組織制片技術(shù)組織制片技術(shù)1組織制片技術(shù)的概述組織制片技術(shù)的方法組織制片技術(shù)的基本程序蘇木精—伊紅染色組織制片技術(shù)的概述2組織制片技術(shù)的發(fā)展史

從16世紀60年代Hook發(fā)明顯微鏡，開始觀察和描述軟木塞中的細胞至今，組織制片技術(shù)隨著生命科學的發(fā)展而不斷進步。組織制片技術(shù)的發(fā)展史3組織制片技術(shù)的發(fā)展史

在19世紀中期，隨著生物、物理和化學等學科的飛速發(fā)展，以及顯微鏡和切片機的逐步完善，組織學也建立起一整套完整科學的組織制片技術(shù)。組織制片技術(shù)的發(fā)展史4組織制片技術(shù)的發(fā)展史

特別是20世紀50年代以來，由于組織化學、免疫組織化學等新技術(shù)和新儀器的出現(xiàn)，使組織制片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域進入了一個嶄新的時期。組織制片技術(shù)的發(fā)展史5利用組織制片技術(shù)的方法所制出的標本，顯示了組織細胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)、組織細胞之間的相互連接及組織細胞中的某些化學成分的種類和含量。組織制片是研究醫(yī)學和生物學的一個最基本的手段。組織制片的意義和目的利用組織制片技術(shù)的方法所制出的標本，顯示了6組織制片技術(shù)的方法

非組織切片法組織切片法組織制片技術(shù)的方法非組織切片法7非組織切片法組織不經(jīng)過切片制成觀察標本的方法。非組織切片法的種類涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離標本、活體標本、整裝標本、血管注射標本。非組織切片法8涂片將所采的血液、骨髓或者脫落細胞涂抹于載玻片上經(jīng)瑞氏、姬姆薩染色、常規(guī)HE染色。涂片將所采的血液、骨髓或者脫落細胞涂抹于載玻片上9壓片

先將組織處理成小塊物質(zhì)，然后用化學藥品進行軟化和染色，再用蓋玻片壓封于載玻片上。例如運動終板和寄生蟲標本等。壓片先將組織處理成小塊物質(zhì)，然后用化學藥品進行軟化10鋪片：將需要觀察的薄片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后經(jīng)過固定、染色等程序制成。例如蛙的腸系膜鋪片，大白鼠的皮下組織鋪片等。鋪片：將需要觀察的薄片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后11磨片：對于骨，牙齒等組織，不經(jīng)脫鈣和切片，直接在磨石上用手工磨成大約50微米左右的薄片，然后再進行染色封固在載玻片上。磨片：對于骨，牙齒等組織，不經(jīng)脫鈣和切片，直接在磨石上用手工12消化分離標本：先將組織分離成小塊，然后利用相應(yīng)的化學物質(zhì)將細胞間質(zhì)消化溶解，再用機械分離的方法，如水的震蕩沖擊力，使小塊組織分離成單個而又完整的細胞，經(jīng)染色后涂于載玻片上進行封固。例如平滑肌分離標本，脊髓的運動神經(jīng)細胞等。消化分離標本：先將組織分離成小塊，然后利用相應(yīng)的化學物質(zhì)將細13活體標本將所采的觀察標本加生理鹽水后直接滴于載玻片上在顯微鏡下觀察：微生物運動活體標本將所采的觀察標本加生理鹽水后直接滴于14整裝標本

①將胚胎或小動物經(jīng)前期固定后整體封藏于盛滿固定劑的透明容器中

。②將發(fā)育至某一階段的雞胚整體取出，經(jīng)固定、染色、脫水、透明后封固于載玻片上的標本。整裝標本①將胚胎或小動物經(jīng)前期固定后整體封藏15血管注射標本

①將有色物質(zhì)注射進血管，用酸或鹼將血管周圍的組織腐蝕后做成的整體封藏的血管標本。②將有色物質(zhì)注射進血管后，經(jīng)一系列制片技術(shù)處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標本。血管注射標本①將有色物質(zhì)注射進血管，用酸或鹼將16組織切片法

利用化學試劑將組織經(jīng)過一系列的固定、脫水、透明后，再利用石蠟、火棉膠或者明膠等支持物滲透進組織內(nèi)部，使組織保持一定的硬度，并包埋成塊，然后依靠切片機將包埋好的組織塊切成以微米計的薄片，再根據(jù)需要進行各種染色得到的供顯微鏡下觀察的標本的方法。

