8生活飲用水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的測定免疫磁分別熒光抗體法測定方法驗證報告〔GB/T5750.12-2023〕目的通過力量確認(rèn)，確認(rèn)試驗室檢出限、回收率，方法重復(fù)性方面是否都到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)要求，試驗室是否具備開展用免疫磁分別熒光抗體檢測定生活飲用水及水源水的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的檢測力量。適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用免疫磁分別熒光抗體法測定生活飲用水及水源水中的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲〔〕的含量。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生活飲用水及水源水中的“兩蟲”的測定。職責(zé)試驗結(jié)果的意外因素。復(fù)核人員負(fù)責(zé)檢查原始記錄。技術(shù)負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)審核檢測結(jié)果。測試方法術(shù)語和定義賈第鞭毛〔Giardia 一種可能在水中或其他介質(zhì)中覺察的原蟲類寄生蟲。隱孢子蟲〔：一種可能在水中或其他介質(zhì)中覺察的原蟲6試劑EasyseedG/C〔賈第鞭毛蟲孢囊100±1.6，隱孢子蟲卵囊100±；Dynal/隱孢子蟲免疫磁分別試劑盒；Waterborne/隱孢子蟲染色試劑盒；PBSNaCl，8g；KCl，0.2g；Na2HPO4，1.15g；KH2PO4，0.24g；純水，1000mL，pH7.2±0.141PBSTl，KCl，0.2g；Na2HPO4，1.15g；KH2PO4，0.2g；TWeen-20，0.1mL；1000mL，900mL20min至完全溶解，參加0.1mLTween-2010min，然后用超純水稀釋至1000mL；0.1mol/LHCl；1mol/LNaOH；去離子水4.3DynalMPC-1磁極、DynalMPC-S磁極、DynalMX1混合器、FMxpressV2.0IKA四川蜀科離心機(jī)、DynalL10試管、BK-FL正置熒光顯微鏡、移液槍。檢驗步驟淘洗/濃縮過程〔Filta〕采樣體積原水20L100L；依據(jù)水樣類型打算。將過濾模塊〔螺栓頭朝下〕安裝在支架上，擰緊蓋子〔蓋子即為進(jìn)樣口。4L/min。開動泵，依據(jù)水樣量來確定采樣時間，登記過濾后水的體積V2，單位為L。淘洗翻開壓力淘洗器，過濾裝置進(jìn)樣口朝上，移開樣品阻留器，連接出樣口分流裝置。將過濾裝置倒轉(zhuǎn)，用快接頭連接到壓力淘洗器上，連接盛有緩沖液的瓶子，加4.0500mL錐形離心瓶放置在樣品收集器支架上，F(xiàn)1鍵，開頭自動淘洗，2min后收500mL濃縮將裝有淘洗液樣本的500mL離心管置2023g離心機(jī)離心15min，漸漸減V08mL～10mL免疫磁分別〔IMS〕使用賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲免疫磁分別試劑盒中的試劑制備1×SL-A型1mL10×SL-A1mL10×SL-BL10定量轉(zhuǎn)移10mL(V1)水樣濃縮物再懸浮液到含有SL-緩沖液的L10試管中。將抗隱孢子蟲抗體和抗賈第鞭毛蟲的磁微粒原液置于DynalMX1混合器上攪拌，以便使珠粒懸浮。并在上述L10100μL懸浮的微粒。DynalMX125r/min1h。磁珠，棄去清液。將試管從MPC-11mL1×SL-A型緩沖溶液。格外嚴(yán)峻的將試管中的全部物質(zhì)再懸浮。將樣品試管中的的全部液體定量轉(zhuǎn)移到貼有標(biāo)簽的珠進(jìn)展?jié)饪s，再次純化，并吸走上清液?；旌掀骰旌?0s，使磁珠與孢〔卵)囊充分解離。預(yù)備一個井型載玻片，然后加5μL1mol/L的氫氧化鈉溶液至樣本井中。將全部樣品從MPC-S的微量離心管中轉(zhuǎn)移到有氫氧化鈉的樣品井中。染色與鏡檢(FA)3750μL3min～5min。加50μL上述異硫氰酸熒光素〔FITC〕單克隆抗體工作稀釋液至樣本井3730min一個干凈的巴斯德移液管輕輕地從每個井邊吸掉過量的熒光素標(biāo)記單克隆抗L的〔或者h(yuǎn)r稀釋液～PBS。加I〔L溶于甲醇的50mLPBS〕2minDAPIμLWashBuffer1min～2minPBS。70μL1min在井型載玻片上蓋上載玻片，預(yù)備鏡檢觀看。留意１：為確保染色過程準(zhǔn)確牢靠，進(jìn)展染色試劑陰性比照和陽性比照試驗。陰性比照：用純水進(jìn)展染色試驗；陽性比照：用試劑盒中自帶的陽性樣本進(jìn)展染色試驗。翻開顯微鏡和汞燈。預(yù)熱10min后，在200倍的熒光顯微鏡下檢查，在400倍的熒光顯微鏡下進(jìn)一步證明。全井計數(shù)X，即計數(shù)樣本的體積中孢囊或卵囊的數(shù)目。結(jié)果推斷依據(jù)如下表〔在對樣品進(jìn)展計數(shù)前，要先計數(shù)陰性和陽性比照試驗樣品；陰性樣品不得檢出任何的“兩蟲正常、規(guī)章、染色均勻、數(shù)量正常的“兩蟲。8～14μm7～10μm子蟲的卵囊為微橢圓形，直徑2～6μm，卵囊壁會發(fā)出蘋果綠的熒光，在紫外光燈下，DAPI41賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊陽性推斷免疫熒光檢驗DAPI相差干預(yù)檢驗結(jié)果報告陽性陽性陽性確認(rèn)為卵囊或孢囊陽性陽性陰性確認(rèn)為卵囊或孢囊陽性陰性陽性確認(rèn)為卵囊或孢囊陽性陰性陰性疑心為卵囊或孢囊陰性陰性陰性無卵囊或孢囊檢出檢出限、回收率和周密度檢出限100L處理水，依據(jù)4.3的檢驗步驟進(jìn)展測定，其1，由檢測限計算公式：D=V/(V1×V2)得處理水的“兩蟲”檢測限為：D=10mL/〔10mL×100L〕=0.1/10L水源水的“兩蟲”檢出限為：D=10mL/〔10mL×20L〕=0.5/10L回收率和周密度10LEasyseedG/C〔賈第鞭毛蟲孢囊100±1.6，隱孢子蟲卵囊100±1.2〕兩蟲質(zhì)控標(biāo)樣，用磁力攪拌器混勻10min后，10L10L10L后連續(xù)過濾水樣?？傔^濾體積為20L，再依據(jù)淘洗、濃縮、磁分別、染色、鏡4由平均值公式得x

，n xi1 i賈第鞭毛蟲平均回收率為 隱孢子蟲平均回收率x=〔29%+39%+43%+41%〕/4=38.0%ni1(ni1(x x)2in1賈第鞭毛蟲標(biāo)準(zhǔn)偏差SD=0.06隱孢子蟲標(biāo)準(zhǔn)偏差 SD=0.06由相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD SD 100%得；xRSD=0.06/39.0%=15.5%隱孢子蟲相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD=0.06/38.0%=16.4%6結(jié)論Fil