骨科研究方向干細(xì)胞1、概念：具有強(qiáng)大

和分化能力的多潛能細(xì)胞；2、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）：多能成體干細(xì)胞；3、機(jī)制：分化、旁4、外泌體作為旁；機(jī)制中的重要活性物質(zhì)而成為研究熱點(diǎn)。INTENSIVE2018

READING外泌體、上皮-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用、牙再生、Wnt、miRNA、miR135a第4講INTENSIVE2018

READING囊泡（外泌體、微囊泡和凋科學(xué)問(wèn)題研究熱點(diǎn)：上皮-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用在哺乳動(dòng)物

發(fā)育中廣泛存在，其中胞外亡小體）在細(xì)胞通訊中的作用成為研究熱點(diǎn)。文獻(xiàn)背景1INTENSIVE2018

READING文獻(xiàn)背景1研究背景：外泌體1、概念：主動(dòng)、囊性小泡、不含DNA成份；2、近期發(fā)現(xiàn)MSCs可

大量外泌體，成為研究熱點(diǎn)；3、機(jī)制：（1）信號(hào)物質(zhì)，直接作用；傳遞功能性蛋白；傳遞RNA等遺傳物質(zhì)；外泌體胞間轉(zhuǎn)移。INTENSIVE2018

READING文獻(xiàn)背景1研究背景：牙發(fā)育需要上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞共同存在。上皮來(lái)源的細(xì)胞將分化為成釉細(xì)胞，間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞將分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞；大量分子信號(hào)在牙發(fā)育中廣泛存在；牙發(fā)育中存在一類(lèi)介于100-200

nm的信號(hào)小體。INTENSIVE2018

READING文獻(xiàn)背景1科學(xué)假設(shè)：上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和基底膜中存在一類(lèi)100-120

nm

CD63陽(yáng)性的

小體：外泌體上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞

的外泌體分別被對(duì)方細(xì)胞內(nèi)吞來(lái)發(fā)揮功能調(diào)控作用上皮細(xì)胞

的含miR

135a的外泌體可活化間充質(zhì)細(xì)胞的wnt/β-catenin信號(hào)通路并上調(diào)牙本質(zhì)唾液蛋白的表達(dá)，而間充質(zhì)細(xì)胞自身并不表達(dá)miR

135aINTENSIVE2018

READINGFig.7

外泌體成份表達(dá)譜和miR135a功能研究結(jié)果總覽2Fig.1外泌體在上皮、間質(zhì)細(xì)

Fig.2上皮和間質(zhì)細(xì)胞

的外胞和基底膜中的基本特征

泌體分別被對(duì)方細(xì)胞優(yōu)先攝取Fig.3

間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體促

Fig.4上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)上皮細(xì)胞分化和基質(zhì)

進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分化和礦化Fig.5

減少外泌體

導(dǎo)致了上皮-間質(zhì)細(xì)胞功能紊亂Fig.6

外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)突變小鼠存在牙發(fā)育缺陷INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3貼圖在乳鼠切牙上利用顯微切割將上皮和間質(zhì)分離（A、D）上皮細(xì)胞和MSCs在無(wú)外泌體環(huán)境下培養(yǎng)（B、E）Fig.1外泌體在上皮、間質(zhì)和基底膜細(xì)胞中的基本特征電鏡下觀察上皮細(xì)胞和MSCs

的微

泡（C、F）INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3貼圖上皮細(xì)胞和MSCs

外泌體尺寸100-120

nm（G、H）上皮細(xì)胞和MSCs

外泌體CD63陽(yáng)性、GM130

（無(wú)

基體和細(xì)胞污染）（I）Fig.1外泌體在上皮、間質(zhì)和基底膜細(xì)胞中的基本特征INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3貼圖Fig.1外泌體在上皮、間質(zhì)和基底膜細(xì)胞中的基本特征激光共聚焦檢測(cè)顯示牙頸環(huán)區(qū)上皮和間質(zhì)高表達(dá)含CD63的外泌體（J、K、L）外泌體在無(wú)細(xì)胞的基底膜區(qū)也被檢測(cè)到（J’、K’、L’）INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.2上皮和間質(zhì)細(xì)胞

的外泌體分別被對(duì)方細(xì)胞優(yōu)先攝取使用電穿孔技術(shù)將帶有Cy3

的siRNA標(biāo)記外泌體Cy3標(biāo)記的MSCs外泌體可以被上皮細(xì)胞特異性內(nèi)吞單純Cy3標(biāo)記的siRNA并不會(huì)被上皮細(xì)胞內(nèi)吞INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.2上皮和間質(zhì)細(xì)胞

的外泌體分別被對(duì)方細(xì)胞優(yōu)先攝取Cy3標(biāo)記的上皮細(xì)胞外泌體可以被MSCs特異性內(nèi)吞單純Cy3標(biāo)記的siRNA并不會(huì)被MSCs內(nèi)吞INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.2上皮和間質(zhì)細(xì)胞

的外泌體分別被對(duì)方細(xì)胞優(yōu)先攝取外泌體優(yōu)先被對(duì)方細(xì)胞所內(nèi)吞，而不是被供體細(xì)胞內(nèi)吞高濃度和低濃度外泌體與供體細(xì)胞和對(duì)方細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)其胞內(nèi)內(nèi)吞比例INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.3

