1第八章免疫標(biāo)記技術(shù)中國藥科大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室王慧1第八章免疫標(biāo)記技術(shù)中國藥科大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室2免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是指用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原所進行的抗原抗體反應(yīng);三大標(biāo)記技術(shù):

同位素標(biāo)記技術(shù)免疫熒光技術(shù)

酶免疫測定2免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是指用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體3標(biāo)記免疫技術(shù)1.免疫熒光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫測定（enzymeimmunoassay，EIA）3.放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）4.化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）

5免疫印跡法（immunoblotting,Westernblot)3標(biāo)記免疫技術(shù)1.免疫熒光法（immunofluoresce4第一節(jié)放射免疫測定法

（radioimmunoassay,RIA）4第一節(jié)放射免疫測定法

（radioimmunoass5

放射性同位素(131I,或125I)標(biāo)記Ag或Ab測定Ab或Ag,通過測定放射活性判斷結(jié)果。該法常用于測定微量物質(zhì):如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及l(fā)gE等。5放射性同位素(131I,或125I)標(biāo)記Ag6VeteransAdministrationHospitalBronx,NY,USA

6VeteransAdministrationHospi7

與此同時，Ekins利用競爭性蛋白結(jié)合分析技術(shù)測定甲狀腺素獲得成功；開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的新時代，是微量分析方法學(xué)上的一個突破。7與此同時，Ekins利用競爭性蛋白結(jié)合分析8優(yōu)點：①特異性強，即抗原抗體的特異性反應(yīng)；②靈敏度高，結(jié)果精確，檢測范圍10-910-12g；③操作流程簡單易行，測量和數(shù)據(jù)處理自動化；④樣品用量少、無需復(fù)雜的提純步驟；⑤應(yīng)用范圍廣泛，尤其是測量小分子半抗原。缺點：需要昂貴的檢測儀器；同位素污染。8優(yōu)點：9原理

是建立在標(biāo)記抗原（或配體）和待測抗原（或配體）對有限量的特異性抗體（或受體）的競爭性抑制反應(yīng)基礎(chǔ)上的，最終形成的放射性標(biāo)記復(fù)合物與被測配體（或抗原）呈負相關(guān)，因而亦稱競爭性放射免疫技術(shù)。9原理是建立在標(biāo)記抗原（或配體10

Ag*+ Ab?Ag*-Ab

（F）（B）

+Ag ?Ag-Ab

10Ag*+ Ab?Ag*-Ab11RIA測定原理的定量示意圖

Ag*AgAbAgAb游離AgB/FB/T∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧6/26/83/53/82/62/84/44/811RIA測定原理的定量示意圖Ag*12返回12返回13

第二節(jié)免疫熒光法

(immuno–fluorescencetechnique

)13第二節(jié)免疫熒光法

(immuno14原理

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體法。將抗體或抗原標(biāo)記以熒光素，然后與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，借助熒光檢測儀（熒光顯微鏡或用流式細胞儀）測定或定位被檢抗原或抗體。

異硫氰酸熒光素(FITC)呈黃綠色熒光;

巰基化藻紅蛋白(PE)呈橙紅色熒光。14原理免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體法。151516激發(fā)光和發(fā)射光16激發(fā)光和發(fā)射光17

抗原抗體反應(yīng)的高度特異性熒光的敏感可測性顯微技術(shù)的高度精確性

準(zhǔn)確、特異、靈敏、快速地檢測和定位微量物質(zhì)。1718優(yōu)點：

特異性強，速度快，敏感性高，能準(zhǔn)確檢測少量抗原或抗體在組織細胞內(nèi)的定位分布。缺點：

非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足。

返回18優(yōu)點：返回19建立技術(shù)的必備條件1．

熒光素2．熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備3．熒光檢測儀返回19建立技術(shù)的必備條件1．熒光素返回20熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)。20熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)。21

熒光的種類

自發(fā)熒光

二次熒光21

熒光的種類

自發(fā)熒光22常用的熒光素返回22常用的熒光素返回23熒光檢測儀

（1）熒光顯微鏡（2）熒光分光光度計（3）流式細胞儀（4）熒光偏振光分析儀

23熒光檢測儀（1）熒光顯微鏡24熒光顯微鏡24熒光顯微鏡25熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈25熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈26分類：（1）直接熒光法:

（2）間接熒光法:

（3）流式細胞術(shù)(flowcytometry):

樣品(細胞)經(jīng)各種熒光素標(biāo)記的不同抗體染色后可同時分析細胞表達的多種分子。26分類：27(1)免疫熒光法：

①直接法:

