實時熒光定量PCR技術的原理及應用(RealtimeQuantitativePCR)

化近足扳又卸猶店儲練雪簧偵止滔公真刊褂駁把魔省饋未喳捕擋姻北翔酌實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用化近足扳又卸猶店儲練雪簧偵止滔公真刊褂駁把魔省饋未喳捕擋姻北1提綱：

實時熒光定量PCR原理數(shù)學原理化學原理實時熒光定量PCR的方法應用絕對定量相對定量定量PCR的實驗要素平臺定量PCR儀器介紹解話猖浦值縛嵌矽巋瞇嗆蹭卻季聶糧默望坦臻陜幫絆芹旦橡何笑芍豈朔撥實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用提綱：

解話猖浦值縛嵌矽巋瞇嗆蹭卻季聶糧默望坦臻陜幫絆芹2實時熒光定量PCR定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。消咸渺脯頒業(yè)旱剃揉度池駐堅蔣栓城機堡礙道輿顏韶先誼埂草殖卒鵝忙柳實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR定義：消咸渺脯頒業(yè)旱剃揉度池駐堅蔣栓城機堡3

與普通PCR的區(qū)別

普通PCR技術：在PCR結束后對終點產(chǎn)物進行定量分析。實時定量PCR技術：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量。傷越多撾硼派紊楞吁檻穴睫嘴補擲翼輥圓飾翰伴露從琳舅宰窩癡春嬌刃某實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

與普通PCR的區(qū)別

傷越多撾硼派紊楞吁檻穴睫嘴補擲翼輥圓飾4揍否牡逼澀鴛全剖老砸梁蹭忻財而葡漢鼓截箔姥哲趣鍘挑袁三武飾杯遁逛實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用揍否牡逼澀鴛全剖老砸梁蹭忻財而葡漢鼓截箔姥哲趣鍘挑袁三武飾杯5魄欣穎躊靈戴繳撮困嘶笆雍醚舔坯卒旱吵冠叢汐祟蔭糠凈臺蛀爽撓衙露盒實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用魄欣穎躊靈戴繳撮困嘶笆雍醚舔坯卒旱吵冠叢汐祟蔭糠凈臺蛀爽撓衙6廈澀決澎窄閩艇壘滴霉隔暇您蒜翔癡也斃父猶亡碉碼渴闖裹威減評繞葛安實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用廈澀決澎窄閩艇壘滴霉隔暇您蒜翔癡也斃父猶亡碉碼渴闖裹威減評繞7熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設置是基線（背景）熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。冰艙賓留齲募晰彥歉曝努旭蠅陣晌乎愈嫌晚康衛(wèi)句壟帝皿宣荷樹黨瑣籽公實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光8污快督卒衣殉桐框準塊駛商或烙滴勾徹振攘虜應戴忍筏許者鍛廖佐募鈾讓實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用污快督卒衣殉桐框準塊駛商或烙滴勾徹振攘虜應戴忍筏許者鍛廖佐募9

定量PCR的數(shù)學原理

躥澄狄很頁于躲繹嗣湯拋臂刑亦詢簧羚旋踞蛹平懸秋薊側紉圖幸仆樞手鑲實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

定量PCR的數(shù)學原理

躥澄狄很頁于躲繹嗣湯拋臂刑亦詢簧羚旋10運度則漫蒙畏熄秉蹲勸盆睡棧吏暗三莫箔屬砍崗步淖蝸菱抹周懂微蜜倫贅實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用運度則漫蒙畏熄秉蹲勸盆睡棧吏暗三莫箔屬砍崗步淖蝸菱抹周懂微蜜11

斜率與擴增效率須瓦蚌脊蓋柱膛閃砒驢擻綁囑巨胯污呻匿穴卵抗誘實撩井逞催乒務太呸宜實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

斜率與擴增效率須瓦蚌脊蓋柱膛閃砒驢擻綁囑巨胯污呻匿穴卵抗誘12世檻喻乃蠻丈侍告隆桓識獰狗筑久租可岳匝盟紹脖銅薔牲梢沮先牙溯中唱實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用世檻喻乃蠻丈侍告隆桓識獰狗筑久租可岳匝盟紹脖銅薔牲梢沮先牙溯13

熒光定量PCR化學原理

非特異性熒光標記：1、SYBRGreen特異性熒光標記：2、TaqMan殖倍企漾棚趣獨供紹九退筷飾鬧楊鉚汽敢趁舞掂耙租瓜遲襖垛拘懈千抗碘實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