組織切片法17組織切片法的種類冰凍切片石蠟切片、火棉膠切片、明膠切片組織切片法的種類冰凍切片18冰凍切片將所取材的新鮮組織，經(jīng)快速冷凍后再切片，以保持組織內(nèi)所含的脂類或某些酶類的活性。為觀察急待結(jié)果的組織，如臨床手術(shù)所取組織冰凍切片19石蠟組織切片標本制作的基本程序:

1.取材→2.固定和固定后處理→

3.脫水→4.透明→

5.浸蠟與包埋→

6.切片→

7.染色→

8.封固

石蠟組織切片標本制作的基本程序:20取材一、動物的處死手法迅速、快捷。

常用方法：1.麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（烏拉坦或者戊巴比妥）。2.空氣栓塞法：耳靜脈，20－30ml空氣3.擊頭法：重物猛擊，迅速致死。4.頸椎脫臼法：小白鼠5.破壞腦和脊髓：金屬探針，蛙6.股動脈放血：麻醉后放血使大動物迅速死亡。取21二、取材的步驟

選擇動物選擇取材部位選擇切面方向

二、取材的步驟22應(yīng)根據(jù)實驗工作的目的和經(jīng)濟能力選擇實驗動物

肝臟—豬肝卵巢—貓胃—狗運動終板—爬蟲類動物肥大細胞—大、小白鼠的皮下組織間皮和內(nèi)皮—蛙的腸系膜應(yīng)根據(jù)實驗工作的目的和經(jīng)濟能力選擇實驗動物23根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材部位

胰腺—胰尾部脊髓的運動神經(jīng)元—頸膨大和腰膨大處肺—肺門胃—胃底部

根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材部位24根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材時切面的方向

腎臟—腎門處作縱切頭皮—順毛根的方向縱切大小腸的環(huán)行皺襞—縱切氣管和食管—橫切根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材時切面的方向25三、取材時應(yīng)注意的問題：組織新鮮：取材動作快捷，迅速投入固定液注意環(huán)境溫度的影響：冰上取材或者冷固定材料應(yīng)小而薄：不超過1.5×1.5×0.5cm3

固定液會造成組織收縮，注意保持組織原有形態(tài)取材手術(shù)器械鋒利規(guī)范操作，防止組織損害注意取材環(huán)境和器械干凈，防止組織污染三、取材時應(yīng)注意的問題：組織新鮮：取材動作快捷，迅速投26固定和固定后處理一、固定的目的：

固定劑使細胞的成分凝固，防止組織細胞自溶和腐敗，保持細胞生活時的狀態(tài)。固定劑的酶染作用使細胞各成分易于被染料著色。使組織適度硬化，利于制作薄片。固定和固定后處理一、固定的目的：27二、固定的方法：1.直接固定：最常用。2.蒸汽固定：1－2％鋨酸或者甲醛揮發(fā)的蒸汽，多用于涂片固定。3.灌注固定：（必須進行后固定）

局部灌注固定：肺、腎臟、眼球、肝臟全身灌注固定：神經(jīng)系統(tǒng)二、固定的方法：28三、固定的注意事項：固定劑的用量一般為組織塊體積的15倍左右固定劑的配制現(xiàn)配現(xiàn)用預(yù)固定固定的時間一般過夜或者24小時可達到固定要求。三、固定的注意事項：29四、常用固定劑單純固定劑

甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、重鉻酸鉀、丙酮、鉻酸、四氧化鋨

固定組織時，只單用某一種試劑尚難對各種組織成分有較理想的固定作用。因此，常加入其它試劑，根據(jù)對組織的作用與反應(yīng)，配成混合固定劑，以求得補償某試劑對組織所致的缺陷。混合固定劑

4%多聚甲醛液、乙醇—甲醛液、Bouin氏液、苦味酸—硫酸液、Carnoy氏液、Helly氏液四、常用固定劑30甲醛(Formeldedhyde)固定濃度：4%甲醛溶液固定時間：12小時—24小時固定后處理：流水沖洗12小時—24小時配制方法：甲醛10ml+生理鹽水/蒸溜水90ml特性：甲醛放置時間過長易產(chǎn)生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后變?yōu)榧姿?，使溶液變?yōu)樗嵝?，嚴重時可影響到細胞著色。甲醛(Formeldedhyde)31乙醇(Ethylalcohol)固定濃度：80%--90%乙醇液固定時間：一般4小時—12小時固定后處理：直接入脫水劑配制方法：無水乙醇+蒸餾水特性：乙醇具有固定、脫水等多種功能。組織在高濃度乙醇中放置時間過長時，易發(fā)脆。50%以上濃度的乙醇可溶解組織內(nèi)脂肪、類脂體、色素等，注意制片的目的。乙醇(Ethylalcohol)324%多聚甲醛液配制方法：

