基于PCR技術(shù)擴增序列改造纖維素分解菌的教學設(shè)計摘要以纖維素產(chǎn)量高、應(yīng)用潛力大的真實情境為背景，通過遞進式的問題為引導(dǎo)，驅(qū)動學生利用PCR技術(shù)設(shè)計引物,將枯草芽抱桿菌的信號肽序列和真菌的纖維素酶基因序列拼接并擴增,理論上解決產(chǎn)物分泌問題并增加酶的種類,利用酵母表達系統(tǒng)，實現(xiàn)從纖維素到葡萄糖再到酒精的發(fā)酵過程,聯(lián)系生產(chǎn)實踐體會社會責任。關(guān)鍵詞纖維素PCR信號肽酵母表達系統(tǒng)拓展課程高中生物學教學要求在真實情境中解決問題，培養(yǎng)學生的科學思維和科學探究能力，這要求教師在課程中向?qū)W生提供豐富的素材，包括實驗素材和科研素材，以及生產(chǎn)實踐中的具體應(yīng)用,使學生既能運用知識解決問題，又能體會生物學科的價值#《普通高中生物學課程標準（2017年版）》，更強調(diào)學生的獲得，課堂的活動要有互動性、趣味性，凸顯學生的主體地位，有效提升課堂質(zhì)量#1教材及學情分析本節(jié)是拓展課程，內(nèi)容涉及選修1專題3課題3及專題5課題2,具體包括：纖維素酶分解纖維素的原理、纖維素分解菌的初步篩選+PCR的原理及應(yīng)用#本節(jié)課以課題1微生物的實驗室培養(yǎng)、課題2微生物的分離與計數(shù)+PCR為技術(shù)基礎(chǔ)，以必修1的酶的作用和特點及必修2的DNA復(fù)制為理解的前提，又與選修3現(xiàn)代生物科技專題緊密聯(lián)系#學生具備酶的作用及特點的基礎(chǔ)知識，了解纖維素酶分解纖維素和PCR的原理，但知識不夠系統(tǒng)化，尚不能前后聯(lián)系；通過親身的實驗操作，初步掌握PCR技術(shù)，但對于如何設(shè)計PCR引物獲得（的基因仍有一定困難，尤其是如何設(shè)計引物、改造DNA片段；觀察到了日常生活中的現(xiàn)象，例如，落葉的分解、植食性動物對植物的消化，但不能將其與所學知識相聯(lián)系，并應(yīng)用于生活、生產(chǎn)中#2教學目標1） 通過制備臨時裝片，在顯微鏡下觀察并比較破壁機、土壤中初步分離鑒定的纖維素分解菌、纖維素酶的破壁效果，從定性的角度明確纖維素酶的破壁效果最好，形成初步的實驗設(shè)想：利用生物技術(shù)對纖維素分解菌進行改造。2） 通過資料分析，了解原核生物和真核生物在表達纖維素酶方面的優(yōu)、缺點，討論得出實驗設(shè)計，通過PCR引物設(shè)計構(gòu)建重組纖維素酶基因片段在原核生物中表達，培養(yǎng)與他人合作的意識及運用生物學術(shù)語敘述實驗方案的能力，培養(yǎng)科學思維#3） 通過分析真實的工業(yè)生產(chǎn)中纖維素酶轉(zhuǎn)化酵母菌的實例，體會生物學研究在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用，感悟生物科學研究的價值#

3重、難點及突破方法1） 重點：①明確實驗設(shè)計的一般思路和原則，單一變量、設(shè)置對照組；②描述實驗結(jié)果、概述實驗結(jié)論;③搭橋PCR的引物設(shè)計。2） 難點：設(shè)計PCR的引物獲得重組基因片段（搭橋PCR）。3） 突破方法：以實驗引入，激發(fā)學生興趣，通過展示不同處理后的實驗結(jié)果引起學生思考，分析實驗采用的單一變量（自變量）是處理的方式不同，因變死是破壁的效果，請學生描述實驗結(jié)果，說出實驗結(jié)論。為了高效獲得纖維素,最佳方法是酶解法，纖維素酶的制備選用什么方式更合理？