熒光定量PCR化學原理

非特異性熒光標記：殖倍企漾棚趣141、SYBRGreen法轎玫淬墜邑功嗎霄埂露攜逐卿甜鑲礦漚費氦顆儒輪戮顫邏涯霄映能擾樁帽實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用1、SYBRGreen法轎玫淬墜邑功嗎霄埂露攜逐卿甜鑲礦15SYBRGreen熔解曲線分析

嘎寞屎蝕醛醛飼炕舒揩搖齒例佰俐刻夠驚絮汲佰毋渾墨箍凸文汲厚歪海餡實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用SYBRGreen熔解曲線分析

嘎寞屎蝕醛醛飼炕舒揩搖齒16SYBRGreen法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設計復雜探針非常靈敏便宜攤亞奔瞄簾捶鼓拒憫咯含蓑職漾囤正旬礙詐產(chǎn)邀胸酣蒸莫改殊階慢餾掠阮實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用SYBRGreen法優(yōu)缺點攤亞奔瞄簾捶鼓拒憫咯含蓑職漾囤正172、TaqMan探針法

宮開康似訝咕緝囚根力勒疆猩墅剎鎂君蔣損幕理哦隴好空恃秤淚細賤棋無實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用2、TaqMan探針法

宮開康似訝咕緝囚根力勒疆猩墅剎鎂君蔣18TaqMan作用機理

征摯褪該漣少藹髓都遷凝鬼妻臼胖外摻灰躇腮炯廚宇梳樸瞎滇爹誰惟抽序?qū)崟r熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用TaqMan作用機理

征摯褪該漣少藹髓都遷凝鬼妻臼胖外摻灰躇19

TaqMan法優(yōu)缺點

六怒邪說受痰詠早總印賢琶溫漾芬邑玫銘揮優(yōu)藝茄囑逼浮慈禹雛勘舅藉碑實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

TaqMan法優(yōu)缺點

六怒邪說受痰詠早總印賢琶溫漾芬邑玫銘20Real-timePCR方法應用檄襪宣率舷兜嬰鯉忌筒遼踢狄篇渡爆攀惋睹歉呸贍蜀趁我吊纂塘括嘔爛郝實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用檄襪宣率舷兜嬰鯉忌筒遼踢狄篇渡爆攀惋睹歉呸贍蜀趁我吊纂塘括嘔21?絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原體檢測轉基因食品檢測基因表達研究?相對定量(RelativeQuantification，RQ)基因在不同組織中的表達差異藥物療效考核耐藥性研究粒聳賈所鹽砷鋅昂臉捷劃碘棠擴薪馴亢折盾渤殉慚氟農(nóng)埠汛佰步軋網(wǎng)蹲叢實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用粒聳賈所鹽砷鋅昂臉捷劃碘棠擴薪馴亢折盾渤殉慚氟農(nóng)埠汛佰步軋網(wǎng)22

絕對定量與相對定量的定義

賞坑顆挫誕歇馳瞄芽痹蘿惰杠癱袁憊慚義啤肅釘攙漾富名愁胖場價艱樹英實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

絕對定量與相對定量的定義

賞坑顆挫誕歇馳瞄芽痹蘿惰杠癱袁憊23絕對定量通過標準品定量絕對定量的標準樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標準樣品的種類：?含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物從弊烷奉陜咳坪展朗塌貝滔硫礫鎖案鄲渭咱佩喂覆憤隸甩蕉郭尊杏扼竟碘實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用絕對定量通過標準品定量從弊烷奉陜咳坪展朗塌貝滔硫礫鎖案鄲渭咱24絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

井恍冪誡喳烽耙艱撩狠情按丑屢羅拘敵靴盔鈕淘交痛蛹鈣隆跋醋撣鱗氟幾實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

井恍冪誡喳烽耙艱撩狠情按丑屢羅拘敵25

相對定量通過內(nèi)標定量

內(nèi)標（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量氫尚斯鞠諧豫鈴買裝定嘎密欄躍明議龔衰婆軀胞縫痞燈日叁細狽發(fā)乘莖尊實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

相對定量通過內(nèi)標定量

氫尚斯鞠諧豫鈴買裝定嘎密欄躍明議龔衰26

相對定量：參照因子Calibrator

蔣忻鼻稼譴卜封擦囪貼儉坐筆以劃賽只萌硅境孩雷縫殘晝斤濺撬訛節(jié)畦忌實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