多聚甲醛4g0.1MPBS溶液100ml固定時間：24小時固定溫度4℃固定后處理：流水沖洗24小時適用組織：常用固定劑，適用廣泛4%多聚甲醛液33乙醇—甲醛液（A—F液）配制方法：95%乙醇90ml40%甲醛10ml固定時間：組織塊固定4—12小時，鋪片固定5—10分鐘。固定后處理：直接入脫水劑。適用組織：肥大細胞，糖原的固定

。乙醇—甲醛液（A—F液）34Bouin氏液配制方法：飽和苦味酸溶液75ml40%甲醛25ml冰乙酸5ml固定時間：12—24h固定后處理：70%乙醇脫去苦味酸產(chǎn)生的黃色適用組織：常備固定液，特別適用于固定皮膚和胚胎組織。Bouin氏液35五、固定后處理

除去組織中滲入的固定液和一些由固定液產(chǎn)生的沉淀、結(jié)晶和色素的步驟稱為固定后處理。主要有以下六種方法：流水沖洗

：重鉻酸鉀、甲醛固定的組織，要經(jīng)過流水沖洗24h。酒精脫黃:含有苦味酸的固定液固定的組織，必須經(jīng)過70％乙醇洗滌脫去黃色。五、固定后處理除去組織中滲入的固定液36碘酒脫汞

：氯化汞固定的組織有汞結(jié)晶，碘酒浸泡除去。脫甲醛色素

：甲醛長期固定的組織易產(chǎn)生黑色結(jié)晶，70％乙醇－濃氨水溶液除去。組織漂白：鋨酸固定的組織為黑色。漂白液漂白才上色。脫鈣：含鈣組織骨、牙齒和內(nèi)耳。碘酒脫汞：氯化汞固定的組織有汞結(jié)晶，碘酒浸泡除去。37脫水一、脫水用某種能與透明劑互溶的化學試劑將組織內(nèi)的水分逐漸置換出來的過程。要點：緩慢、徹底、勿過度。二、常用脫水劑

乙醇、丙酮、正丁醇脫水一、脫水38乙醇固定劑+脫水劑上行酒精脫水70%（30%）→100%，以10％遞增。丙酮脫水強，但對組織的收縮脆化作用也強；主要用于組織的固定兼脫水或切片的快速脫水，以保護某些特殊染色的標本不被褪色。乙醇39透明一、透明對組織的最后脫水處理。在經(jīng)過前一階段的“脫水”后，還要借某種有機溶媒將酒精完全置換，使組織與所用的包埋介質(zhì)相溶而浸滲。二、常用透明劑

二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷、冬青油透明一、透明40二甲苯

為無色透明的液體，易揮發(fā)，長期接觸對呼吸道粘膜有較強的刺激作用20分鐘—1個小時，大塊組織可適當延長時間。作用迅速，浸泡時間過長易發(fā)生過度收縮和脆化苯甲酸甲脂為無色透明的液體，易揮發(fā)透明作用較二甲苯緩慢，透明時間12--24小時。對組織塊的收縮和脆化的影響較小。苯甲酸甲脂與火棉膠互溶，用于火棉膠切片的透明二甲苯41用石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程包括浸蠟和包埋兩步一、浸蠟組織透明后，用石蠟置換組織內(nèi)部的透明劑的過程稱為浸蠟。組織塊浸蠟一般先經(jīng)過低熔點蠟，再經(jīng)過高熔點蠟。

包埋

用石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程包42高溶點蠟也稱硬蠟溶點在60℃--62℃硬蠟箱的溫度控制在62℃--64℃之間組織浸蠟時間一般不超過1小時

低溶點蠟也稱軟蠟溶點在48℃--50℃軟蠟箱的溫度控制在52℃—54℃之間組織浸蠟時間一般可達2—4小時高溶點蠟也稱硬蠟溶點在60℃--62℃低溶點蠟也稱軟蠟溶點43二、包埋組織浸蠟完成后，接著進行組織塊包埋。用于包埋的是硬蠟。包埋在包埋器中完成。修整蠟塊時，組織塊應(yīng)距蠟塊邊緣2—3毫米，以利于連續(xù)切片。

二、包埋44切片

石蠟切片組織切片中應(yīng)用最為廣泛的一種切片就是用石蠟作為包埋劑制作的切片。易于制作大量菲薄的組織標本，而且包埋塊可長期保存。切片石蠟切片45一、儀器及器材一、儀器及器材46二、切片過程：

