題目耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究進(jìn)展學(xué)院：專業(yè)：班級：學(xué)號：學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師：起訖日期：2017年1月16日-2017年5月5日畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）目錄摘要32705 =2\*ROMANI32705關(guān)鍵詞 =2\*ROMANIAbstract………………..=3\*ROMANIIKeywords………………………=3\*ROMANIITOC\o"1-3"\h\u327051、鮑曼不動桿菌的研究背景 耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究進(jìn)展1、鮑曼不動桿菌的研究背景鮑曼不動桿菌越來越成為影響嚴(yán)重疾病患者并對幾乎所有抗生素產(chǎn)生抵抗力。針對革蘭氏陰性細(xì)菌的最有效的是β-內(nèi)酰胺類抗生素，是嚴(yán)重鮑曼不動桿菌的首選藥物。然而，由于生產(chǎn)碳青霉烯類水解的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素（包括OXA型碳青霉烯酶和MBL），越來越多的鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥。近年來，在亞洲國家越來越多地報(bào)道了鮑曼不動桿菌生產(chǎn)的OXA型碳青霉烯酶。三十幾項(xiàng)研究顯示了傳播的碳青霉烯抗性鮑曼不動桿菌分離株不同地理區(qū)域，包括中東國家等如阿拉伯聯(lián)合酋長國[1]，巴林[2]和科威特[3]，在阿拉伯海灣地區(qū)，blaOXA-23和blaOXA-40碳青霉烯酶[4]。據(jù)報(bào)道，生產(chǎn)鮑曼不動桿菌分離株在利雅得，沙特阿拉伯[4]。另外，檢測到blaOXA-23-陽性A.鮑曼不動桿菌在五名成人密集患者中阿拉伯聯(lián)合酋長國謝赫哈利法醫(yī)療中心的護(hù)理單位阿聯(lián)酋也有報(bào)道[5]。在以前的研究中，Mugnier等分析了八種鮑曼不動桿菌菌株隔離在Salmaniya醫(yī)療中心發(fā)現(xiàn)巴林王國生產(chǎn)的所有分離株碳青霉烯酶基因[6]。對于八個(gè)分離株，兩個(gè)有遺傳blaOXA-23和一個(gè)孤立攜帶的blaOXA-58，而另一個(gè)五種鮑曼不動桿菌分離株產(chǎn)生blaOXA-72。APubMed搜索沒有標(biāo)識任何已發(fā)表的報(bào)告描述blaOXA-23生產(chǎn)鮑曼不動桿菌的發(fā)生或傳播在也門在這項(xiàng)研究中，我們第一次報(bào)告亞胺培南抗性鮑曼不動桿菌的產(chǎn)生blaOXA-23基因在也門。新德里金剛烷-b-內(nèi)酰胺酶（NDM）最近在腸桿菌科中被鑒定中東國家，包括NDM-1,此外，在阿拉伯聯(lián)合酋長國分離產(chǎn)生NDM-2的鮑曼不動桿菌菌株[7]。但在我國并沒有見到。AlThawra醫(yī)院新生兒部門的大量學(xué)習(xí)，2011年也門薩那，不動桿菌屬同時(shí)，與敗血癥有關(guān)，但分離株易于感染,在研究中檢測到blaOXA-23[8]。2013年2月在同一間醫(yī)院（AlThawra醫(yī)院）可能表明，耐藥性流行病學(xué)不動桿菌屬物種中巴布寧正在發(fā)生變化在也門，正如我們在其他國家所觀察到的那樣如阿爾及利亞[9]。此外，我們在研究中確定了存在氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶（6￠）-Ib一種鮑曼不動桿菌菌株（Y82），幾篇文章發(fā)表了描述在阿拉伯海灣分離的菌株中的側(cè)編碼基因地區(qū)。在科威特，Bonnin等已報(bào)道氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶aac（6￠）-Ib在鮑曼不動桿菌產(chǎn)生GES型碳青霉烯酶[10]。中東地區(qū)，攜帶armA的菌株報(bào)道各個(gè)地區(qū)，包括蘇丹國腸桿菌科阿曼[11]和阿布扎比[12]。