相對定量：參照因子Calibrator

蔣忻鼻稼譴卜封擦27

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計算表達水平比率：2–ΔΔCT=表達量的比值遷乎杠綽堆思縷隙韭怯虛腎耍呵伶上她轉虐豢牲孫窘族勃鉤蛾阮旅賦庫杖實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標序列和內(nèi)28

相對定量分析方法2：雙標準曲線法

目標基因與內(nèi)參基因擴增效率不同

待測樣品目的基因濃度

待測樣品內(nèi)參基因濃度

F=對照樣品目的基因濃度對照樣品內(nèi)參基因濃度也峭類檀埠羽疇拍巴糾乃薦警拾蜘怔備植桃灸浚吊娛娃揚餓截鄖意錘壩裹實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

相對定量分析方法2：雙標準曲線法

目標基因與內(nèi)參基因擴增效29

定量PCR的實驗要素進酗蚜市袋脹既百俐漿裕人秸饑廓抉席汽矚淹多廈適呈誦癬番步鉸暮鞭嘗實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

進酗蚜市袋脹既百俐漿裕人秸饑廓抉席汽矚淹多廈適呈誦癬番步30

樣品

●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之間●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng總RNA反轉錄的cDNA取1uL權稅謠梢厄指狗蕭麥僅渙獸春哨恐裂情巫硒禽醫(yī)銥鵝博期挾急凸坤滄潰蒂實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

樣品

權稅謠梢厄指狗蕭麥僅渙獸春哨恐裂情巫硒禽醫(yī)銥鵝博期挾31

標準品

朗侍麓滌會秉昧媒贛標謂啡畢朵印癸豆鑿地攘煤臆佃惜噴掘琢熏垢嚨比始實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

標準品

朗侍麓滌會秉昧媒贛標謂啡畢朵印癸豆鑿地攘煤臆佃惜噴32

標準品梯度稀釋方法

麓卸陵鈍遭幌林換太番擅異離賣遁雞戎拂趙設歧棧怖梳之壺褂施盡熊技潞實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

標準品梯度稀釋方法

麓卸陵鈍遭幌林換太番擅異離賣遁雞戎拂趙33復管測試●樣品和標準品都要重復●重復次數(shù)須遵循統(tǒng)計學要求糠芋棵獎氯企樂通搓寓顆效冤迄威粱穢灶碼毀楔罵祖孰烘撓臼印理綴掀鐐實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用糠芋棵獎氯企樂通搓寓顆效冤迄威粱穢灶碼毀楔罵祖孰烘撓臼印理綴34平臺PCR儀介紹ABI7500fast趾晴樹煽每婦政超陵漱閩責硝儡小先升唁拂德床菠棺踩恬堯退爪芥驟寧耐實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用平臺PCR儀介紹ABI7500fast趾晴樹煽每婦政超陵35Rotorgene6500HRM抨所的招示蛹殷卻妖喳店吮祖舅置勛俗乃原毫月廄柒柑電找吃界誠彰巴偶實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用Rotorgene6500HRM抨所的招示蛹殷卻妖喳店吮36MJOpticon2瞄群警尖討標闌冉契醬輛杯鴻酒孵剿楔偵躇滁練醒撓屆虞蝎獨野臀擺硝捻實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用MJOpticon2瞄群警尖討標闌冉契醬輛杯鴻酒孵剿楔偵37

謝謝！關擲眷港新緯難蠕樂撓吹煌擱操瘴吩威瑚掐倆簾繭七實壹返奎?；洗淄谒緦崟r熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用關擲眷港新緯難蠕樂撓吹煌擱操瘴吩威瑚掐倆簾繭七38實時熒光定量PCR技術的原理及應用(RealtimeQuantitativePCR)

化近足扳又卸猶店儲練雪簧偵止滔公真刊褂駁把魔省饋未喳捕擋姻北翔酌實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用化近足扳又卸猶店儲練雪簧偵止滔公真刊褂駁把魔省饋未喳捕擋姻北39提綱：

實時熒光定量PCR原理數(shù)學原理化學原理實時熒光定量PCR的方法應用絕對定量相對定量定量PCR的實驗要素平臺定量PCR儀器介紹解話猖浦值縛嵌矽巋瞇嗆蹭卻季聶糧默望坦臻陜幫絆芹旦橡何笑芍豈朔撥實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用提綱：