出示大量的已有研究資料后，學生能提出采用細萌生產(chǎn)高效、經(jīng)濟，需要解決的問題是要加入-段序列才能使纖維素酶向胞外分泌，從而引出本節(jié)課的難點，將2段序列拼接，需要通過PCR的引物設(shè)計，人為創(chuàng)造重疊區(qū)域體外擴增。通過小組討論的形式，逐步引導(dǎo)學生加深思維力度；通過展示、糾錯、改正的過程，更高效地落實重點、突破難點。4教學過程4.1纖維素的重要性纖維素（GHsOQn是由葡萄糖組成的大分子多糖，是地球上最豐富的可再生資源。纖維素主要來源于植物界，包括棉花、木材、種植業(yè)廢棄物和禾草類植物，除了植物界，細菌和動物也可制造纖維素一據(jù)報道，每年全球大概會產(chǎn)生干重為1.3x10,的陸生植物，其中，纖維素占所有植物干重的50%。植物材料的主要成分除了半纖維素和木質(zhì)素以外，就是纖維素，纖維素物質(zhì)占地球總生物量的40%。若能將這些纖維素水解轉(zhuǎn)化為具有經(jīng)濟潛力的生物多糖，不僅有利于環(huán)境保護，還可解決能源、糧食、環(huán)境等一些列問題門。提問：如何獲取植物細胞壁中的纖維素？4.2纖維素的獲取和結(jié)果分析在教師引導(dǎo)下，結(jié)合生活經(jīng)驗和前期篩選纖維素分解菌的經(jīng)歷，學生提出可用物理（破壁機）、生物（纖維素分解菌、纖維素酶）方法破除細胞壁，獲得纖維素或?qū)⑵渌猓弘S后，以小組為單位制備臨時裝片（圖1）,觀察實驗結(jié)果，學生能得出結(jié)論：采用纖維素酶處理，水解最徹底、效果最佳，而用纖維素分解菌處理在相同時間內(nèi)效果不佳，所以，利用植物中的纖維素需要提純獲得纖維酶。A.破壁機處理；B.纖維索分解畫處理；C.纖維素酶處理圖1不同處理后植物細胞情況4.3通過PCR改造纖維素基因資料1：纖維素是一種夏合酶，包括G前、Cx前和葡萄檀甘酶，Reese等（1950年）曾提出了C,-Cx假說，該假說認為組成纖維素的不同前需要協(xié)同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。一般情況下，G酶首先進攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成Cx所需的新的游離末端，然后由Cx醯從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由葡聚糖昔酶將纖維二糖水解成二個前萄糖％。纖維素酶的來源非常廣泛，植物、昆蟲、軟體動物、原生動物、細菌、放線菌、真菌等都能產(chǎn)生纖維素酶，但是植物中的纖維素懈含量極低且難以提取，故目前纖維素酶的主要來源是微生物,細菌培養(yǎng)周期短，抗污染能力強，成本相對低，但其產(chǎn)生纖維素前的量相對較低，且大多不能分泌至細菌細胞外；主要產(chǎn)生的是G酶，只有極少數(shù)細笛能分泌Cx前。真菌能產(chǎn)生3類纖維素酶,但是分泌至菌體外的比例也較少，且會相互發(fā)生強烈的協(xié)同作用，酶的糖基化程度過高,還會影響酶的效率"任務(wù)：列舉細菌、真菌生產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)、缺點（表Do?1細菌、真菌生產(chǎn)纖維素醇的優(yōu)、缺點來源優(yōu)點缺點細菌真菌培養(yǎng)周期短，抗污染能力強.成本低產(chǎn)生的3類纖維素酶產(chǎn)最低，大多不能分泌至細胞外，極少數(shù)能分泌Cx骸分泌至菌體外的比例較少為了提高產(chǎn)量、節(jié)約成本，應(yīng)同時生產(chǎn)出3種酶使其能協(xié)同發(fā)揮作用，學生提出設(shè)想將真菌編碼纖維素酶的基因轉(zhuǎn)入細菌體內(nèi)表達，可提高產(chǎn)時節(jié)約成本、優(yōu)勢互補，但這樣操作仍存在問題，即細菌產(chǎn)生的纖維素酶不向胞外分泌。