據(jù)我們所知，blaOXA-23與16SrRNA甲基化的共同發(fā)生，asearmA在也門醫(yī)院首次報(bào)道。鮑曼不動桿菌產(chǎn)生碳青霉烯酶AMEs，和16SrRNA甲基化酶可能與之相關(guān)也門與阿拉伯半島之間的關(guān)系也與其他亞洲國家在病人交流方面，特別是在也門沖突和戰(zhàn)爭局面該區(qū)域。在我們的菌株中發(fā)現(xiàn)的ST2以前在伊朗[13]和Kwawait[14]中被檢測到。此外，以前在鄰近的也門的沙特阿拉伯進(jìn)行的研究獲得的MLST數(shù)據(jù)顯示，具有ST2的鮑曼不動桿菌菌株是該國恢復(fù)的主要克隆[15]。廣譜抗生素的出現(xiàn)，鮑曼不動桿菌臨床分離株的耳廓抗性譜這個(gè)國家令人擔(dān)憂，因?yàn)榭咕幹委熯@些患者的效果將非常有限。發(fā)現(xiàn)不一樣的碳青霉烯類利福平和粘菌素最多對抗MDR鮑曼不動桿菌的活性抗微生物劑分離株這些抗生素可能是一個(gè)很好的選擇替代治療。以前的研究表明，利福平粘菌素是最活躍的組合治療由MDR引起的院內(nèi)感染的患者[16][17]。鮑曼不動桿菌鑒于天然水庫鮑氏不動桿菌菌株及其傳播機(jī)制也門國家依然未知，加強(qiáng)了監(jiān)督和衛(wèi)生政策的檢測和控制迫切需要MDR病原體以避免出現(xiàn)并傳播這些生物。

2、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥機(jī)制2.1鮑曼不動桿菌的基因組較大近期測得該菌的基因組為3.98Mb，有3830個(gè)開發(fā)讀碼框架，易于接受外源性基因。這使得此菌對環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性且可容納大量攜有的耐藥基因移動元件[18]。以I類整合子最為常見。在整合子5’保守端有編碼整合酶基因及啟動子，中間的基因盒可攜多種不同性質(zhì)的耐藥基因,可導(dǎo)致多重耐藥。國外的研究表明[18]，鮑曼不動桿菌的基因組中有AbaRl耐藥島，含45個(gè)耐藥基因,一株多重耐藥株的耐藥島有74個(gè)耐藥基因，其中含32個(gè)外排基因。已在此菌中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子攜帶的I類整合子，也發(fā)現(xiàn)菌中的插入序列ISAbal，可過表達(dá)Ampc酶和OXA51/69酶。鮑曼不動桿菌較大的基因組是其易出現(xiàn)多重耐藥的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2.2產(chǎn)生多類藥物的滅活酶或修飾酶2.2.1β-內(nèi)酰胺酶A類酶：此菌可產(chǎn)生以TEM-1酶為代表的多種超廣譜酶，以CTX-M-2為代表的CTX-M型酶。以SHV-12為代表的SHV酶。常見的酶還包括SHV-12、PER-1、VEB-l等，多為超廣譜酶。2)B類酶：主要為耐碳青霉烯的金屬酶(MBLs)。此酶的活性依賴鋅離子的存在，故名金屬酶。IMP類金屬酶在此菌中已發(fā)現(xiàn)有IMP-1、IMP-2、IMP-4、IMP-5、IMP-6、IMP-1。此外還發(fā)現(xiàn)有VIM-2型種SIM-1型金屬酶等[19]。3)C類酶：代表酶為不動桿菌來源的頭孢菌素酶(acinetobacter-derivedcephalosporitinases,ADCs)，另外還有DHA-1型酶等。侯天文等[12]等發(fā)現(xiàn)此菌攜有blaDHA-l基因，同時(shí)還有blaTEM-1型基因。其DⅡA-1型AmpC酶是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的頭孢菌素酶，與摩氏摩根菌染色體AmpC酶氨基酸序列一致率達(dá)98.17％～99.10％。首次發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)DHA-l型AmpC酶細(xì)菌是1992年白沙特阿拉伯Dha-ham醫(yī)院一個(gè)患者大便標(biāo)本中分離的腸炎沙門菌。產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶革蘭陰性桿菌臨床可選用第4代頭孢菌素和碳青酶烯類藥療。