簡單、快速、特異;敏感性差。

將熒光素標(biāo)記在特異性抗體上，直接檢測抗原。27(1)免疫熒光法：

①直接法:

28返回28返回29②間接法:

可檢測多種不同的抗原抗體復(fù)合物，具一定通用性；敏感性高;但操作流程長、干擾因素多。將熒光素標(biāo)記在第二抗體（抗抗體）上或標(biāo)記在SPA上，檢測與抗原結(jié)合的特異性抗體。29②間接法:將熒光素標(biāo)記在第二抗體（抗抗體）上或標(biāo)記在303031③補體熒光染色法：

將熒光素標(biāo)記在補體的抗體上（抗C3抗體），檢測抗原抗體復(fù)合物?？蓹z測所有的抗原抗體系統(tǒng)，具通用性；敏感性高；但操作流程長、干擾因素多、非特異性熒光多，補體易失活、需新鮮制備不方便。31③補體熒光染色法： 將熒光素標(biāo)記在補體的抗體上（抗C3232333334特殊染色法

①

雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)②雙色免疫熒光技術(shù)③反襯染色法

返回34特殊染色法①雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)返回35①雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)

在同一標(biāo)本中，可用兩種不同顏色的熒光標(biāo)記抗體進行免疫熒光染色，同時顯示兩種不同的細胞或同一細胞上不同類型的抗原。如：FITC（黃綠色熒光）和RB200或TRITC9（桔紅色熒光）。35①雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù) 在同一標(biāo)本中，可用兩種不同顏色的36②雙色免疫熒光技術(shù)

如FITC標(biāo)記抗體和細胞核染色劑PI（碘化丙錠）。

36②雙色免疫熒光技術(shù) 如FITC標(biāo)記抗體和細胞核染色劑37雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI37雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察WUWIBDUAL38多重染色標(biāo)本的多色觀察（FITC+TexasRed+DAPI）返回38多重染色標(biāo)本的多色觀察（FITC+TexasRed+D393940③反襯染色法

是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試劑的特異性染色。如：用RB200標(biāo)記牛血清白蛋白作為非特異性反襯標(biāo)記，用FITC標(biāo)記特異性抗體。40③反襯染色法 是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試414142流式細胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)

是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、細胞免疫學(xué)于一體,同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等,在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。

42流式細胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)434344FACS組成示意圖44FACS組成示意圖Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)Fluorescence-activatedcellso46流式細胞儀實驗原理46流式細胞儀實驗原理474748表達量檢測

48表達量檢測49細胞凋亡研究

PI染色49細胞凋亡研究PI染色50AV-PI雙染色50AV-PI雙染色51血液學(xué)應(yīng)用：包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等51血液學(xué)應(yīng)用：包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞52胞內(nèi)細胞因子的檢測52胞內(nèi)細胞因子的檢測53T細胞亞群分析53T細胞亞群分析54第三節(jié) 免疫酶技術(shù)

（enzymeimmunoassaytechnique）

1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs兩組學(xué)者分別用酶代替放射性同位素制備了酶標(biāo)記試劑，創(chuàng)立了酶免疫分析技術(shù)（enzymeimmunoassay，EIA）。54第三節(jié) 免疫酶技術(shù)

（enzymeimmunoassa55第三節(jié)酶免疫測定法

(enzymeimmunoassay，EIA)酶免疫技術(shù)是通過適當(dāng)?shù)拿复倩瘜W(xué)反應(yīng)和免疫反應(yīng)，使抗體（或抗原）與酶蛋白分子結(jié)合，形成酶標(biāo)抗體（或抗原）,該結(jié)合物保留免疫學(xué)活性的酶活性,因而既有抗原抗體反應(yīng)特異性,又有酶促反應(yīng)的特異性。酶分解底物后的顯色深淺可反映標(biāo)本中抗原或抗體的含量。常用酶：辣根過氧物酶、堿性磷酸酶。常用方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗――ELISA55第三節(jié)酶免疫測定法

(enzymeimmunoass56一、原理E：酶；S:底物；P:有色產(chǎn)物；D1：供氫體；D2：D1的氧化型有色化合物

將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。56一、原理E：酶；S:底物；P:有色產(chǎn)物；D1：供氫體；D57優(yōu)點：①靈敏度高，特異性強；②可定性、定量檢測可溶性抗原和抗體；③試劑穩(wěn)定，保存時長，無同位素污染；④可肉眼半定量，也可儀器（低廉）定量檢測；⑤操作簡便，易于掌握和使用，且重復(fù)性好；⑥可用于定位組織細胞上的抗原或抗體成分。缺點：

