一實(shí)驗(yàn)?zāi)颗c求1．學(xué)習(xí)生物堿的初步提取分離法。2．掌握利用柱層析分離純化、層層析鑒定藥用植物成分的方法。二基本原生物堿是植物中含氮的堿性有機(jī)化合物,大都明顯的生理活性,是許中草藥中的有效成分。它們是人類(lèi)對(duì)植物研究得最早最多的一類(lèi)有效成現(xiàn)已分離出有六千余種。這些生物堿在植物體內(nèi)一般均與有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸結(jié)合成鹽而存只有弱堿性生物堿往往呈游離狀態(tài),還一些是與糖結(jié)合成苷存在。小檗堿又名黃連素,最先由毛莨科黃連（chinensis）蕓香科黃柏amurense等植物中提出一種黃色生物堿。黃連屬植物的根莖、須根、葉中等都含有小檗堿、黃連堿、藥根堿、巴馬亭等生物堿國(guó)黃連藥材產(chǎn)量占世界第一位。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，唐松草屬Thalictrum檗科的小檗屬)、十大功勞屬(MahomiaNuff)及防己科的天仙藤屬Fibraurea）等都可作為提取小檗堿的資源植物。本實(shí)驗(yàn)即是用小檗屬植物三顆針(Berberisjulianaeschneid.或連屬黃連作為提取小檗堿的原料;RNR1R4

R2R3化合物小檗堿

R－OCH－O

OCH

OCH

H甲基黃連堿黃連堿

－OCH－O－OCH－O

－OCH－O－OCH－O

CHH

掌葉防己堿藥根堿古倫胺堿

OCHOHOCH

OCHOCHOH

OCHOCHOCH

OCHOCHOCH

HHH黃連類(lèi)生堿結(jié)構(gòu)三顆針及黃連中均含有小檗堿(別為1%,5.1%)及巴馬(葉防已堿Palamtine)、藥根堿Jatrorrhicine)等它均有明顯的抗炎作用。小檗堿是一種季銨堿,其游堿黃色針晶,Mp.145℃乙醚,微溶水,能于熱水和乙醇中，難溶于苯、丙酮、氯仿，幾乎不溶于石油醚。小檗堿與氯仿、丙酮、苯在堿性條件下均能形成加成物小堿鹽酸難溶于冷水，易溶于熱水酸易溶于水。溶解度分別為小堿1∶２（冷水,1∶100(冷)鹽酸鹽,1∶500(水;硫酸鹽,1∶30(冷水,利用這些特性提取鹽酸小檗堿。三儀器與劑1.儀器：層析柱、研缽、燒杯硅膠薄層板、濾紙、抽濾裝置、紫外燈、層析缸等2.試劑與樣品：三顆針根粉(或連根粉),0.5%硫，石英砂，脫脂棉，石灰乳，鹽酸，濃鹽酸，氧化鋁，95%乙，無(wú)水乙醇，10％氧化鈉溶液,濾紙硅膠，氯仿-氨-甲醇(∶∶8),氯-乙醇-鹽∶∶，下層四實(shí)驗(yàn)內(nèi)與驟1小檗堿粗品的制備方法一取顆針的根粗(過(guò)20目)20g,0.5%硫酸適量潤(rùn),拌以石砂混勻裝底部塞有脫脂棉的層析柱關(guān)閉活塞。加入適量0.5%硫酸使之浸沒(méi)藥面,浸泡一晝夜。逐漸加入0.5%硫酸即開(kāi)始滲,約收集200mL溶液。再用150mL左右0.5%硫浸泡

一天并滲濾。收集液用石灰乳中和多余硫,pH7,濾除沉向?yàn)V液中加5%量食鹽至飽和并10%鹽酸調(diào)至pH2-3,靜(過(guò)夜濾出沉淀用少量水洗滌向沉淀中加適量熱水溶解,用石灰乳調(diào)節(jié)pH8.5-9.8,熱濾除雜濾液在攪拌下加濃鹽酸至冷靜置,濾取析出的沉,水洗滌至中,抽。50以下干即為鹽酸小檗堿粗(成品)。方法二2]