4)D類酶：即Bush分類的2D類酶,0XA-23型酶是第1個(gè)從鮑曼不動桿菌中分離出來的D類碳青霉烯酶，bla0XA-23基因位于質(zhì)?；蛘呷旧w上。目前在耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20余種0XA酶，主要有位于質(zhì)粒的0XA-23、oXA-58，位于染色OXA-24、OXA-25、OXA-26、0XA-40和可自然出現(xiàn)的類似0XA-51/69酶的0XA-64、0XA-65、OXA-66、0XA-68、OXA-70、0XA-71、OXA-78、OXA-79、0XA-80、OXA-82，并且新的酶仍不斷被發(fā)現(xiàn)。OXA酶首先與藥物底物相互作用形成復(fù)合體或組成一個(gè)短暫的酰基酶中問體，繼而γ-O絲氨酸位點(diǎn)攻擊β-內(nèi)酰胺環(huán)碳?；奶荚?，隨后中間體迅速脫?；尫懦鐾暾拿负鸵粋€(gè)開環(huán)的產(chǎn)物。據(jù)錢潔等分析，OXA-23不是導(dǎo)致鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯的唯一因素，而是由多種碳青霉烯酶共同作用并聯(lián)含其他機(jī)制(例如外排泵的過度表達(dá)、外膜蛋白的變異引起的藥物通透性降低共同導(dǎo)致的高水平耐藥[20]。2.2.2氨基糖苷類修飾酶(AMEs)AMEs分為乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)、核苷轉(zhuǎn)移酶(ANT)和磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)3大類共50余種，可修飾氨基糖苷類的特定基團(tuán)，降低或喪失對靶似核糖體的親和力。此類基因借助于整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等町移動性遺傳元件在同種或不同種細(xì)菌間傳播。酶的修飾作用導(dǎo)致了高水平耐藥,現(xiàn)已從鮑曼不動桿菌中檢出aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ，aac(3)-Ⅲ、aac(3)-Ⅳ、aac(6’)-Ⅰ、aadA1、aadB、ant(2’’)-I、ant(3’’)-I、aphA1、aphA6等多種修飾酶基因[21]。多為數(shù)種基因同時(shí)存在。不同國家和地區(qū)細(xì)菌的修飾酶基因分布有很大差異，如美國以ant(2’’)、aac(3)、aac(6’)最為常見，而日本則以aac(6’)多見。氨基糖苷類抗菌藥物與β-內(nèi)酰胺類藥物合用過去曾作為治療此菌感染的一線藥物。然而近年國內(nèi)的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)。它可以通過獲得氨基糖苷類修飾酶免受氨基糖苷類藥物攻擊[22]。2.2.3四環(huán)素的耐藥酶此菌耐四環(huán)素的基因TetA和TetB基因與它的外排作用有關(guān)。它的TetM基因有保護(hù)核糖體免受四環(huán)索類藥物攻擊的作用，可同時(shí)使多西環(huán)素，米諾環(huán)素失效。新型四環(huán)素類藥物Tigecycline可抵抗酶的作用，是對抗此菌有希望的藥物。2.2.4氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(catB)可鈍化氯霉素而且氯霉索外排基因(cmll)可增強(qiáng)外排泵的作用，從而造成對氯霉素的耐藥。鮑曼不動桿菌對氯霉素的耐藥率高達(dá)92.7%。2.3喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制以DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位基因(gyrA)及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的C亞單位基因(parC)發(fā)生突變?yōu)橹匾緩健Ｑ芯勘砻?0株對環(huán)丙沙星耐藥的鮑曼不動桿菌gyrA密碼子均由TCA→TTA，使氨基酸由Ser83→Leu。