調(diào)節(jié)恒溫水箱水溫至47℃左右；固定蠟塊于固定器；快修裝置修整包埋面；調(diào)節(jié)切片厚度至4—6微米；連續(xù)切片；攤片于水箱內(nèi)；將蠟片貼于涂好粘片劑的載玻片上；置于溫箱內(nèi)烤片。二、切片過程：47三、切片的注意事項

①切片前要將切片機各部位的螺絲旋緊，否則會引起切片機各部件震動，造成切片厚薄不勻。②包埋塊的切面和切片刀的傾斜度之間的夾角應(yīng)按切片機刀臺上的刻度作適當調(diào)整。③恒溫水箱的溫度應(yīng)比包埋蠟的溶點低5℃--6℃。三、切片的注意事項48染色

一、染料

指分子中含有發(fā)色團和助色團的有機化合物，有鮮艷的色彩，對于組織有極強的親和力。根據(jù)來源可分為兩類：天然染料（卡紅、蘇木精）人工合成染料（苦味酸、桔黃G）根據(jù)其化學性質(zhì)分為：堿性染料(basicdye)酸性染料(aciddye)中性(neutrophilia)染料等染色一、染料49二、染色的原理

染色就是染料和組織細胞的分子相互結(jié)合，使組織和細胞著色?；瘜W反應(yīng)在組織細胞內(nèi)含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)。染色時酸性物質(zhì)與堿性染料結(jié)合；堿性物質(zhì)與酸性染料結(jié)合。細胞核中主要由酸性物質(zhì)組成（如核酸等），所以與蘇木精等堿性染料有很強的親和力。細胞質(zhì)主要由堿性物質(zhì)組成，所以與伊紅等酸性染料有很強的親和力。能被堿性染料著色的物質(zhì)：嗜堿性(basophilia)；能被酸性染料著色的物質(zhì)：嗜酸性(acidophilia)。二、染色的原理染色就是染料和組織細胞的分子50物理反應(yīng)細胞中有許多微小的毛細小孔，染料的色素離子通過這些小孔滲入細胞內(nèi)，染料與細胞沒有牢固的結(jié)合，但分散的色素離子和組織細胞分子之間通過分子間相互作用使細胞著色。物理反應(yīng)細胞中有許多微小的毛細小孔，染料的色素離子通過這51三、染色的注意事項：1.溶媒：水和乙醇。2.濃度：低濃度，長時間。3.溫度：高，染色效果明顯。4.適當使用媒染劑、促染劑和分化劑。媒染劑：能增強染料對組織的著色能力，其本身與染料或組織不發(fā)生結(jié)合的試劑。如配制各種蘇木精染色液時添加的鉀明礬、銨明礬等。促染劑：能增強染料對組織的著色能力，本身并不參與染色反應(yīng)。如伊紅染色液中添加的冰乙酸等。分化劑：能除去組織上和切片上過染的染色液，使染色部位與周圍組織對比鮮明，著色深淺適當；例如低濃度的鹽酸、醋酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等。三、染色的注意事項：52封固一、封固最后一道程序是滴加封固劑，用蓋玻片覆蓋，以利于鏡下觀察。阻斷組織片與外界的接觸，防止組織片脫片、受潮、干裂、機械磨損等，延長切片的使用時間。這一步驟稱為封固。封固分為干封和濕封兩種。封固一、封固53干封：切片染色經(jīng)脫水和透明后，用中性樹膠之類無水封固劑封固。數(shù)年不褪色。濕封：切片染色后直接用含甘油、明膠及少量的水和防腐劑組成的封固劑封固。濕封的標本保存時間不長，主要用于某些組織化學或特殊染色的標本。干封：切片染色經(jīng)脫水和透明后，用中性樹膠之類無水封固劑封固。54二、封固時的注意事項：①