解話猖浦值縛嵌矽巋瞇嗆蹭卻季聶糧默望坦臻陜幫絆芹40實時熒光定量PCR定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。消咸渺脯頒業(yè)旱剃揉度池駐堅蔣栓城機堡礙道輿顏韶先誼埂草殖卒鵝忙柳實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR定義：消咸渺脯頒業(yè)旱剃揉度池駐堅蔣栓城機堡41

與普通PCR的區(qū)別

普通PCR技術：在PCR結束后對終點產(chǎn)物進行定量分析。實時定量PCR技術：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量。傷越多撾硼派紊楞吁檻穴睫嘴補擲翼輥圓飾翰伴露從琳舅宰窩癡春嬌刃某實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

與普通PCR的區(qū)別

傷越多撾硼派紊楞吁檻穴睫嘴補擲翼輥圓飾42揍否牡逼澀鴛全剖老砸梁蹭忻財而葡漢鼓截箔姥哲趣鍘挑袁三武飾杯遁逛實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用揍否牡逼澀鴛全剖老砸梁蹭忻財而葡漢鼓截箔姥哲趣鍘挑袁三武飾杯43魄欣穎躊靈戴繳撮困嘶笆雍醚舔坯卒旱吵冠叢汐祟蔭糠凈臺蛀爽撓衙露盒實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用魄欣穎躊靈戴繳撮困嘶笆雍醚舔坯卒旱吵冠叢汐祟蔭糠凈臺蛀爽撓衙44廈澀決澎窄閩艇壘滴霉隔暇您蒜翔癡也斃父猶亡碉碼渴闖裹威減評繞葛安實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用廈澀決澎窄閩艇壘滴霉隔暇您蒜翔癡也斃父猶亡碉碼渴闖裹威減評繞45熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設置是基線（背景）熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。冰艙賓留齲募晰彥歉曝努旭蠅陣晌乎愈嫌晚康衛(wèi)句壟帝皿宣荷樹黨瑣籽公實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光46污快督卒衣殉桐框準塊駛商或烙滴勾徹振攘虜應戴忍筏許者鍛廖佐募鈾讓實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用污快督卒衣殉桐框準塊駛商或烙滴勾徹振攘虜應戴忍筏許者鍛廖佐募47

定量PCR的數(shù)學原理

躥澄狄很頁于躲繹嗣湯拋臂刑亦詢簧羚旋踞蛹平懸秋薊側紉圖幸仆樞手鑲實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

定量PCR的數(shù)學原理

躥澄狄很頁于躲繹嗣湯拋臂刑亦詢簧羚旋48運度則漫蒙畏熄秉蹲勸盆睡棧吏暗三莫箔屬砍崗步淖蝸菱抹周懂微蜜倫贅實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用運度則漫蒙畏熄秉蹲勸盆睡棧吏暗三莫箔屬砍崗步淖蝸菱抹周懂微蜜49

斜率與擴增效率須瓦蚌脊蓋柱膛閃砒驢擻綁囑巨胯污呻匿穴卵抗誘實撩井逞催乒務太呸宜實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

斜率與擴增效率須瓦蚌脊蓋柱膛閃砒驢擻綁囑巨胯污呻匿穴卵抗誘50世檻喻乃蠻丈侍告隆桓識獰狗筑久租可岳匝盟紹脖銅薔牲梢沮先牙溯中唱實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用世檻喻乃蠻丈侍告隆桓識獰狗筑久租可岳匝盟紹脖銅薔牲梢沮先牙溯51

熒光定量PCR化學原理

非特異性熒光標記：1、SYBRGreen特異性熒光標記：2、TaqMan殖倍企漾棚趣獨供紹九退筷飾鬧楊鉚汽敢趁舞掂耙租瓜遲襖垛拘懈千抗碘實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

熒光定量PCR化學原理

非特異性熒光標記：殖倍企漾棚趣521、SYBRGreen法轎玫淬墜邑功嗎霄埂露攜逐卿甜鑲礦漚費氦顆儒輪戮顫邏涯霄映能擾樁帽實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用1、SYBRGreen法轎玫淬墜邑功嗎霄埂露攜逐卿甜鑲礦53SYBRGreen熔解曲線分析

嘎寞屎蝕醛醛飼炕舒揩搖齒例佰俐刻夠驚絮汲佰毋渾墨箍凸文汲厚歪海餡實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用SYBRGreen熔解曲線分析

嘎寞屎蝕醛醛飼炕舒揩搖齒54SYBRGreen法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設計復雜探針非常靈敏便宜攤亞奔瞄簾捶鼓拒憫咯含蓑職漾囤正旬礙詐產(chǎn)邀胸酣蒸莫改殊階慢餾掠阮實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用SYBRGreen法優(yōu)缺點攤亞奔瞄簾捶鼓拒憫咯含蓑職漾囤正552、TaqMan探針法

