抗體制藥第一節(jié)概述1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立了血清療法，開創(chuàng)了抗體制藥。1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白，α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。第一節(jié)概述抗體（antibody,Ab）是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。抗體的產(chǎn)生：機體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細胞被活化增殖、分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。即B細胞→漿細胞→球蛋白（2）多克隆抗體與單克隆抗體多克隆抗體（polyclonalantiboty,PcAb）：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新的手段，還促進了基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。單克隆抗體的應(yīng)用：單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用于疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測與某些疾病有關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標記單克隆抗體進行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對腫瘤進行定向治療。第二節(jié)單克隆抗體單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細胞（B淋巴細胞）與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的抗體。針對一個抗原決定簇、單一B細胞克隆產(chǎn)生、結(jié)構(gòu)和特異性完全相同、高純度。第二節(jié)單克隆抗體——抗原與動物免疫1、制備抗原→動物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進行動物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛骨髓瘤細胞系全名簡稱來源耐受表達自身Ig分子p3-X63-Ag8X63BALB/c8-AgIg-r1.κMOPC11-X45-6TGX45BALB/c6-TGIg-r2bp3-NS1-Ag4.1NS-1BALB/c8-Agκ（非分泌型）p3-X63-Ag8.653P3.653BALB/c8-Ag——SP2/0-Ag14SP2/0BALB/c8-Ag——Fast-ZeroFOBLAB/c8-Ag——Y3-Ag1,2,3Y3Lou8-Agκ鏈YB2-3.0-Ag20YB2(LouAO)F18-Ag——免疫方法：體內(nèi)、體外1、體內(nèi)免疫法：適合免疫性強、抗原量較多、8-12周齡雌鼠。顆粒性抗原：S.C107個細胞初次免疫，1-3W免疫1-2次；可溶性抗原：10-100μg（Ag）+等量福氏完全佐劑（S.C），2-4W/1-2次（不加佐劑）采集脾細胞前3div最后一次抗原（刺激B細胞分裂）脾內(nèi)免疫法：Ag0.1-0.2ml，105/10μg（追加免疫）2、體外免疫：不能用體內(nèi)方法或抗原免疫原性極弱且引起免疫抑制時?？乖可伲ǎ?0μg）、免疫期短（4-5d）、干擾因素少、雜交瘤細胞株不穩(wěn)定。4-8WBALB/c小鼠脾臟制成細胞懸液，加Ag達0.5-5μg/ml，培養(yǎng)4-5d（370C、5%CO2），分離脾細胞，細胞融合。淋巴細胞（致敏動物脾細胞）骨髓瘤細胞（腹水癌型漿細胞）融合處理BALB/c小鼠培養(yǎng)液含單克隆抗體腹水中含單克隆抗體選擇融合細胞培養(yǎng)雜交瘤細胞雜交瘤細胞克隆化第二節(jié)單克隆抗體

——細胞融合與雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)脾細胞1×108

骨髓瘤細胞2×107～3×107PEG：40%-50%4000，2minDMSO+培養(yǎng)液稀釋PEG①②③融合率高自身不分泌抗體雜交瘤細胞分泌抗體強而穩(wěn)定

HAT培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液成分濃度成分含量H1.0×10-4mol/L

RPMI1640粉10.4gA4.0×10-7mol/L

HEPES

2.4gT1.6×10-5mol/L

L-谷氨酰胺0.3g青霉素、鏈霉素各10萬U水1000mlpH=7.4，過濾、除菌H（次黃嘌呤）A(氨甲喋呤，阻斷DNA合成)T(胸腺嘧啶)第二節(jié)單克隆抗體

——篩選陽性克隆與克隆化1、篩選免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)2、克隆化：是指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。有限稀釋法：HT培養(yǎng)液/飼養(yǎng)細胞軟瓊脂法：0.5%瓊脂糖凝膠/易成功第二節(jié)單克隆抗體