取三顆針的根粗(過(guò)20目篩20g,于500杯中，加入倍0.5%硫酸水溶液使之浸沒(méi)藥面,浸泡24h脂棉過(guò)濾加灰乳中和多余硫,調(diào)pH＝12,靜置min，濾除沉淀,濾液用10%酸調(diào)至再濾液中加10%（）食鹽,攪拌使完全溶解后，繼續(xù)攪拌至溶液出現(xiàn)為混濁現(xiàn)象為止，靜過(guò))濾沉淀。并用少量水洗滌至中,抽干。50℃以下空干即為鹽酸小檗堿粗品。1鹽小檗堿精制方法二所得小檗堿還需精制。取所得粗(未干放入20量沸水中，攪拌溶解后，繼續(xù)加熱數(shù)分鐘，趁熱過(guò)濾。液滴加一滴濃鹽酸，靜置(夜),濾取結(jié)晶，用蒸餾水洗數(shù)次,抽干，℃下真空干燥即為精制鹽酸小檗堿2氧鋁柱層析分離純化鹽酸小檗堿5]a氧化鋁層析柱制:取一支2.0cm×層柱柱覆蓋少許脫脂,內(nèi)加入一定體積乙,打開(kāi)活塞,讓溶液慢慢流出。此時(shí)將已拌混均的氧化鋁乙懸液(層氧化鋁120-140目25-30g)不加入層析柱內(nèi),至完后輕敲柱,各部分氧化鋁均勻緊密一致。待氧化鋁沉降穩(wěn)定表應(yīng)平整,表面持有少量溶劑0.5cm左)，關(guān)閉活塞。b進(jìn)樣:取約50mg左的鹽酸小檗堿粗，用盡量少的無(wú)水乙醇溶解制成溶液。用吸管吸取樣液沿柱壁四周小心加,打開(kāi)層柱活塞使有溶劑滴下待液面近與氧化鋁表面相,迅速用少量無(wú)水乙醇將柱壁樣液洗下,待面下降后再洗,反復(fù)多次直至面溶劑無(wú)色讓樣完全持留于氧化鋁,并保留有1cm右溶此時(shí)加入少許石英砂覆蓋氧化鋁表面,并沿管壁加入足量洗脫劑過(guò)中要準(zhǔn)確迅,洗滌溶劑盡量少并盡可能不要擾動(dòng),氧化鋁表面平整。c洗:使溶劑繼續(xù)滴下(注意向柱內(nèi)添無(wú)水乙保持柱體濕),洗脫樣品每流分5-10mL收集洗脫液并著重收集各個(gè)(從下至)鮮黃色紅色(棕色段可不再洗)收集到的洗脫液經(jīng)濃縮后進(jìn)行檢測(cè)鑒定。d氧化鋁再生回收層析后棄去氧化鋁柱上端帶深色部取出剩余氧化,依次用％氧化鈉溶液和水洗滌,晾干后經(jīng)400℃烘4-6小時(shí)活化再生即可備用。3鹽小檗堿的鑒定a紙層析鑒定[6]:樣品:柱層析分離出的鮮黃色段及桔紅色段醇液標(biāo)準(zhǔn)品鹽小檗堿醇液展開(kāi)劑氯-乙醇，層顯色方法:自然光或紫外燈下觀,算各樣點(diǎn)R值并各點(diǎn)歸屬作出判斷。b硅膠薄層層析鑒定:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、顯色方法均同上展開(kāi)劑氯-氨甲醇(30∶1∶c紅鑒定:利用溴化鉀壓片法,常規(guī)測(cè)定其紅外光譜數(shù)并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì).注1各地產(chǎn)黃連根莖小檗堿及總生物堿含量分別為4.2-6.7%6.6-9.6%栽培種比野生種含量少20左右。黃連除根莖作藥材外，各部位均含小檗堿，黃連須根0.8-5.5％葉為％，老葉為2.5-2.8％，花為

0.56，種子為0.23％.2浸泡藥材粗粉的硫酸水溶液，濃度不宜過(guò)高，一般02-0．3％宜。若硫酸水溶液濃度過(guò)高，小檗堿可成為硫酸氫小檗堿，其溶解度1：100）明顯較硫酸小檗堿1：30）為小，降低提取效率。酸水溶液浸出效果與浸泡時(shí)間有關(guān)，浸12小約可浸出小檗堿％，浸24小時(shí)，可浸92％。規(guī)浸出應(yīng)浸泡多次，使小檗堿提取完全，本實(shí)驗(yàn)中浸出液只收集第1次的浸泡液。3鹽析時(shí)，加入氯化鈉的量，以提取液量的10％計(jì)算即可達(dá)到析出鹽酸小檗堿的目的。氯化鈉的用量不宜過(guò)多，否則溶液的相對(duì)密度增大，造成鹽酸小檗堿微細(xì)結(jié)晶呈懸浮態(tài)難以下沉。4在精制鹽酸小檗堿程中因酸小檗堿放冷極易析出結(jié)晶所加熱煮沸后應(yīng)迅速抽濾或溫過(guò)濾，防止溶液在過(guò)濾過(guò)程中冷卻，析出鹽酸小檗堿結(jié)晶，過(guò)濾困難，降低收率。5進(jìn)行柱層析分離時(shí),脫過(guò)程中需及時(shí)補(bǔ)加洗脫劑保持柱體潤(rùn)濕均勻若柱干裂,分離無(wú)法進(jìn)行。6紙層析檢測(cè)時(shí)需預(yù)先要將層析紙?jiān)谡归_(kāi)劑氣氛中飽和鐘,則