封固時避免產(chǎn)生氣泡。②

封固劑應(yīng)濃度適中。③

選擇大小合適的蓋玻片，以蓋好組織后四周約有2毫米左右的間隙為適當。④

封固劑應(yīng)避光保存

。

二、封固時的注意事項：55組織脫水、透明步驟

脫水：70%乙醇30`→80%乙醇30`→95%乙醇Ⅰ20`→

95%乙醇Ⅱ20`→100%乙醇Ⅰ20`→100%乙醇Ⅱ20`

透明：苯甲酸甲酯過夜組織脫水、透明步驟

脫水：70%乙醇30`→80%乙醇356蘇木精(hematoxylin)-伊紅(eosin)（H-E染色）

一、脫蠟與入水1．二甲苯5—10分鐘2次；2．無水乙醇5分鐘2次；3．95%乙醇5分鐘；4．80%乙醇5分鐘；5．70%乙醇5分鐘；6．自來水洗5分鐘；7．蒸餾水洗5分鐘。蘇木精(hematoxylin)-伊紅(eosin)（H-E57二、染色、分色與返藍1．蘇木精5分鐘；2．自來水洗1分鐘；3．1%鹽酸酒精分色數(shù)秒；4．自來水洗數(shù)分鐘（此時可鏡下檢查，細胞核著藍色，其它組織基本無色）；5．飽和碳酸鋰返藍1分鐘；6．自來水洗2分鐘；伊紅

1分鐘。二、染色、分色與返藍1．蘇木精5分鐘；581．80%乙醇2分鐘；2．95%乙醇2分鐘2次；3．無水乙醇2分鐘2次；4.二甲苯5分鐘2次；5．中性樹膠封固。三、脫水、透明與封固1．80%乙醇2分鐘；三、脫水、透明與封59結(jié)果

細胞核藍色，細胞質(zhì)紅色結(jié)果60伊紅--醛復(fù)紅染色（彈性纖維、膠原纖維）1)組織鋪片用95%乙醇固定5-10分鐘;2)醛復(fù)紅溶液染色45分鐘(鏡檢）;3)95%酒精稍洗;4)伊紅30秒;5)無水酒精稍洗;6)濾紙吸干;7)二甲苯①2分鐘.8)二甲苯②2分鐘.9)中性樹膠封片.伊紅--醛復(fù)紅染色（彈性纖維、膠原纖維）61結(jié)果膠原纖維呈紅色；彈性纖維呈紫藍色結(jié)果621、先天下之憂而憂；后天下之樂而樂?！吨傺?/p>

2、捐軀赴國難，視死忽如歸?！苤?/p>

3、近鄉(xiāng)情更切，不敢問來人?！沃畣?/p>

4、氣蒸云夢澤；波撼岳陽城?！虾迫?/p>

5、中夜四五嘆，常為大國憂?！畎?/p>

6、國恥未雪，何由成名？——李白

7、當須徇忠義，身死報國恩?！钕Ｖ?/p>

8、科學雖沒有國界，但是學者卻有他自己的國家?！退沟?/p>

9、虛榮的人注視著自己的名字，光榮的人注視著祖國的事業(yè)?！R蒂

10、愛國主義就是千百年來固定下來的對自己的祖國的一種最深厚的感情?！袑?/p>

11、利于國者愛之，害于國者惡之?！虌?/p>

12、常思奮不顧身，而殉國家之急?！抉R遷

13、愛國如饑渴?！喙?/p>

14、一身報國有萬死，雙鬢向人無再青?！懹?/p>

15、死去原知萬事空，但悲不見九州同。王師北定中原日，家祭無忘告乃翁?！懹?/p>

16、人生自古誰無死，留取丹心照汗青?！奶煜?/p>

17、天下興亡，匹夫有責?！櫻孜?/p>

18、南北驅(qū)馳報主情，江花邊草笑平生。一年三百六十日，都是橫戈馬上行?！堇^光

19、瞞人之事弗為，害人之心弗存，有益國家之事雖死弗避?！獏卫?/p>

20、各出所學，各盡所知，使國家富強不受外侮，足以自立于地球之上?！蔡煊?/p>

21、做人最大的事情是什么呢？就是要知道怎樣愛國。——孫中山

22、我們愛我們的民族，這是我們自信心的泉源?！芏鱽?/p>

23、為中華之崛起而讀書?！芏鱽?/p>

24、以身許國，何事不敢為？——岳飛

25、夜視太白收光芒，報國欲死無戰(zhàn)場！——陸游

26、位卑不敢忘憂國。——陸游

27、寄意寒星荃不察，我以我血薦軒轅。——魯迅

28、中國自古以來，就有埋頭苦干的人，就有拼命硬干的人，就有為民請命的人，就有舍身求法的人。——他們是中國的脊梁?！斞?/p>

29、惟有民魂是值得寶貴的，惟有它發(fā)揚起來，中國人才有真進步?！斞?/p>

30、我們中華民族有同自己的敵人血戰(zhàn)到底的氣概，有在自力更生的基礎(chǔ)上光復(fù)舊物的決心，有自立于世界民族之林的能力?！珴蓶|

31、與其忍辱生，毋寧報國死。——何香凝

32、錦繡河山收拾好，萬民盡作主人翁?！斓?3、人民不僅有權(quán)愛國，而且愛國是個義務(wù)，是一種光榮?！焯亓?/p>

34、愛國的主要方法，就是要愛自己所從事的事業(yè)。——謝覺哉

35、中國是古老的民族，也是勇敢的民族。中華民族有兩大優(yōu)點：勇敢，勤勞。這樣的民族多么可愛，我們愛我們民族（當然其他民族也有他們可愛之處，我們決不忽視這一點），這是我們自信心的泉源。——周恩來