——McAb的大量制備體內(nèi)培養(yǎng)法：5-20mg/ml（1）1-2W前BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷（pristane）（2）7-12d抽腹水，離心，保留上清體外培養(yǎng)法：10μg/ml（RPMT1640液培養(yǎng)）（1）加10%-20%胎?；蛐∨Ｑ澹?00μg/ml）（2）無血清培養(yǎng)：白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等（3）懸浮培養(yǎng)（2×107）（400μg/ml）與微載體懸浮培養(yǎng)（108）第二節(jié)單克隆抗體——McAb的純化1、澄清和沉淀處理1000g/5min（除沉淀物）20000g/30min（小顆粒）0.2μm濾膜（除細菌等）飽和硫酸胺沉淀抗體50%飽和硫酸胺回收抗體2、分離凝膠過濾：SephadexG200為介質(zhì)，最高峰IgM，另兩峰IgG，收率50-80%，純度90%以上。陰離子交換：IgG類，pH5.5除雜蛋白，pH7.4時IgG1、IgG2結(jié)合于層析柱，低離子強度IgG2a洗脫，IgG2b、IgG3沉淀。親和層析：IgG類，pH8.0（IgG2b、IgG3結(jié)合在蛋白A柱，IgG1稍差），pH3.5洗脫IgG2b，pH4.0洗脫IgG3，pH4.5洗脫IgG2a，pH6.0洗脫IgG1?？傊?，應(yīng)依據(jù)單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：1、離心（取上清）、超濾、鹽析2、分離⑴凝膠過濾（IgG、IgM單抗純化）⑵陰離子交換層析（IgG單抗純化）⑶親和層析（IgG單抗純化）

類型基本結(jié)構(gòu)相對分子量人-鼠嵌合抗體人IgC-小鼠IgV

150000改形抗體小鼠CDRs替換人CDRs

150000Fab完整L鏈和Fd

50000FV

VH和VL

25000單鏈抗體（SCFV）VH-多肽-VL

27000單域抗體VH或VL

12500最小識別單位（MRU）一個CDR＜2000一、人-鼠嵌合抗體抗原抗體結(jié)合功能—抗體可變區(qū)（V）同種性免疫源性—抗體穩(wěn)定區(qū)（C）在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞，就能表達完整人-鼠嵌合抗體。二、改形抗體（CDR移植抗體）Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個可變區(qū)。H和L鏈各有三個CDR，其它部分稱框架區(qū)。用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，可消除免疫源性。將鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig的CDR序列——CDR移植抗體用與鼠對應(yīng)部分有較大同源性的人框架區(qū)替換鼠框架區(qū)——模板替換對鼠CDR及框架區(qū)表面殘基進行鑲飾或重塑——表面重塑改變?nèi)丝蚣軈^(qū)與CDR有相互作用、與抗體親和力有關(guān)或?qū)蚣軈^(qū)空間結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵作用的殘基——補償替換保留鼠源性抗體可變區(qū)中參與抗原結(jié)合的殘基，或CDR與框架區(qū)中的關(guān)鍵殘基——定位保留三、小分子抗體基因工程小分子抗體僅表達鼠源單抗的V區(qū)片段，相對分子量為原抗體的1/80～1/3。即保留CDR區(qū)，而Ig分子中的C區(qū)不表達。小分子抗體類型有：①Fab片段抗體；②Fv抗體；

③單鏈抗體；④單域抗體；⑤最小識別單位單鏈抗體的優(yōu)點：①可去除非特異性反應(yīng)的競爭性表面蛋白，腫瘤顯象背景更加清晰性。②易滲透腫瘤組織中增加藥物治療濃度。③相對分子量小，免疫源性小，可消除人抗鼠的排異反應(yīng)，能延長T1/2。單鏈抗體的表達：大多在大腸桿菌中表達，有三種形式：①直接在細胞質(zhì)中表達；②與其它菌體融合表達融合蛋白；③分泌表達具有功能的單鏈抗體。四、雙功能抗體：即雙特性抗體，是一種非天然性抗體。其結(jié)合抗原的兩個臂具有不同的特異性。構(gòu)建方法（1）化學(xué)交聯(lián)法（2）生物學(xué)方法（雜種-雜交瘤）（3）基因工程方法：避免化學(xué)交聯(lián)對抗體的損害、定向結(jié)合抗原部位、減少非特異分布與副作用五、抗體融合蛋白屬雙功能抗體范疇（1）配基-配基型融合蛋白（CD4-Fcγ）（2）配基-Ig型嵌合蛋白（IL-2-Ig）（3）配基-FV型嵌合蛋白（CD4-FVCD3）（4）受體-FV型融合蛋白（5）酶-抗體型融合蛋白（ADEPT）構(gòu)建抗體融合蛋白的基本原則將第一個蛋白終止密碼子刪除，接上帶有密碼子的第二個蛋白基因，即實現(xiàn)兩個基因共同表達。關(guān)鍵是兩個蛋白的接頭序列Linker第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程將抗體基因的克隆和表達融為一體，在同一載體上進行，抗體基因表達在載體的表面，用固相化抗原對表達產(chǎn)物的載體進行淘篩，選出陽性克隆，構(gòu)建大庫容文庫（108），包括天然全套抗體基因，用基因工程方法研制任何一種具有高度特異性的抗體?？贵w研究進展的3個階段：①1890年白喉抗毒素，多克隆抗體；②1975年雜交瘤技術(shù)，單克隆抗體；③1994年基因工程抗體；一、噬菌體抗體庫技術(shù)的基本方法（1）獲取目的基因：抗體某一特定基因區(qū)段（如VH、VL可變區(qū)基因）（2）抗體庫技術(shù)的載體：噬菌粒載體（pHEN1）（3）淘篩：抗原固相—噬菌粒群吸附、洗滌、洗脫—再感染擴增—大容量次級文庫（反復(fù)進行）—淘汰非目的克隆，擴增目的克?。?）表達與鑒定：目的克隆導(dǎo)入感受態(tài)菌株二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點（1）模擬天然全套抗體庫（外源基因來自人外周血、骨髓、脾臟淋巴細胞）（2）避開人工免疫和雜交瘤技術(shù)（3）可獲得高親和力的人源化抗體三、基因工程抗體的表達（1）原核細胞表達（2）真核細胞表達（3）轉(zhuǎn)基因植物表達（4）轉(zhuǎn)基因動物表達第五節(jié)抗體診斷試劑一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑1、鑒定病原菌的抗體試劑