標(biāo)記反應(yīng)較難掌握，在操作過程中容易引起酶、抗原或抗體的失活。57優(yōu)點：缺點：58

建立技術(shù)的條件

1．標(biāo)記酶2．免疫酶結(jié)合物的制備3．酶標(biāo)檢測儀58

建立技術(shù)的條件1．標(biāo)記酶59常用的標(biāo)記酶

①辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）②堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）③葡萄糖氧化酶（glucooxidase，Glu）④-D-半乳糖苷（-D-galactosidase，-D-Gal）59常用的標(biāo)記酶①辣根過氧化物酶6060616162二、基本類型均相酶免疫測定法酶增強免疫技術(shù)；酶減弱免疫技術(shù)；輔基標(biāo)記技術(shù)2.非均相酶免疫測定法

ELISA(直接法、間接法、夾心法、競爭法、抗酶抗體法）1971年建立，稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）62二、基本類型均相酶免疫測定法1971年建立，稱為酶聯(lián)免疫63直接ELISA間接ELISA（用于檢測Ab）63直接ELISA間接ELISA（用于檢測Ab）64directELISA（forAg）64directELISA（forAg）65directELISA（forAb）返回65directELISA（forAb）返回6666676768返回68返回69

（3）夾心法

（sandwichassay）69（3）夾心法

70夾心法70夾心法71雙夾心法返回71雙夾心法返回7272737374ELISA雙抗體夾心法(測Ag)間接法(測Ab)加Ab,清洗加Ag形成復(fù)合物，洗滌加該Ag的另一Ab（酶標(biāo)），洗滌加底物，讀數(shù)加Ag，清洗加Ab形成復(fù)合物，洗滌加酶標(biāo)二抗加底物，讀數(shù)聚苯乙烯微量反應(yīng)板74ELISA雙抗體夾心法(測Ag)757576抗酶抗體法（PAP）76抗酶抗體法（PAP）77血清IgE的檢測實驗材料酶標(biāo)板（聚苯乙烯微量板）馬抗人抗體—（購自北京中山公司）辣根過氧化物酶（）標(biāo)記的馬抗人抗體—待檢血清包被緩沖液：碳酸鈉碳酸氫鈉洗滌液封閉液：溶液反應(yīng)終止液：77血清IgE的檢測78實驗方法包被酶標(biāo)反應(yīng)板：加馬抗人抗體（），孔℃孵育小時后洗滌次，分鐘次，孔，℃過夜孔

↓℃孵育后，洗滌同上酶標(biāo)記抗體：加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗體，孔℃孵育后，洗滌同上底物：加入（鄰苯二胺）溶液，孔

↓室溫分鐘終止液：加入，孔

↓內(nèi)，用酶標(biāo)儀測定各孔值，測定波長實驗結(jié)果

用待測標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均吸收值的比值（）

表示，當(dāng)大于某一數(shù)值時（如）判斷為陽性，數(shù)值的大小依具體檢測要求而定。7879（4）競爭法 a．固相抗體競爭法

b．固相抗原競爭法 79（4）競爭法 a．固相抗體競爭法80

a．固相抗體競爭法80 a．固相抗體競爭法81

b．固相抗原競爭法返回81 b．固相抗原競爭法返回82夾心ELISA競爭ELISA（用于檢測大分子Ag）（用于檢測小分子Ag）82夾心ELISA競爭ELISA（用于檢測大分子Ag）（用于83返回（5）抗體橋聯(lián)法

（immunobridge）83返回（5）抗體橋聯(lián)法

（i84（6）抗酶抗體法

（peroxidase-antiperoxidase，PAP）84（6）抗酶抗體法

（peroxidase-antiper85PO

抗

PO法返回85PO

抗

PO法返回86酶聯(lián)免疫斑點法(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。

86酶聯(lián)免疫斑點法在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)878788ELISPOT&ELISAELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。88ELISPOT&ELISAELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)89原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。89原理90DirectandIndirectElISPOT

可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞，然后放入已包被的孔中（間接法）。方法選擇基于：1）檢測細胞的類型；2）希望得到的細胞量。若只需少量的細胞因子生成細胞，使用直接法；反之，最好使用間接法。其它步驟一致。90DirectandIndirectElISPOT91ElISPOT操作過程91ElISPOT操作過程92929393949495操作過程