間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)上皮細(xì)胞分化和基質(zhì)MSCs

外泌體與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，上皮細(xì)胞內(nèi)牙釉蛋白和成釉蛋白mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，且存在劑量依賴性WB結(jié)果顯示其相應(yīng)的牙釉蛋白表達(dá)量也顯著上調(diào)，且存在劑量依賴性；但成釉蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.3

間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)上皮細(xì)胞分化和基質(zhì)基底膜是上皮-間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的重要結(jié)構(gòu)組成。MSCs

外泌體與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，外泌體促進(jìn)上皮細(xì)胞產(chǎn)生了基底膜成份，包括IV膠原和層粘連蛋白，且存在劑量依賴性。INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.4上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分化和礦化方法：ALP染色和定量，

紅染色和定量同樣的，上皮細(xì)胞

的外泌體與MSCs共培養(yǎng)后，促進(jìn)了ALP和礦化結(jié)節(jié)的形成。這兩類(lèi)指標(biāo)對(duì)于牙本質(zhì)成骨具有重要作用。INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.4上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分化和礦化此外，上皮細(xì)胞

的外泌體與MSCs共培養(yǎng)后，促進(jìn)了牙本質(zhì)唾液磷酸蛋白和骨鈣素的形成。這兩類(lèi)指標(biāo)對(duì)于牙本質(zhì)成骨具有重要作用。上皮細(xì)胞外泌體對(duì)Runx2這一轉(zhuǎn)錄因子無(wú)影響INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3牙組織體外重構(gòu)模型：分離E

16.5d胎鼠牙上皮和牙間質(zhì)；牙上皮和牙間質(zhì)在體

行

重構(gòu)；d2，形成基底膜；d12，形成牙。敲除模型rab27a/b敲除后，外泌體蛋白含量在MSCs和上皮細(xì)胞中均下降20%-40%Fig.5

減少外泌體

導(dǎo)致了上皮-間質(zhì)細(xì)胞功能紊亂INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.5

減少外泌體

導(dǎo)致了上皮-間質(zhì)細(xì)胞功能紊亂敲除后4d，Rab27a/b敲除破壞了上皮來(lái)源的基底膜成份——IV型膠原的形成INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.5

減少外泌體

導(dǎo)致了上皮-間質(zhì)細(xì)胞功能紊亂敲除后10d，Rab27a/b敲除破壞了間質(zhì)來(lái)源的牙本質(zhì)的形成INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.6外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)突變小鼠存在牙發(fā)育缺陷Rab27aash/ash突變小鼠進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，該小鼠具有細(xì)胞微囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)

的特點(diǎn)HE染色顯示突變小鼠牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)變薄激光共聚焦顯示突變小鼠牙釉蛋白和牙本質(zhì)唾液磷酸蛋白顯著減少I(mǎi)NTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.6外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)突變小鼠存在牙發(fā)育缺陷胎鼠E18.5d，Rab27aash/ash突變小鼠頸環(huán)結(jié)構(gòu)面積明顯縮小這與Rab27aash/ash突變小鼠E-cadherin表達(dá)量降低相關(guān)INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.7

外泌體成份表達(dá)譜和miR135a功能研究miRNA

array檢測(cè)兩種外泌體包含RNA的數(shù)量（Epi:390，MSCs:385）選擇Wnt這一經(jīng)典通路進(jìn)行驗(yàn)證TOPflash

luciferase實(shí)驗(yàn)表明上皮細(xì)胞

外泌體激活了MSCs的Wnt蛋白活性將390個(gè)miRNA在pubmed中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)包含35個(gè)與Wnt通路相關(guān)的miRNA生物信息學(xué)鎖定miR-135a，鑒定發(fā)現(xiàn)在上皮細(xì)胞及其外泌體中均高表達(dá)INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.7

外泌體成份表達(dá)譜和miR135a功能研究激光共聚焦發(fā)現(xiàn)miR-135a轉(zhuǎn)染MSCs引起了β-catenin

轉(zhuǎn)核miR-135a拮抗體則無(wú)此作用INTENSIVE2018

READING數(shù)據(jù)解構(gòu)3Fig.7

外泌體成份表達(dá)譜和miR135a功能研究TOPflashluciferase實(shí)驗(yàn)表明miR-135a激活了MSCs的Wnt蛋白活性，而其拮抗體無(wú)此作用miR-135a上調(diào)了WNT通路的靶

Axin2，但下調(diào)了其另一靶

APC將上皮細(xì)胞

外泌體轉(zhuǎn)染miR-135a后與MSCs共培養(yǎng)，Dsp表達(dá)上調(diào)。但骨鈣素和Runx2表達(dá)無(wú)變化INTENSIVE2018

READING現(xiàn)象外泌體可從牙上皮、間質(zhì)細(xì)胞中的外泌體可遷移至無(wú)細(xì)胞的基底膜處兩種外泌體分別被對(duì)方細(xì)胞優(yōu)先攝取敲除后功能驗(yàn)證（體內(nèi)外）阻斷外泌體

破壞了基底膜和牙本質(zhì)形成外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)突變小鼠存在牙發(fā)育缺陷正常功能驗(yàn)證（體外）MSCs外泌體促進(jìn)上皮細(xì)胞表達(dá)牙釉蛋白MSCs外泌體促進(jìn)上皮細(xì)胞表達(dá)基底膜成份上皮細(xì)胞外泌體促進(jìn)MSCs骨向分化外泌體關(guān)鍵功能成份鑒定和驗(yàn)證miR

array和生物信息學(xué)發(fā)掘鑒定miR135amiR135a上調(diào)了WNT活性和Dsp表達(dá)套路分析4I