第六章

氨基酸代謝與調(diào)控

生命科學(xué)學(xué)院

胡慶森6.1天冬氨酸族氨基酸的合成途徑6.2天冬氨酸族氨基酸的調(diào)控機(jī)制6.3微生物發(fā)酵法生產(chǎn)賴(lài)氨酸的育種技術(shù)6.4微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蘇氨酸的育種技術(shù)6.1.1天冬氨酸族氨基酸主要種類(lèi)

6.1天冬氨酸族氨基酸的合成途徑2022/12/56.1.2天冬氨酸族氨基酸的生物合成途徑葡萄糖EMP磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸CO2轉(zhuǎn)氨酶

CO2乙酰CoATCA丙酮酸α-酮戊二酸

谷氨酸2022/12/56.2.1天冬氨酸族氨基酸生物合成的代謝調(diào)控機(jī)制

大腸桿菌與谷氨酸棒狀桿菌和黃色短桿菌代謝調(diào)節(jié)機(jī)制不同，本課程以谷氨酸棒狀桿菌和黃色短桿菌為例講解。2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸二氫吡啶-2,6-二羧酸L-賴(lài)氨酸L-高絲氨酸L-蘇氨酸L-異亮氨酸O-琥珀酰-高絲氨酸L-蛋氨酸天冬氨酸半醛①關(guān)鍵酶②優(yōu)先合成③代謝互鎖④平衡合成⑤Asp與Glu之間調(diào)節(jié)機(jī)制Leu?代謝調(diào)控機(jī)制2022/12/5葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酰磷酸Asp乙酰CoACO2Ala,Val,LeuTCA循環(huán)CO2ATP脂肪酸ThrLysLeu激活反饋抑制阻遏α-酮戊二酸谷氨酸2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸二氫吡啶-2,6-二羧酸L-賴(lài)氨酸L-高絲氨酸L-蘇氨酸L-異亮氨酸O-琥珀酰-高絲氨酸L-蛋氨酸天冬氨酸半醛???6.2.2賴(lài)氨酸高產(chǎn)菌株選育模式簡(jiǎn)圖2022/12/5Corynebacteriumglutamicum2022/12/51、切斷或削弱支路代謝

選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型：①Hom-

：培養(yǎng)基中限量添加高絲氨酸（或Met+Thr)可解除蘇氨酸、賴(lài)氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的協(xié)同反饋抑制使賴(lài)氨酸得以積累。②Thr-（或Met-）：培養(yǎng)基中限量添加Thr（或Met）第一種方法最直接，最常用2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高絲氨酸蘇氨酸蛋氨酸二氨基庚二酸賴(lài)氨酸○○○α-酮丁酸異亮氨酸Hom-協(xié)同反饋抑制2022/12/52、解除反饋調(diào)節(jié)解除代謝產(chǎn)物對(duì)關(guān)鍵酶的關(guān)鍵抑制和阻遏。從葡萄糖到合成Lys過(guò)程中，有三個(gè)關(guān)鍵的酶起限速反應(yīng)，要設(shè)法解除這些關(guān)鍵酶對(duì)Lys的消極影響。2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高絲氨酸蘇氨酸蛋氨酸二輕吡啶二羧酸賴(lài)氨酸○○○α-酮丁酸異亮氨酸Hom-協(xié)同反饋抑制AKACPS磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖亮氨酸代謝互鎖反饋抑制AC:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；AK:天冬氨酸激酶；PS:二輕吡啶二羧酸合成酶2022/12/5⑴天冬氨酸激酶反饋調(diào)節(jié)的解除選育Thr或Lys的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株