1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。2.倒去酒精，用100ulPBS洗滌3次。3.將100ul捕獲抗體加入10mlPBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋，4℃過夜。4.倒去液體，100ulPBS洗滌一次。5.每孔加入100ul2%脫脂乳PBS（見試劑準(zhǔn)備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。7.用100ulPBS洗滌一次。8.每孔加入100ul細胞懸浮液（含適當(dāng)量的細胞和相應(yīng)濃度的刺激劑）。細胞可預(yù)先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的96孔板塑料板蓋，37℃CO2孵育箱中孵育一定的時間（15-20小時）。這期間不要晃動或移動孔板。9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。95操作過程1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板9611.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次12.于10mlPBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30分。13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。14.每板以10mlPBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。16.每孔加入100ulBCIP/NBT。17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點數(shù)。4℃下放置一夜，點會比較明顯。9611.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次979798989999100返回100返回101101102四、通用與放大技術(shù)1．SPA通用系統(tǒng)2．ABC放大系統(tǒng)返回102四、通用與放大技術(shù)1．SPA通用系統(tǒng)返回103（1）SPA的發(fā)現(xiàn)

1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的某些菌株，可與人正常血清在雙相免疫擴散試驗中出現(xiàn)沉淀線。1958年Jensen用離子交換樹脂分析證明，該成分是一種細菌胞壁上不含糖的蛋白質(zhì)，命名為金黃色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA，SPA)103（1）SPA的發(fā)現(xiàn)1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡104Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，為非特異免疫反應(yīng)。生產(chǎn)SPA的國際標(biāo)準(zhǔn)菌株:CowanⅠ株（NcTc8530和ATCC12598）不生產(chǎn)SPA的標(biāo)準(zhǔn)株:Wood46

返回104Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，105（2）顆粒SPA的應(yīng)用

協(xié)同凝集試驗SPA吸收IgG試驗應(yīng)用IgG-SPA制備抗IgG的抗體返回105（2）顆粒SPA的應(yīng)用協(xié)同凝集試驗返回106（3）SPA的標(biāo)記和應(yīng)用

熒光素標(biāo)記SPA及應(yīng)用酶標(biāo)記SPA及應(yīng)用

106（3）SPA的標(biāo)記和應(yīng)用熒光素標(biāo)記SPA及應(yīng)用107酶標(biāo)SPA法返回107酶標(biāo)SPA法返回108ABC放大系統(tǒng)

生物素-親合素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem）

高度特異性高度靈敏性簡單快速安全穩(wěn)定

108ABC放大系統(tǒng)生物素-親合素系統(tǒng)109（1）生物素、親合素、

鏈霉親合素的特性

生物素（biotin，B）又稱維生素H、輔酶R（羧基轉(zhuǎn)化酶的輔酶）

MW244.31，pI3.5

分子式為C10H16O3N2S109（1）生物素、親合素、

鏈霉親合素的特性生物素（bi110110111Biotin111Biotin112親合素（avidin，A）

又稱卵白蛋白、抗生物素。

MW68,000，pI10～10.5，為堿性蛋白，含糖量高達10%；

1個親合素可與4個生物素結(jié)合；

Ka=1015mol/L112親合素（avidin，A）113鏈霉親合素（streptavidin，SA）：

是Streptomycesavidin菌分泌的一種蛋白質(zhì)。

MW65000，pI6.0，為略偏酸性的蛋白，不含任何糖基

1個鏈霉親合素可與4個生物素結(jié)合

Ka=1015mol/LSA比A在實際應(yīng)用中靈敏度要高、非特異性反應(yīng)要少。返回113鏈霉親合素（streptavidin，SA）：返回114（2）生物素的標(biāo)記技術(shù)

生物素的活化活化生物素結(jié)合物的制備活化生物素可結(jié)合或偶聯(lián)抗體、酶、蛋白質(zhì)、多肽、激素、凝集素、糖類及DNA、RNA等

114（2）生物素的標(biāo)記技術(shù)生物素的活化115（4）生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用115（4）生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用116返回116返回117四、ELISA方法的發(fā)展1.酶聯(lián)免疫熒光測定法117四、ELISA方法的發(fā)展1182.IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗（IgMantibodycaptureELISA,MAC-ELISA)1182.IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗1193.斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA)1193.斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA)120120121三、免疫金溶膠技術(shù)121三、免疫金溶膠技術(shù)122

膠體金試紙條診斷是采用斑點免疫層析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是90年代初在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）的測定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等檢測。（4）斑點免疫層析試驗

（dotimmunochromatographicassay,DICA)122膠體金試紙條診斷是采用斑點免疫層析技術(shù)研制123

膠體金（Colloidalgold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。123膠體金（Colloidalgold）是氯金酸（HA124質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一，無棱角。質(zhì)量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀各異。膠體金的質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)124質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一125膠體金標(biāo)記的原理：膠體金在堿性條件下帶負電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團藉靜電吸引而形成牢固結(jié)合。膠體金標(biāo)記技術(shù)（Immunogoldlabelingtechnique）是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。125膠體金標(biāo)記的原理：膠體金在堿性條件下帶負電荷，與蛋白質(zhì)126原理