36、真正的愛國者是愛人類的，愛國決不是排外?！R鐵丁

37、愛國主義就是千百年來鞏固起來的對自己的祖國的一種最深厚的感情?！袑?/p>

38、必須經(jīng)過祖國這一層樓，然后更上一層樓，達到人類的高度?！_曼·羅蘭

39、黃金誠然是寶貴的，但是生氣蓬勃的勇敢的愛國者卻比黃金更為寶貴?！挚?、先天下之憂而憂；后天下之樂而樂?！吨傺?3組織制片技術(shù)組織制片技術(shù)64組織制片技術(shù)的概述組織制片技術(shù)的方法組織制片技術(shù)的基本程序蘇木精—伊紅染色組織制片技術(shù)的概述65組織制片技術(shù)的發(fā)展史

從16世紀60年代Hook發(fā)明顯微鏡，開始觀察和描述軟木塞中的細胞至今，組織制片技術(shù)隨著生命科學的發(fā)展而不斷進步。組織制片技術(shù)的發(fā)展史66組織制片技術(shù)的發(fā)展史

在19世紀中期，隨著生物、物理和化學等學科的飛速發(fā)展，以及顯微鏡和切片機的逐步完善，組織學也建立起一整套完整科學的組織制片技術(shù)。組織制片技術(shù)的發(fā)展史67組織制片技術(shù)的發(fā)展史

特別是20世紀50年代以來，由于組織化學、免疫組織化學等新技術(shù)和新儀器的出現(xiàn)，使組織制片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域進入了一個嶄新的時期。組織制片技術(shù)的發(fā)展史68利用組織制片技術(shù)的方法所制出的標本，顯示了組織細胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)、組織細胞之間的相互連接及組織細胞中的某些化學成分的種類和含量。組織制片是研究醫(yī)學和生物學的一個最基本的手段。組織制片的意義和目的利用組織制片技術(shù)的方法所制出的標本，顯示了69組織制片技術(shù)的方法

非組織切片法組織切片法組織制片技術(shù)的方法非組織切片法70非組織切片法組織不經(jīng)過切片制成觀察標本的方法。非組織切片法的種類涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離標本、活體標本、整裝標本、血管注射標本。非組織切片法71涂片將所采的血液、骨髓或者脫落細胞涂抹于載玻片上經(jīng)瑞氏、姬姆薩染色、常規(guī)HE染色。涂片將所采的血液、骨髓或者脫落細胞涂抹于載玻片上72壓片

先將組織處理成小塊物質(zhì)，然后用化學藥品進行軟化和染色，再用蓋玻片壓封于載玻片上。例如運動終板和寄生蟲標本等。壓片先將組織處理成小塊物質(zhì)，然后用化學藥品進行軟化73鋪片：將需要觀察的薄片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后經(jīng)過固定、染色等程序制成。例如蛙的腸系膜鋪片，大白鼠的皮下組織鋪片等。鋪片：將需要觀察的薄片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后74磨片：對于骨，牙齒等組織，不經(jīng)脫鈣和切片，直接在磨石上用手工磨成大約50微米左右的薄片，然后再進行染色封固在載玻片上。磨片：對于骨，牙齒等組織，不經(jīng)脫鈣和切片，直接在磨石上用手工75消化分離標本：先將組織分離成小塊，然后利用相應(yīng)的化學物質(zhì)將細胞間質(zhì)消化溶解，再用機械分離的方法，如水的震蕩沖擊力，使小塊組織分離成單個而又完整的細胞，經(jīng)染色后涂于載玻片上進行封固。例如平滑肌分離標本，脊髓的運動神經(jīng)細胞等。消化分離標本：先將組織分離成小塊，然后利用相應(yīng)的化學物質(zhì)將細76活體標本將所采的觀察標本加生理鹽水后直接滴于載玻片上在顯微鏡下觀察：微生物運動活體標本將所采的觀察標本加生理鹽水后直接滴于77整裝標本