氟喹諾酮類藥物作用于細(xì)菌的DNA回旋酶(Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶)和Ⅳ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，阻斷了細(xì)菌的生長和分裂，起到殺菌作用[23]。當(dāng)編碼DNA回旋酶gyrA基因和編碼Ⅳ型拓?fù)洚悩?gòu)酶的parC基因發(fā)生突變時(shí)，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。GyrA的基因突變多數(shù)發(fā)生在氨基酸密碼子第67～106位，因此該區(qū)也被稱為喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)。國內(nèi)對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制研究大多集中在gyrA基因突變。而對parC基因突變較少報(bào)道。gyrA基因突變發(fā)生的確切順序各家報(bào)道不一，其中g(shù)yrA的Ser83→Lcu是公認(rèn)的第1個(gè)突變點(diǎn)。在研究中發(fā)現(xiàn)，所有耐藥株除存在該位點(diǎn)突變外，還存在Ala88→Thr新突變點(diǎn)；在parC的測序分析中，未發(fā)現(xiàn)Ser80→Let突變。2.4生物被膜的藥物屏蔽作用細(xì)菌生物被膜(BBF)是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境、有利于生存而特有的生命現(xiàn)象，系指細(xì)菌吸附于惰性物體如生物醫(yī)學(xué)材料或機(jī)體黏膜表面后，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復(fù)合物，使細(xì)菌相瓦粘連并將其自身克隆聚集纏繞其中形成的膜樣物[24]。其中的藻酸鹽多糖可吸附部分抗菌藥物；同時(shí)，許多易于固定在BBF多糖蛋白復(fù)合物上的細(xì)菌產(chǎn)生的水解酶等也吸附其上而水解或鈍化一部分抗菌藥物，從而使?jié)B入菌體的抗菌藥物明顯減少，達(dá)不到抑菌、殺菌濃度，而使藥物失效[25]。另外，多糖蛋白復(fù)合物還可以延緩大多數(shù)抗菌藥物的擴(kuò)散[24]。有研究表明，某些抗生索可誘導(dǎo)BBF內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的水平顯著升高，而使細(xì)菌顯示出高度的耐藥性。鮑曼不動桿菌可形成生物膜，使其耐藥性增強(qiáng)[26]。大環(huán)內(nèi)酯類藥物如克拉毒索、羅紅霉素、地紅毒素、氟紅霉素、阿奇霉索等可抑制生物膜的形成，可提高喹諾酮類藥物劉BBF的滲透性和對被膜下細(xì)菌的殺菌活性[27]。2.5藥物作用靶位的改變和外膜蛋白的缺失已有研究表明鮑曼不動桿菌膜上的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)可因基因變異而改變，如PBP2的表達(dá)減低，使青霉素和頭孢類藥物無結(jié)合位點(diǎn)而難以進(jìn)入菌體。對多重耐藥的鮑曼不動桿菌研究發(fā)現(xiàn)其可有22、33、37、44、47、43kDa的外膜蛋白缺失。這類耐藥機(jī)制常與其他機(jī)制共同形成多重耐藥。2.6外排系統(tǒng)的重要作用鮑曼不動桿菌可形成藥物的外排泵使進(jìn)入菌體的藥物濃度明顯減低而失效。外排系統(tǒng)(acinctobacterdrugcfflux，Adc)就是由不動桿菌發(fā)現(xiàn)的。此菌的外排泵以AdcABC為主。其結(jié)構(gòu)與耐藥結(jié)節(jié)分化(resistancenodulationdivision，RND)的三聯(lián)多藥外排系統(tǒng)相似，由AdeA(ORF4)，AdeB(ORF5)，AdeC(ORF6)組成，分別位于細(xì)菌的細(xì)胞膜內(nèi)、膜上和膜外。此系統(tǒng)可排出多種底物，有氨基糖甙類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、米諾霉素、氯霉素、紅霉素、甲基芐胺啼啶等[28]。但對利福平、磺胺、阿莫西林、頭孢他啶沒有排除作用。此外，還發(fā)現(xiàn)有Ad-eDE系統(tǒng)，可使對喹諾酮類、亞胺培南、慶大霉素、奈替米星、阿米卡星等的敏感性減低。日本發(fā)現(xiàn)此菌的AdeM系統(tǒng)可能是多藥及毒物外排(multidrugandtoxiccompoundextrusion，MATE)系統(tǒng)的成員，可使對喹諾酮類、慶大霉索、柔紅霉素、阿霉素等的敏感性減低。另有發(fā)現(xiàn)AbxM外排系統(tǒng)的報(bào)道[28]。