以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測抗原/抗體。最常用雙抗夾心法檢測抗原。126原理以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜膠體金試紙條示意圖檢測線質(zhì)檢線吸收墊樣品墊硝酸纖維素膜連接墊（膠體金墊）背襯（底板）膠體金試紙條示意圖檢測線質(zhì)檢線吸收墊樣品墊硝酸纖維素膜連接墊128測定時將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)C處時使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。測定128測定時將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即吸取液129若標(biāo)本中有待測特異抗原，即可與免疫金復(fù)合物中的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)即被固相抗體捕獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條（T）。測定129若標(biāo)本中有待測特異抗原，即可與免疫金復(fù)合物中的抗體結(jié)合130測定過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG），而顯出紅色質(zhì)控線條（R）。130測定過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小131測定陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。131測定陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。132膠體金快速診斷技術(shù)的特點

簡捷快速：操作簡單，一般只要5-10min就會出結(jié)果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時間更長。結(jié)果易于判定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。特異性好：因為該技術(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，這決定了它具有很好的特異性。132膠體金快速診斷技術(shù)的特點簡捷快速：操作簡單，一般只要133病毒性疾病：傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬細小病毒、豬瘟等。寄生蟲疾病：血吸蟲病、旋毛蟲病、囊蟲病、恙蟲病。細菌性疾?。夯魜y弧菌、類鼻疽。膠體金快速診斷技術(shù)的應(yīng)用133病毒性疾?。簜魅拘苑ㄊ夏也　⑶萘鞲?、新城疫、犬細小病毒134H5亞型AIV尿囊液陽性結(jié)果陰性對照陰性對照H5ＡIV細胞毒陽性結(jié)果134H5亞型AIV尿囊液陽性結(jié)果陰性對照陰性對照H5ＡIV135135136磁分離技術(shù)原理：136磁分離技術(shù)原理：137第八章免疫標(biāo)記技術(shù)中國藥科大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室王慧1第八章免疫標(biāo)記技術(shù)中國藥科大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室138免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是指用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原所進行的抗原抗體反應(yīng);三大標(biāo)記技術(shù):

同位素標(biāo)記技術(shù)免疫熒光技術(shù)

酶免疫測定2免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是指用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體139標(biāo)記免疫技術(shù)1.免疫熒光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫測定（enzymeimmunoassay，EIA）3.放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）4.化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）

5免疫印跡法（immunoblotting,Westernblot)3標(biāo)記免疫技術(shù)1.免疫熒光法（immunofluoresce140第一節(jié)放射免疫測定法

（radioimmunoassay,RIA）4第一節(jié)放射免疫測定法

（radioimmunoass141

放射性同位素(131I,或125I)標(biāo)記Ag或Ab測定Ab或Ag,通過測定放射活性判斷結(jié)果。該法常用于測定微量物質(zhì):如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及l(fā)gE等。5放射性同位素(131I,或125I)標(biāo)記Ag142VeteransAdministrationHospitalBronx,NY,USA

6VeteransAdministrationHospi143

與此同時，Ekins利用競爭性蛋白結(jié)合分析技術(shù)測定甲狀腺素獲得成功；開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的新時代，是微量分析方法學(xué)上的一個突破。7與此同時，Ekins利用競爭性蛋白結(jié)合分析144優(yōu)點：①特異性強，即抗原抗體的特異性反應(yīng)；②靈敏度高，結(jié)果精確，檢測范圍10-910-12g；③操作流程簡單易行，測量和數(shù)據(jù)處理自動化；④樣品用量少、無需復(fù)雜的提純步驟；⑤應(yīng)用范圍廣泛，尤其是測量小分子半抗原。缺點：需要昂貴的檢測儀器；同位素污染。8優(yōu)點：145原理

是建立在標(biāo)記抗原（或配體）和待測抗原（或配體）對有限量的特異性抗體（或受體）的競爭性抑制反應(yīng)基礎(chǔ)上的，最終形成的放射性標(biāo)記復(fù)合物與被測配體（或抗原）呈負相關(guān)，因而亦稱競爭性放射免疫技術(shù)。9原理是建立在標(biāo)記抗原（或配體146

Ag*+ Ab?Ag*-Ab

（F）（B）

+Ag ?Ag-Ab

10Ag*+ Ab?Ag*-Ab147RIA測定原理的定量示意圖

Ag*AgAbAgAb游離AgB/FB/T∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧6/26/83/53/82/62/84/44/811RIA測定原理的定量示意圖Ag*148返回12返回149