資料2：酵母表達系統(tǒng)具有將纖維素的最終產(chǎn)物——菊萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的能力，如果能將纖維素酶的基因克隆至酵母中，可實現(xiàn)從纖維素到菊萄糖再到酒精的完整發(fā)酵過程?？蒲腥藛T將瑞氏木霉纖維素基因（G酶和Cx酶）轉(zhuǎn)入釀酒酵母中表達，離心后取上清液，檢測重組酵母相對濾紙的酶活性，結(jié)果如圖2所示，引物A信號肽-——PCRPCR混合.變形，退火引物D樣晶編號l.C,IW轉(zhuǎn)化肉株汶.C,晦和CxIW共轉(zhuǎn)化常株；3.Cxiw轉(zhuǎn)化菌株；4.未轉(zhuǎn)化菌株圖2重組酵母的相對濾紙醇活性通過對資料2的分析，學生能說出實驗結(jié)果:2組的相對濾紙酶活性高于對照組（1組），3、4組的相對濾紙酶活性顯著低于對照組，而3組的相對濾紙酶活性又高于4組。歸納實驗結(jié)論：G酶和Cx前共轉(zhuǎn)化能提高相對濾紙能活，3組菌株中表達的Cx酶很可能并未分泌至細胞外。資料3：科研人員發(fā)現(xiàn)枯草芽抱桿菌也可產(chǎn)生纖維素G酶。與大腸桿菌相比，枯草芽弛桿菌具有以下優(yōu)勢：①在培養(yǎng)基中直接分泌蛋白并具有很強的分泌能力；②擁有一套高效分泌的信號肽系統(tǒng)，可高效地分泌目的蛋白；③是非致病性菌，無內(nèi)毒素，具有臨床和環(huán)境方面的安全性?？莶菅颗輻U菌的強分泌能力與信號肽序列相關(guān)，位于信號肽序列下游的基因片段，表達的蛋白質(zhì)可分泌至細胞外⑶（圖3）。5'ATATGAAATTTGTAA CTGTGGCAAGTTCTAG3'HillIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'TATACTTTAAACATT—?GACACCGTTCAAGATC5'注：序列來源自枯草芽抱桿值，具有該信號肽序列可使蛋白質(zhì)分泌至胞外圖3枯草芽弛桿菌信號肽序列⑶任務(wù)：①利用PCR技術(shù)應(yīng)選擇引物 擴增枯簞芽泡桿菌信號肽序列（表2）。延伸御次PCR|naipCR產(chǎn)物信號Bt+Cr基因圖4引物設(shè)計及PCR擴增過程4.4板書設(shè)計（圖5）基fpcR技術(shù)擴增序列

改造纖維素分解苗―?發(fā)現(xiàn)何息一?*>?>??機一?提純部或改it菌株―實驗恩路—蟆核表達+信砂肽+其核基因?qū)崥гO(shè)計—?PCR引物設(shè)計—?實踐應(yīng)用一?轉(zhuǎn)化釀酒醉母一?改進實驗表2引物名稱及序列引物名稱引物序列（5'到3,方向）AATATGAAATTTGTAAB(rr(；TGGCAAGT(n'AGCCTAGACTTGCCACAGDTTACAAATTrCATAT圖5板書設(shè)計5教學反思本節(jié)課的設(shè)計將實驗和教學掛鉤，引導(dǎo)學生發(fā)現(xiàn)問題、解決思路，形成良好的科學思維，將前期的纖維素分解菌的分離和鑒定實驗與后續(xù)的PCR實驗相串聯(lián)，巧妙銜接前、后知識。資料充分，既有學生的實驗結(jié)果，也有科研的數(shù)據(jù)，提高學生的參與感，充分落實了對學生生物學學科核心素養(yǎng)的培養(yǎng)，在基本知識的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)學生的能力。整個課堂的呈現(xiàn)，學生參與度較高，教學設(shè)計對學生的思維訓練由淺入深，能滿足高階思維的要求。課堂反饋環(huán)節(jié)，教師指出本節(jié)課是針對現(xiàn)有問題提出的設(shè)想，在真實場景中能否實現(xiàn)還有待進一