①將胚胎或小動物經(jīng)前期固定后整體封藏于盛滿固定劑的透明容器中

。②將發(fā)育至某一階段的雞胚整體取出，經(jīng)固定、染色、脫水、透明后封固于載玻片上的標本。整裝標本①將胚胎或小動物經(jīng)前期固定后整體封藏78血管注射標本

①將有色物質(zhì)注射進血管，用酸或鹼將血管周圍的組織腐蝕后做成的整體封藏的血管標本。②將有色物質(zhì)注射進血管后，經(jīng)一系列制片技術(shù)處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標本。血管注射標本①將有色物質(zhì)注射進血管，用酸或鹼將79組織切片法

利用化學試劑將組織經(jīng)過一系列的固定、脫水、透明后，再利用石蠟、火棉膠或者明膠等支持物滲透進組織內(nèi)部，使組織保持一定的硬度，并包埋成塊，然后依靠切片機將包埋好的組織塊切成以微米計的薄片，再根據(jù)需要進行各種染色得到的供顯微鏡下觀察的標本的方法。

組織切片法80組織切片法的種類冰凍切片石蠟切片、火棉膠切片、明膠切片組織切片法的種類冰凍切片81冰凍切片將所取材的新鮮組織，經(jīng)快速冷凍后再切片，以保持組織內(nèi)所含的脂類或某些酶類的活性。為觀察急待結(jié)果的組織，如臨床手術(shù)所取組織冰凍切片82石蠟組織切片標本制作的基本程序:

1.取材→2.固定和固定后處理→

3.脫水→4.透明→

5.浸蠟與包埋→

6.切片→

7.染色→

8.封固

石蠟組織切片標本制作的基本程序:83取材一、動物的處死手法迅速、快捷。

常用方法：1.麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（烏拉坦或者戊巴比妥）。2.空氣栓塞法：耳靜脈，20－30ml空氣3.擊頭法：重物猛擊，迅速致死。4.頸椎脫臼法：小白鼠5.破壞腦和脊髓：金屬探針，蛙6.股動脈放血：麻醉后放血使大動物迅速死亡。取84二、取材的步驟

選擇動物選擇取材部位選擇切面方向

二、取材的步驟85應(yīng)根據(jù)實驗工作的目的和經(jīng)濟能力選擇實驗動物

肝臟—豬肝卵巢—貓胃—狗運動終板—爬蟲類動物肥大細胞—大、小白鼠的皮下組織間皮和內(nèi)皮—蛙的腸系膜應(yīng)根據(jù)實驗工作的目的和經(jīng)濟能力選擇實驗動物86根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材部位

胰腺—胰尾部脊髓的運動神經(jīng)元—頸膨大和腰膨大處肺—肺門胃—胃底部

根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材部位87根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材時切面的方向

腎臟—腎門處作縱切頭皮—順毛根的方向縱切大小腸的環(huán)行皺襞—縱切氣管和食管—橫切根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點選擇取材時切面的方向88三、取材時應(yīng)注意的問題：組織新鮮：取材動作快捷，迅速投入固定液注意環(huán)境溫度的影響：冰上取材或者冷固定材料應(yīng)小而?。翰怀^1.5×1.5×0.5cm3

固定液會造成組織收縮，注意保持組織原有形態(tài)取材手術(shù)器械鋒利規(guī)范操作，防止組織損害注意取材環(huán)境和器械干凈，防止組織污染三、取材時應(yīng)注意的問題：組織新鮮：取材動作快捷，迅速投89固定和固定后處理一、固定的目的：

固定劑使細胞的成分凝固，防止組織細胞自溶和腐敗，保持細胞生活時的狀態(tài)。固定劑的酶染作用使細胞各成分易于被染料著色。使組織適度硬化，利于制作薄片。固定和固定后處理一、固定的目的：90二、固定的方法：1.直接固定：最常用。2.蒸汽固定：1－2％鋨酸或者甲醛揮發(fā)的蒸汽，多用于涂片固定。3.灌注固定：（必須進行后固定）

局部灌注固定：肺、腎臟、眼球、肝臟全身灌注固定：神經(jīng)系統(tǒng)二、固定的方法：91三、固定的注意事項：固定劑的用量一般為組織塊體積的15倍左右固定劑的配制現(xiàn)配現(xiàn)用預(yù)固定固定的時間一般過夜或者24小時可達到固定要求。三、固定的注意事項：92四、常用固定劑單純固定劑

甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、重鉻酸鉀、丙酮、鉻酸、四氧化鋨

固定組織時，只單用某一種試劑尚難對各種組織成分有較理想的固定作用。因此，常加入其它試劑，根據(jù)對組織的作用與反應(yīng)，配成混合固定劑，以求得補償某試劑對組織所致的缺陷?；旌瞎潭▌?/p>