第二節(jié)免疫熒光法

(immuno–fluorescencetechnique

)13第二節(jié)免疫熒光法

(immuno150原理

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體法。將抗體或抗原標(biāo)記以熒光素，然后與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，借助熒光檢測儀（熒光顯微鏡或用流式細胞儀）測定或定位被檢抗原或抗體。

異硫氰酸熒光素(FITC)呈黃綠色熒光;

巰基化藻紅蛋白(PE)呈橙紅色熒光。14原理免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體法。15115152激發(fā)光和發(fā)射光16激發(fā)光和發(fā)射光153

抗原抗體反應(yīng)的高度特異性熒光的敏感可測性顯微技術(shù)的高度精確性

準(zhǔn)確、特異、靈敏、快速地檢測和定位微量物質(zhì)。17154優(yōu)點：

特異性強，速度快，敏感性高，能準(zhǔn)確檢測少量抗原或抗體在組織細胞內(nèi)的定位分布。缺點：

非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足。

返回18優(yōu)點：返回155建立技術(shù)的必備條件1．

熒光素2．熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備3．熒光檢測儀返回19建立技術(shù)的必備條件1．熒光素返回156熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)。20熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)。157

熒光的種類

自發(fā)熒光

二次熒光21

熒光的種類

自發(fā)熒光158常用的熒光素返回22常用的熒光素返回159熒光檢測儀

（1）熒光顯微鏡（2）熒光分光光度計（3）流式細胞儀（4）熒光偏振光分析儀

23熒光檢測儀（1）熒光顯微鏡160熒光顯微鏡24熒光顯微鏡161熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈25熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈162分類：（1）直接熒光法:

（2）間接熒光法:

（3）流式細胞術(shù)(flowcytometry):

樣品(細胞)經(jīng)各種熒光素標(biāo)記的不同抗體染色后可同時分析細胞表達的多種分子。26分類：163(1)免疫熒光法：

①直接法:

簡單、快速、特異;敏感性差。

將熒光素標(biāo)記在特異性抗體上，直接檢測抗原。27(1)免疫熒光法：

①直接法:

164返回28返回165②間接法:

可檢測多種不同的抗原抗體復(fù)合物，具一定通用性；敏感性高;但操作流程長、干擾因素多。將熒光素標(biāo)記在第二抗體（抗抗體）上或標(biāo)記在SPA上，檢測與抗原結(jié)合的特異性抗體。29②間接法:將熒光素標(biāo)記在第二抗體（抗抗體）上或標(biāo)記在16630167③補體熒光染色法：

將熒光素標(biāo)記在補體的抗體上（抗C3抗體），檢測抗原抗體復(fù)合物?？蓹z測所有的抗原抗體系統(tǒng)，具通用性；敏感性高；但操作流程長、干擾因素多、非特異性熒光多，補體易失活、需新鮮制備不方便。31③補體熒光染色法： 將熒光素標(biāo)記在補體的抗體上（抗C1683216933170特殊染色法

①

雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)②雙色免疫熒光技術(shù)③反襯染色法

返回34特殊染色法①雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)返回171①雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)

在同一標(biāo)本中，可用兩種不同顏色的熒光標(biāo)記抗體進行免疫熒光染色，同時顯示兩種不同的細胞或同一細胞上不同類型的抗原。如：FITC（黃綠色熒光）和RB200或TRITC9（桔紅色熒光）。35①雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù) 在同一標(biāo)本中，可用兩種不同顏色的172②雙色免疫熒光技術(shù)

如FITC標(biāo)記抗體和細胞核染色劑PI（碘化丙錠）。

36②雙色免疫熒光技術(shù) 如FITC標(biāo)記抗體和細胞核染色劑173雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI37雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察WUWIBDUAL174多重染色標(biāo)本的多色觀察（FITC+TexasRed+DAPI）返回38多重染色標(biāo)本的多色觀察（FITC+TexasRed+D17539176③反襯染色法

是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試劑的特異性染色。如：用RB200標(biāo)記牛血清白蛋白作為非特異性反襯標(biāo)記，用FITC標(biāo)記特異性抗體。40③反襯染色法 是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試17741178流式細胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)

是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、細胞免疫學(xué)于一體,同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等,在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。

42流式細胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)17943180FACS組成示意圖44FACS組成示意圖Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)Fluorescence-activatedcellso182流式細胞儀實驗原理46流式細胞儀實驗原理18347184表達量檢測