⑴常用診斷血清的品種和用途①沙門氏菌屬診斷血清②志賀氏菌屬診斷血清③病原性大腸埃希氏菌診斷血清⑵診斷血清的制備步驟①制備細菌抗原②免疫動物和制備抗體血清⑶診斷血清診斷方法⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被動血凝診斷試劑⒊妊娠診斷試劑⒋抗ABO血型系統(tǒng)血清二、免疫標記技術(shù)用抗體類試劑⒈熒光抗體診斷試劑⑴熒光抗體的制備⑵免疫熒光測定方法⒉免疫酶抗體診斷試劑⑴免疫酶染色法用抗體診斷試劑⑵酶免疫測定用抗體診斷試劑①HBsAg酶標診斷試劑②HBeAg酶標診斷試劑

③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶標診斷試劑④測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標抗體診斷試劑⑤甲胎蛋白（AFP）酶標抗體診斷試劑⑥癌胚抗原（CEA）的酶標抗體診斷試劑放射免疫用抗體診斷試劑放射免疫技術(shù)是將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來建立的檢測技術(shù)。放射性核素標記抗體的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法抗原的測定有：①夾心法②間接法③竟爭法常用標記抗體試劑有①HBsAg放射性核素標記抗體診斷試劑②HBeAg放射性核素標記抗體診斷試劑③HAV抗原放射性核素標記抗體診斷試劑④AFP放射性核素標記抗體診斷試劑⑤CEA放射性核素標記抗體診斷試劑三、導(dǎo)向診斷藥物放射性核素標記抗體腫瘤放射免疫顯像定位技術(shù)（放免顯像定位技術(shù)）將抗腫瘤單克隆抗體（Ab）與二乙基三胺五乙酸（DTPA）在體外偶聯(lián)成Ab-DTPA，再注入體內(nèi)后，就能與體內(nèi)組織相結(jié)合。由于抗體分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100min），因DTPA是重金屬離子絡(luò)合劑，所以In-113M可以結(jié)合到DTPA分子上，使腫瘤組織顯像。這一過程在2小時內(nèi)可完成。放射免疫顯像優(yōu)點：①在體內(nèi)確切腫瘤定位作用，準確性達90%，靈敏度達100%。②在體內(nèi)可檢出0.5cm大小的病灶，并可檢出肺腦的轉(zhuǎn)移灶。③小分子抗體易到達腫瘤部位，可顯著提高N/NT值。④抗體在腫瘤部位可保留6～9日⑤能觀擦抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。建立預(yù)定位技術(shù)需解決三個問題：①抗體在腫瘤組織滯留要7天以上。②Ab-DTPA偶聯(lián)物比較穩(wěn)定；③內(nèi)源性金屬離子對DTPA的封閉作用要小。第六節(jié)抗體治療藥物以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟。一、放射性核素標記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標記操作簡便、用量小。放射性核素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物⒈常用的抗癌藥物氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細胞毒性體高二倍。⒉抗體類