Lys的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物：

S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)Thr的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物：α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)2022/12/5⑵磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的激活葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酰磷酸Asp乙酰CoACO2Ala,Val,LeuTCA循環(huán)CO2ATP脂肪酸ThrLys?α-酮戊二酸谷氨酸?PDHPC2022/12/5④適量VH激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶此處生物素有兩個(gè)功能(利用優(yōu)先合成和激活)⑤琥珀酸生長(zhǎng)旺盛的突變株⑥谷氨酸敏感型菌株⑦基因工程菌構(gòu)建檸檬酸合成酶活力低或丙酮酸激酶缺陷的菌株①-⑦都是為了增加PC的活力或切斷代謝之路，以積累生成Lys的前體物質(zhì)，為提高賴(lài)氨酸產(chǎn)量做準(zhǔn)備。2022/12/53、解除代謝互鎖葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酰磷酸Asp乙酰CoACO2Ala,Val,LeuTCA循環(huán)CO2ATP脂肪酸ThrLysLeu激活反饋抑制阻遏α-酮戊二酸DDP合成酶2022/12/5⑶選育Leu溫度敏感突變株⑷選育對(duì)苯醌或喹啉衍生物敏感的菌株

實(shí)際上是篩選Leu滲漏突變株6’-(S)-羧基-3’-硫-7-氮-2,3-環(huán)庚酸萘-4,4-苯醌（PX）PX是生物合成Leu酶系抑制劑AJ11091（AECr+CCLr+Ala-+PXs）47g/LAJ11097（AECr+Ala-+PXs）42g/LCCL:α-氯已內(nèi)酰胺⑸篩選萘乙酸(生長(zhǎng)素)缺陷突變株Cl

CCL2022/12/54、改變細(xì)胞膜的通透性乳糖發(fā)酵短桿菌（AECr）發(fā)酵產(chǎn)生的Lys是通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸系統(tǒng)排出細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)物。當(dāng)外界環(huán)境出現(xiàn)高濃度Lys時(shí)（5倍），乳糖發(fā)酵短桿菌還能排出產(chǎn)物，比酵母菌和大腸桿菌具有發(fā)酵Lys的優(yōu)勢(shì)。2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高絲氨酸蘇氨酸異亮氨酸蛋氨酸賴(lài)氨酸激酶協(xié)同反饋抑制二氨基庚二酸（DAP）α-酮丁酸丙氨酸協(xié)同反饋抑制丙酮酸葡萄糖L-氨基酸α-酮酸丙酮酸?Ala-?Ala-EMP2022/12/5葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酰磷酸AspCO2Ala,Val,LeuTCA循環(huán)CO2ATP脂肪酸ThrLysα-酮戊二酸①②???檸檬酸2022/12/5使兩條路徑的代謝流達(dá)到平衡，以實(shí)現(xiàn)Lys的高產(chǎn)的措施：①氟丙酮酸敏感突變株：丙酮酸激酶活力低②異檸檬酸合成酶活力較低的突變株③添加過(guò)量生物素和增加谷氨酸的反饋調(diào)節(jié)通過(guò)PEP羧化反應(yīng)：1molglucose-------------1molLys通過(guò)TCA途徑：2molglucose-------------1molLys2022/12/57、選育脲酶回復(fù)突變株谷氨酸棒狀桿菌A11（Hom-+AECr+Urase-）Au111-2（Hom-+AECr+Urase+）Lys產(chǎn)量增加25%，糖轉(zhuǎn)化率提高15%N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍誘變

2022/12/58利用基因工程技術(shù)構(gòu)建賴(lài)氨酸工程菌株①谷氨酸棒狀桿菌的二氫吡啶二羧酸合成酶（DDP合成酶）在大腸桿菌中表達(dá)(12.2g/LLys)。②法國(guó)巴黎大學(xué)Richamd等人將參與生成Lys的基因分別在高拷貝數(shù)的質(zhì)粒pBR322上克隆，利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOCR21,另外通過(guò)突變處理，改變了天冬氨酸激酶，該功能工程菌產(chǎn)量提高5倍。2022/12/5天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛高絲氨酸蘇氨酸異亮氨酸蛋氨酸賴(lài)氨酸二氨基庚二酸（DAP）α-酮丁酸2022/12/56.3.2選育蘇氨酸生產(chǎn)菌的方法1、切斷支路代謝選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株（或營(yíng)養(yǎng)滲漏缺陷型，營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株）是積累蘇氨酸的有效措施。2022/12/5◎DAP-+Met-E.coli(4g/L)◎Met-E.coliAS1.358K1-73(3.5g/L)◎AHVrE.coliLR-1458(1g/L)◎AHVr+Met-E.coliLRA-96(3.5g/L)◎DAP-+Met-+Ile-E.coliKY8280(13.8g/L)2022/12/5Leu阻遏PSPS:(二氫吡啶二羧酸合成酶)乳酸發(fā)酵短桿菌AECr+AHVrBrevibacteriumlactofermentumLys+Thr13g/L培養(yǎng)基中添加Leu（大于1g/L）Thr進(jìn)一步增加M-15（Metsr）Thr:Lys=17.4g/L：8.6g/L2022/12/52、解除反饋調(diào)節(jié)協(xié)同反饋抑制協(xié)同反饋抑制AKHD反饋抑制解決協(xié)同反饋抑制和反饋抑制這兩個(gè)主要問(wèn)題，才能大量積累蘇氨酸2022/12/5黃色短桿菌Brevibacteriumflavum◎AHVr:14g/L工業(yè)上最早應(yīng)用結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株的實(shí)例