48表達量檢測185細胞凋亡研究

PI染色49細胞凋亡研究PI染色186AV-PI雙染色50AV-PI雙染色187血液學(xué)應(yīng)用：包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等51血液學(xué)應(yīng)用：包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞188胞內(nèi)細胞因子的檢測52胞內(nèi)細胞因子的檢測189T細胞亞群分析53T細胞亞群分析190第三節(jié) 免疫酶技術(shù)

（enzymeimmunoassaytechnique）

1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs兩組學(xué)者分別用酶代替放射性同位素制備了酶標(biāo)記試劑，創(chuàng)立了酶免疫分析技術(shù)（enzymeimmunoassay，EIA）。54第三節(jié) 免疫酶技術(shù)

（enzymeimmunoassa191第三節(jié)酶免疫測定法

(enzymeimmunoassay，EIA)酶免疫技術(shù)是通過適當(dāng)?shù)拿复倩瘜W(xué)反應(yīng)和免疫反應(yīng)，使抗體（或抗原）與酶蛋白分子結(jié)合，形成酶標(biāo)抗體（或抗原）,該結(jié)合物保留免疫學(xué)活性的酶活性,因而既有抗原抗體反應(yīng)特異性,又有酶促反應(yīng)的特異性。酶分解底物后的顯色深淺可反映標(biāo)本中抗原或抗體的含量。常用酶：辣根過氧物酶、堿性磷酸酶。常用方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗――ELISA55第三節(jié)酶免疫測定法

(enzymeimmunoass192一、原理E：酶；S:底物；P:有色產(chǎn)物；D1：供氫體；D2：D1的氧化型有色化合物

將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。56一、原理E：酶；S:底物；P:有色產(chǎn)物；D1：供氫體；D193優(yōu)點：①靈敏度高，特異性強；②可定性、定量檢測可溶性抗原和抗體；③試劑穩(wěn)定，保存時長，無同位素污染；④可肉眼半定量，也可儀器（低廉）定量檢測；⑤操作簡便，易于掌握和使用，且重復(fù)性好；⑥可用于定位組織細胞上的抗原或抗體成分。缺點：

標(biāo)記反應(yīng)較難掌握，在操作過程中容易引起酶、抗原或抗體的失活。57優(yōu)點：缺點：194

建立技術(shù)的條件

1．標(biāo)記酶2．免疫酶結(jié)合物的制備3．酶標(biāo)檢測儀58

建立技術(shù)的條件1．標(biāo)記酶195常用的標(biāo)記酶

①辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）②堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）③葡萄糖氧化酶（glucooxidase，Glu）④-D-半乳糖苷（-D-galactosidase，-D-Gal）59常用的標(biāo)記酶①辣根過氧化物酶1966019761198二、基本類型均相酶免疫測定法酶增強免疫技術(shù)；酶減弱免疫技術(shù)；輔基標(biāo)記技術(shù)2.非均相酶免疫測定法

ELISA(直接法、間接法、夾心法、競爭法、抗酶抗體法）1971年建立，稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）62二、基本類型均相酶免疫測定法1971年建立，稱為酶聯(lián)免疫199直接ELISA間接ELISA（用于檢測Ab）63直接ELISA間接ELISA（用于檢測Ab）200directELISA（forAg）64directELISA（forAg）201directELISA（forAb）返回65directELISA（forAb）返回2026620367204返回68返回205

（3）夾心法

（sandwichassay）69（3）夾心法

206夾心法70夾心法207雙夾心法返回71雙夾心法返回2087220973210ELISA雙抗體夾心法(測Ag)間接法(測Ab)加Ab,清洗加Ag形成復(fù)合物，洗滌加該Ag的另一Ab（酶標(biāo)），洗滌加底物，讀數(shù)加Ag，清洗加Ab形成復(fù)合物，洗滌加酶標(biāo)二抗加底物，讀數(shù)聚苯乙烯微量反應(yīng)板74ELISA雙抗體夾心法(測Ag)21175212抗酶抗體法（PAP）76抗酶抗體法（PAP）213血清IgE的檢測實驗材料酶標(biāo)板（聚苯乙烯微量板）馬抗人抗體—（購自北京中山公司）辣根過氧化物酶（）標(biāo)記的馬抗人抗體—待檢血清包被緩沖液：碳酸鈉碳酸氫鈉洗滌液封閉液：溶液反應(yīng)終止液：77血清IgE的檢測214實驗方法包被酶標(biāo)反應(yīng)板：加馬抗人抗體（），孔℃孵育小時后洗滌次，分鐘次，孔，℃過夜孔