3、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥基因CRAB主要產(chǎn)生多種碳青霉烯類酶[29]，PCR法擴(kuò)增常見的碳青霉烯酶基因A組(blaKPC、blaSME、blaGES)、B組(blaIMP、blaVIM、blaNDM-1)、D組(blaOXA)、ESBL(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M)、AmpC(blaDHA、blaACT、blaFOX)，而其中最為多見的為OXA酶。復(fù)合體和酶中間體的形成使β-內(nèi)酰胺酶重建，OXA酶與抗生素底物相互作用形成的重建性β-內(nèi)酰胺對青霉素、頭孢菌素、單內(nèi)酰環(huán)類抗生素都有活性，阻斷這些抗生素發(fā)揮作用[30]。OXA酶可分為4個(gè)族，第1族是blaOXA-23，第2族是blaOXA-24，第3族是blaOXA-51，第4族blaox-58。其中第1族和第4族是由質(zhì)粒介導(dǎo)，而第2和第3族是由染色體介導(dǎo)。OXA酶中以O(shè)XA-23為我國廣泛流行的耐藥基因，是碳青霉烯類抗生素重要的耐藥基因之一；但研究發(fā)現(xiàn)OXA-23型基因的酶對碳青霉烯類抗生素的水解活性較弱。OXA-51存在于大多數(shù)鮑曼不動桿菌中，具有很高的種屬特異性，國外有研究表明，OXA-51基因某一個(gè)序列被插入了不同的基因序列，導(dǎo)致OXA-51基因水解酶被激活，使其對碳青霉烯類抗生素有特異性的水解能力，甚至可以以此作為快速檢測鮑曼不動桿菌的方法之一。使用Modeller9v7對OXA-51基因結(jié)構(gòu)及與其β-內(nèi)酰胺酶類抗生素相互作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)OXA-51對頭孢他啶的親和力最高，而對亞胺培南親和力最低。所以碳青霉烯類抗生素對OXA-51及OXA-23基因陽性的CRAB的臨床療效，目前暫未完全明確。

4、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌臨床用藥的研究進(jìn)展碳青霉烯類抗菌藥物(Carbapcnem)可迅速滲入細(xì)菌細(xì)胞壁中，與靶位青霉素結(jié)合蛋白(penicillinbindingproteins，PBPs)特異性結(jié)合，不易分開，具有特異的穩(wěn)定性，且廣譜抗菌，甚至對厭氧菌及多重耐藥的細(xì)菌均有良好作用。由于其部分藥物可以穿透血腦屏障，且不良反應(yīng)較少，然而隨著這類藥物在臨床使用的增加，一般體外藥敏試驗(yàn)均顯示碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，CRAB的大量出現(xiàn)使臨床的使用率大大下降。臨床根據(jù)《中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識》，通過增加碳青霉烯類抗生素給藥次數(shù)，加大給藥劑量，延長給藥時(shí)間，均顯示對部分CRAB感染病例有效。其原因可能是體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)的差異。檢測結(jié)果和用藥療效通常與三者相關(guān)：患者體內(nèi)因素；藥物因素；感染菌的因素也是非常重要，包括不同地域的不同菌株差異、感染細(xì)菌的量、細(xì)菌的獨(dú)立因素、細(xì)菌耐藥基因的表達(dá)模式、以及細(xì)菌復(fù)雜的耐藥機(jī)制。故體外藥敏并不能等同于體內(nèi)敏感或耐藥，MIC和抑菌環(huán)直徑只能作為提示臨床選用藥物因素之一，其療效并不能保證。