質(zhì)內(nèi)海藻糖含量變化可增強失水生

27、存能力，避免因溫度降低而導(dǎo)致胞內(nèi)形成冰晶；同時糖類的羥基與磷脂的磷酸基形成氫鍵，阻止膜失水融合，并降低相變溫度，不易向凝膠相轉(zhuǎn)變，從而增加膜的流動性，提高抗冷能力；嗜冷菌的適應(yīng)機理具有大量帶負電的氨基酸殘基：底物易接近活性中心，具有相對柔韌性和小的功能域；酶分子松散，有較大可變性； 菌體內(nèi)特有酶：部分酶對溫度敏感，屬冷活性酶類；冷休克蛋白：增強微生物的低溫限制；嗜鹽古菌已有9個屬,在區(qū)系生態(tài)方面，死海、非洲鹽堿湖的研究當屬典型，獲得了大量資源;從死海、死谷，我國的新疆和內(nèi)蒙古的鹽堿湖中分離得到，一般生活在10-20%的鹽溶液中； 嗜鹽菌的生理、生化及遺傳是極端微生物學科中的傳統(tǒng)內(nèi)容，由于嗜鹽菌的產(chǎn)物不易在普通受體系統(tǒng)中表達活性，嗜鹽菌的遺傳系統(tǒng)也是人們熱心的內(nèi)容;嗜鹽菌的應(yīng)用潛力表現(xiàn)在相似性溶質(zhì)、酶、多聚物、脂質(zhì)體、醫(yī)藥以及環(huán)境整治等方面。3、嗜鹽極端微生物的研究嗜鹽菌的適應(yīng)機理膜組分的變化：在高鹽低氧環(huán)境中主要以細菌視紫質(zhì)（如視紫醛蛋白）為代表，這種光驅(qū)“質(zhì)子泵”可彌補高鹽下底物有氧氧化的能量不足；重要代謝產(chǎn)物的生成：細胞內(nèi)能積累高濃度鉀離子或鈉離子（4-5mol/L)；或胞內(nèi)積累大量小分子極性物質(zhì)，如甘油、單糖等，均可幫助細胞從高鹽環(huán)境中吸取水分細胞壁成分不同：不含肽聚糖而以脂蛋