↓℃孵育后，洗滌同上酶標(biāo)記抗體：加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗體，孔℃孵育后，洗滌同上底物：加入（鄰苯二胺）溶液，孔

↓室溫分鐘終止液：加入，孔

↓內(nèi)，用酶標(biāo)儀測定各孔值，測定波長實驗結(jié)果

用待測標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均吸收值的比值（）

表示，當(dāng)大于某一數(shù)值時（如）判斷為陽性，數(shù)值的大小依具體檢測要求而定。78215（4）競爭法 a．固相抗體競爭法

b．固相抗原競爭法 79（4）競爭法 a．固相抗體競爭法216

a．固相抗體競爭法80 a．固相抗體競爭法217

b．固相抗原競爭法返回81 b．固相抗原競爭法返回218夾心ELISA競爭ELISA（用于檢測大分子Ag）（用于檢測小分子Ag）82夾心ELISA競爭ELISA（用于檢測大分子Ag）（用于219返回（5）抗體橋聯(lián)法

（immunobridge）83返回（5）抗體橋聯(lián)法

（i220（6）抗酶抗體法

（peroxidase-antiperoxidase，PAP）84（6）抗酶抗體法

（peroxidase-antiper221PO

抗

PO法返回85PO

抗

PO法返回222酶聯(lián)免疫斑點法(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。

86酶聯(lián)免疫斑點法在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)22387224ELISPOT&ELISAELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。88ELISPOT&ELISAELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)225原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。89原理226DirectandIndirectElISPOT

可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞，然后放入已包被的孔中（間接法）。方法選擇基于：1）檢測細胞的類型；2）希望得到的細胞量。若只需少量的細胞因子生成細胞，使用直接法；反之，最好使用間接法。其它步驟一致。90DirectandIndirectElISPOT227ElISPOT操作過程91ElISPOT操作過程228922299323094231操作過程

1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。2.倒去酒精，用100ulPBS洗滌3次。3.將100ul捕獲抗體加入10mlPBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋，4℃過夜。4.倒去液體，100ulPBS洗滌一次。5.每孔加入100ul2%脫脂乳PBS（見試劑準(zhǔn)備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。7.用100ulPBS洗滌一次。8.每孔加入100ul細胞懸浮液（含適當(dāng)量的細胞和相應(yīng)濃度的刺激劑）。細胞可預(yù)先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的96孔板塑料板蓋，37℃CO2孵育箱中孵育一定的時間（15-20小時）。這期間不要晃動或移動孔板。9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。95操作過程1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板23211.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次12.于10mlPBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30分。13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。14.每板以10mlPBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。16.每孔加入100ulBCIP/NBT。17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點數(shù)。4℃下放置一夜，點會比較明顯。9611.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次233972349823599236返回100返回237101238四、通用與放大技術(shù)1．SPA通用系統(tǒng)2．ABC放大系統(tǒng)返回102四、通用與放大技術(shù)1．SPA通用系統(tǒng)返回239（1）SPA的發(fā)現(xiàn)

1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的某些菌株，可與人正常血清在雙相免疫擴散試驗中出現(xiàn)沉淀線。1958年Jensen用離子交換樹脂分析證明，該成分是一種細菌胞壁上不含糖的蛋白質(zhì)，命名為金黃色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA，SPA)103（1）SPA的發(fā)現(xiàn)1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡240Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，為非特異免疫反應(yīng)。生產(chǎn)SPA的國際標(biāo)準(zhǔn)菌株:CowanⅠ株（NcTc8530和ATCC12598）不生產(chǎn)SPA的標(biāo)準(zhǔn)株:Wood46

返回104Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，241（2）顆粒SPA的應(yīng)用

協(xié)同凝集試驗SPA吸收IgG試驗應(yīng)用IgG-SPA制備抗IgG的抗體返回105（2）顆粒SPA的應(yīng)用協(xié)同凝集試驗返回242（3）SPA的標(biāo)記和應(yīng)用

熒光素標(biāo)記SPA及應(yīng)用酶標(biāo)記SPA及應(yīng)用

106（3）SPA的標(biāo)記和應(yīng)用熒光素標(biāo)記SPA及應(yīng)用243酶標(biāo)SPA法返回107酶標(biāo)SPA法返回244ABC放大系統(tǒng)

生物素-親合素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem）

高度特異性高度靈敏性簡單快速安全穩(wěn)定

108ABC放大系統(tǒng)生物素-親合素系統(tǒng)245（1）生物素、親合素、

鏈霉親合素的特性

生物素（biotin，B）又稱維生素H、輔酶R（羧基轉(zhuǎn)化酶的輔酶）

MW244.31