目前有研究表明，菌株的耐藥性，與其攜帶的耐藥基因有關(guān)，同時(shí)也說明，對抗CRAB的藥物療效與耐藥基因有關(guān)系。有研究表明，CRAB的基因群OXA-51的陽性與陰性表達(dá)為臨床用藥的治療提供依據(jù)，OXA-51型碳青霉烯酶水解碳青霉烯類藥物的能力要弱于OXA-23型碳青霉烯酶；同時(shí)OXA-23和OXA-51均為陽性的碳青霉烯酶基因可能是我國鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物高度耐藥的主要原因之一。檢測基因序列對于臨床聯(lián)合用藥具有一定的臨床提示價(jià)值,考慮到鮑曼不動桿菌極易對抗菌藥物耐藥，故用藥時(shí)應(yīng)聯(lián)合用藥，目前針對CRAB，尚沒有明確的有效的抗菌藥物組合方案。而國內(nèi)外普遍認(rèn)為亞胺培南西司他丁與哌拉西林/舒巴坦聯(lián)合用藥對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌OXA-51和OXA-23基因陽性的CRAB肺部感染患者的臨床療效更顯著。OXA-23基因和OXA-51基因序列的檢測對臨床抗生素的選擇具有指導(dǎo)意義。

5、總結(jié)CRAB治療難度大，可選藥物有限，為了減少耐藥菌株出現(xiàn)、提高療效顯得非常重要。選擇用藥的時(shí)候應(yīng)根據(jù)本醫(yī)院或地區(qū)的流行病學(xué),以內(nèi)體外藥敏試驗(yàn)的差異，耐藥基因型的研究，PK/PD原則優(yōu)化治療方案聯(lián)合用藥[30]。本文對我國碳青霉烯酶進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增的主要耐藥表型進(jìn)行總結(jié)，觀察亞胺培南聯(lián)合用藥治療感染的臨床療效，綜合上述研究PCR基因擴(kuò)增碳青霉烯酶的耐藥基因可以為聯(lián)合用藥提供依據(jù)，增加耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌CRAB細(xì)菌的耐藥基因明確度，從而改善治療方案，提高治愈率和細(xì)菌清除率。為更加合理有效的用藥，提供一個(gè)新的參考。但是CRAB耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，本研究觀察聯(lián)合用藥對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌OXA-51和OXA-23基因均為陽性患者的臨床療效更顯著，可能與OXA-51耐碳青霉烯酶水解能力弱有關(guān)，雖然CRAB耐藥機(jī)制還未完全闡述，但通過臨床的療效的觀察，我們認(rèn)為聯(lián)合用藥方式在臨床治療中具有很大的潛力，值得進(jìn)一步深入研究和探索。此外，抗生素聯(lián)合用藥的有效率評價(jià)的重要指標(biāo)之一是部分抑菌指數(shù)（FIC），體外藥敏試驗(yàn)的相加和協(xié)同作用可以通過FIC來判斷，本文因?yàn)闀r(shí)間人力有限并未一同納入研究。聯(lián)合用藥的方式比較，本研究設(shè)想未做深入與其他統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行比較，沒有大規(guī)模標(biāo)本驗(yàn)證支持，希望在今后進(jìn)一步的完善和證實(shí)。

致謝感謝我的老師，感謝他無私幫助，他關(guān)心每一位同學(xué)，在本文的方向邏輯甚至統(tǒng)計(jì)方案上給予各種指導(dǎo)和幫助，再次感謝老師的無私教誨。同時(shí)感謝我的同事們，無錫市中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室主任張志斌老師，給與我實(shí)驗(yàn)的技術(shù)和方法指導(dǎo)，檢驗(yàn)科微生物室組長張立紅老師在選題進(jìn)展，實(shí)施過程中都給我很多意見和幫助教育我查閱資料和統(tǒng)計(jì)方法。最后感謝各位專家抽出時(shí)間對本文提出寶貴的意見。

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