◎

AHVr+Met-+Lys-:注意培養(yǎng)基中要添加適量Met和LysAHVr+Met-:注意培養(yǎng)基中添加過(guò)量Met（10g/L）,合成18g/LThr.優(yōu)先機(jī)制運(yùn)用2022/12/5谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)

CorynebacteriumglutamicumKY10440Met-+AHVr+AECr10%的葡萄糖培養(yǎng)基,產(chǎn)量14g/LThr2022/12/5Asp產(chǎn)生菌No.70BK29DK330HDrPS-50μg/mLNTG處理100μg/mLNTG處理12g/LAHV平板5g/LDAP12g/L(14g/L)AHV平板8.6g/LDB185DB12216.5g/L16.6g/L2022/12/53、增加前體物天冬氨酸的合成（1）選育天冬氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株P(guān)C:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶天冬氨酸氧肟酸鹽抗性突變株AspSulfonamides

2022/12/5(2)選育丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株日本味之素（味の素）株式會(huì)社是世界上最大的氨基酸供應(yīng)商之一，味之素不但生產(chǎn)賴(lài)氨酸，而且蘇氨酸、色氨酸的生產(chǎn)量在世界上都是最大的。目前味之素已在全球22個(gè)國(guó)家設(shè)有生產(chǎn)基地，產(chǎn)品銷(xiāo)售覆蓋130多個(gè)國(guó)家。乳糖發(fā)酵短桿菌AJ11180AHVr+Ala-:11g/L原菌株僅僅為7.2g/L2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高絲氨酸蘇氨酸異亮氨酸蛋氨酸賴(lài)氨酸激酶協(xié)同反饋抑制二氨基庚二酸（DAP）α-酮丁酸丙氨酸協(xié)同反饋抑制丙酮酸葡萄糖L-氨基酸α-酮酸丙酮酸?Ala-?Ala-EMP2022/12/5(3)強(qiáng)化從丙酮酸到蘇氨酸的代謝流①選育氟丙酮酸FPs突變株丙酮酸激酶活力低，便于積累磷酸烯醇式丙酮酸②選育以琥珀酸為唯一碳源生長(zhǎng)良好的菌株固定CO2能力強(qiáng)③利用基因工程削弱或消除丙酮酸激酶和檸檬酸合成酶的酶活④培養(yǎng)基中添加適量生物素（0.02-5g/L）激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2022/12/5乙酰CoA檸檬酸草酰乙酸琥珀酸α-酮戊二酸異檸檬酸蘋(píng)果酸乙醛酸

①①檸檬酸合成酶②磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶③丙酮酸羧化酶④丙酮酸激酶延胡索酸②磷酸烯醇式丙酮酸