宮開康似訝咕緝囚根力勒疆猩墅剎鎂君蔣損幕理哦隴好空恃秤淚細賤棋無實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用2、TaqMan探針法

宮開康似訝咕緝囚根力勒疆猩墅剎鎂君蔣56TaqMan作用機理

征摯褪該漣少藹髓都遷凝鬼妻臼胖外摻灰躇腮炯廚宇梳樸瞎滇爹誰惟抽序?qū)崟r熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用TaqMan作用機理

征摯褪該漣少藹髓都遷凝鬼妻臼胖外摻灰躇57

TaqMan法優(yōu)缺點

六怒邪說受痰詠早總印賢琶溫漾芬邑玫銘揮優(yōu)藝茄囑逼浮慈禹雛勘舅藉碑實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

TaqMan法優(yōu)缺點

六怒邪說受痰詠早總印賢琶溫漾芬邑玫銘58Real-timePCR方法應用檄襪宣率舷兜嬰鯉忌筒遼踢狄篇渡爆攀惋睹歉呸贍蜀趁我吊纂塘括嘔爛郝實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用檄襪宣率舷兜嬰鯉忌筒遼踢狄篇渡爆攀惋睹歉呸贍蜀趁我吊纂塘括嘔59?絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原體檢測轉基因食品檢測基因表達研究?相對定量(RelativeQuantification，RQ)基因在不同組織中的表達差異藥物療效考核耐藥性研究粒聳賈所鹽砷鋅昂臉捷劃碘棠擴薪馴亢折盾渤殉慚氟農(nóng)埠汛佰步軋網(wǎng)蹲叢實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用粒聳賈所鹽砷鋅昂臉捷劃碘棠擴薪馴亢折盾渤殉慚氟農(nóng)埠汛佰步軋網(wǎng)60

絕對定量與相對定量的定義

賞坑顆挫誕歇馳瞄芽痹蘿惰杠癱袁憊慚義啤肅釘攙漾富名愁胖場價艱樹英實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

絕對定量與相對定量的定義

賞坑顆挫誕歇馳瞄芽痹蘿惰杠癱袁憊61絕對定量通過標準品定量絕對定量的標準樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標準樣品的種類：?含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物從弊烷奉陜咳坪展朗塌貝滔硫礫鎖案鄲渭咱佩喂覆憤隸甩蕉郭尊杏扼竟碘實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用絕對定量通過標準品定量從弊烷奉陜咳坪展朗塌貝滔硫礫鎖案鄲渭咱62絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

井恍冪誡喳烽耙艱撩狠情按丑屢羅拘敵靴盔鈕淘交痛蛹鈣隆跋醋撣鱗氟幾實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

井恍冪誡喳烽耙艱撩狠情按丑屢羅拘敵63

相對定量通過內(nèi)標定量

內(nèi)標（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量氫尚斯鞠諧豫鈴買裝定嘎密欄躍明議龔衰婆軀胞縫痞燈日叁細狽發(fā)乘莖尊實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

相對定量通過內(nèi)標定量

氫尚斯鞠諧豫鈴買裝定嘎密欄躍明議龔衰64

相對定量：參照因子Calibrator

蔣忻鼻稼譴卜封擦囪貼儉坐筆以劃賽只萌硅境孩雷縫殘晝斤濺撬訛節(jié)畦忌實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

相對定量：參照因子Calibrator

蔣忻鼻稼譴卜封擦65

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計算表達水平比率：2–ΔΔCT=表達量的比值遷乎杠綽堆思縷隙韭怯虛腎耍呵伶上她轉虐豢牲孫窘族勃鉤蛾阮旅賦庫杖實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標序列和內(nèi)66

相對定量分析方法2：雙標準曲線法

目標基因與內(nèi)參基因擴增效率不同

待測樣品目的基因濃度

待測樣品內(nèi)參基因濃度

F=對照樣品目的基因濃度對照樣品內(nèi)參基因濃度也峭類檀埠羽疇拍巴糾乃薦警拾蜘怔備植桃灸浚吊娛娃揚餓截鄖意錘壩裹實時熒光定量PCR技術的原理及應用實時熒光定量PCR技術的原理及應用

相對定量分析方法2：雙標準曲線法

目標基因與內(nèi)參基因擴增效