丙酮酸

乙酰CoA葡萄糖

CO2③④⑥Asp2022/12/5(4)谷氨酸合成的優(yōu)先轉(zhuǎn)化選育谷氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物敏感突變株◎谷氨酸氧肟酸鹽敏感突變株◎供給過(guò)量的生物素◎青霉素抗性突變株P(guān)C:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶黃色短桿菌2022/12/5（5）利用平衡合成乙醇乙酸黃色短桿菌B.flavumBBM-21(AHVr+Met-)◎主要碳源葡萄糖：18g/L◎主要碳源醋酸：27g/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2022/12/5（6）選育維生素P抗性突變株Vp對(duì)Vp有抗性的短桿菌和棒桿菌也能提高蘇氨酸產(chǎn)量，可能與改變細(xì)胞膜透性有關(guān)。實(shí)例：菌株：B.flavumAJ11584培養(yǎng)基：15%葡萄糖；0.3%KH2PO4;1%(NH4)2SO4;微量Mg2+,Mn2+,Fe2+;大豆蛋白水解液；VB1(TPP);VH(激活);Leu（抑制）培養(yǎng)基32oC發(fā)酵，Thr得率20g/L.2022/12/54、切斷蘇氨酸的進(jìn)一步代謝途徑◎選育Ile-營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株◎選育IleL缺陷型突變株◎選育Ile-營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株?E.coliATCC21151(DAP-+Ile-):10.2g/LProteusrettgeri埃氏變形桿菌(Ile-):16g/L2022/12/55、運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)選育蘇氨酸生產(chǎn)菌（1）利用轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法選育蘇氨酸生產(chǎn)菌野生菌D60（TDH-+TD-）D60+羥纈氨酸抗性hnrB2HNr59AKI,HDI阻遏解除AKI,HDI去阻遏AECr174AKIII解除反饋調(diào)節(jié)Thr-Thr-N-11E-60T693(25g/L)AKI,HDII阻遏解除Etr-1T1026(40g/L)四重標(biāo)記六重標(biāo)記2022/12/5（2）利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育蘇氨酸生產(chǎn)菌乳糖發(fā)酵桿菌AJ11786黃色短桿菌AJ11784AECr+AHVs+Leu-+Ile+AECs+AHVr+Leu++Ile-Thr+LysThr乳糖發(fā)酵桿菌AJ11787不產(chǎn)乳酸Lys-17.4g/L18g/LAECr+AHVr+Leu-+Ile-2022/12/5(3)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建蘇氨酸工程菌A1A2BC天冬氨酸激酶I高絲氨酸脫氫酶I高絲氨酸激酶蘇氨酸合成酶調(diào)節(jié)區(qū)天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高絲氨酸高絲氨酰磷酸蘇氨酸t(yī)hrA1A2BC0蘇氨酸衰減子調(diào)控機(jī)制（翻譯水平上調(diào)控）前導(dǎo)肽可以配對(duì)序列：A-A;B-B(衰減子);C-C前導(dǎo)肽含有Thr和Ile殘基AKHD2022/12/5提高Thr最根本的方法就是將合成途徑中起限制作用的限速酶HD和AK基因鏈接在多拷貝的載體質(zhì)粒上并克隆表達(dá)，解除合成途徑的瓶頸效應(yīng)，提高蘇氨酸產(chǎn)量。IF=9.667

2022/12/5OverallsystemsmetabolicengineeringstrategiesemployedforthedevelopmentofageneticallydefinedThr-overproducing

E.colistrain.CentralmetabolicpathwaysthatleadtobiosynthesisofThrtogetherwiththeregulatorycircuitsandcompetingpathwaysareshown.Theshadedboxesrepresentthetargetedmutationsintroducedintothegenome.ThegrayXsindicatethatthegenesareknockedoutortheinhibition/repressionisremoved.Thickredarrowsindicatetheincreasedfluxoractivitybydirectlyoverexpressingthecorrespondinggenes.Dashedlineindicatesrepressionregulation.Dottedlinesindicatefeedbackinhibition.2022/12/52022/12/5

◎FeedbackinhibitionsofaspartokinaseIandIIIwereremovedbyreplacingthe1034thbaseCwithT(Ser345-Phe)inthethrAgeneandthe1055thbaseCwithT(Thr342-Ile)inthelysCgene.◎TranscriptionalattenuationwasremovedbyreplacingthenativepromoterofthethrABCoperonwiththetacpromoter,whichallowsconstitutiveexpressioninlacI-mutantstrain.◎Next,thepathwaysthatcompetewithThrformationanddegradeThrwereremovedbydeletingthelysA(encodingdiaminopimelatedecarboxylase),metA(encodinghomo