4%多聚甲醛液、乙醇—甲醛液、Bouin氏液、苦味酸—硫酸液、Carnoy氏液、Helly氏液四、常用固定劑93甲醛(Formeldedhyde)固定濃度：4%甲醛溶液固定時間：12小時—24小時固定后處理：流水沖洗12小時—24小時配制方法：甲醛10ml+生理鹽水/蒸溜水90ml特性：甲醛放置時間過長易產(chǎn)生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后變?yōu)榧姿?，使溶液變?yōu)樗嵝?，嚴重時可影響到細胞著色。甲醛(Formeldedhyde)94乙醇(Ethylalcohol)固定濃度：80%--90%乙醇液固定時間：一般4小時—12小時固定后處理：直接入脫水劑配制方法：無水乙醇+蒸餾水特性：乙醇具有固定、脫水等多種功能。組織在高濃度乙醇中放置時間過長時，易發(fā)脆。50%以上濃度的乙醇可溶解組織內(nèi)脂肪、類脂體、色素等，注意制片的目的。乙醇(Ethylalcohol)954%多聚甲醛液配制方法：

多聚甲醛4g0.1MPBS溶液100ml固定時間：24小時固定溫度4℃固定后處理：流水沖洗24小時適用組織：常用固定劑，適用廣泛4%多聚甲醛液96乙醇—甲醛液（A—F液）配制方法：95%乙醇90ml40%甲醛10ml固定時間：組織塊固定4—12小時，鋪片固定5—10分鐘。固定后處理：直接入脫水劑。適用組織：肥大細胞，糖原的固定

。乙醇—甲醛液（A—F液）97Bouin氏液配制方法：飽和苦味酸溶液75ml40%甲醛25ml冰乙酸5ml固定時間：12—24h固定后處理：70%乙醇脫去苦味酸產(chǎn)生的黃色適用組織：常備固定液，特別適用于固定皮膚和胚胎組織。Bouin氏液98五、固定后處理

除去組織中滲入的固定液和一些由固定液產(chǎn)生的沉淀、結(jié)晶和色素的步驟稱為固定后處理。主要有以下六種方法：流水沖洗

：重鉻酸鉀、甲醛固定的組織，要經(jīng)過流水沖洗24h。酒精脫黃:含有苦味酸的固定液固定的組織，必須經(jīng)過70％乙醇洗滌脫去黃色。五、固定后處理除去組織中滲入的固定液99碘酒脫汞

：氯化汞固定的組織有汞結(jié)晶，碘酒浸泡除去。脫甲醛色素

：甲醛長期固定的組織易產(chǎn)生黑色結(jié)晶，70％乙醇－濃氨水溶液除去。組織漂白：鋨酸固定的組織為黑色。漂白液漂白才上色。脫鈣：含鈣組織骨、牙齒和內(nèi)耳。碘酒脫汞：氯化汞固定的組織有汞結(jié)晶，碘酒浸泡除去。100脫水一、脫水用某種能與透明劑互溶的化學試劑將組織內(nèi)的水分逐漸置換出來的過程。要點：緩慢、徹底、勿過度。二、常用脫水劑

乙醇、丙酮、正丁醇脫水一、脫水101乙醇固定劑+脫水劑上行酒精脫水70%（30%）→100%，以10％遞增。丙酮脫水強，但對組織的收縮脆化作用也強；主要用于組織的固定兼脫水或切片的快速脫水，以保護某些特殊染色的標本不被褪色。乙醇102透明一、透明對組織的最后脫水處理。在經(jīng)過前一階段的“脫水”后，還要借某種有機溶媒將酒精完全置換，使組織與所用的包埋介質(zhì)相溶而浸滲。二、常用透明劑

二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷、冬青油透明一、透明103二甲苯

為無色透明的液體，易揮發(fā)，長期接觸對呼吸道粘膜有較強的刺激作用20分鐘—1個小時，大塊組織可適當延長時間。作用迅速，浸泡時間過長易發(fā)生過度收縮和脆化苯甲酸甲脂為無色透明的液體，易揮發(fā)透明作用較二甲苯緩慢，透明時間12--24小時。對組織塊的收縮和脆化的影響較小。苯甲酸甲脂與火棉膠互溶，用于火棉膠切片的透明二甲苯104用石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程包括浸蠟和包埋兩步一、浸蠟組織透明后，用石蠟置換組織內(nèi)部的透明劑的過程稱為浸蠟。組織塊浸蠟一般先經(jīng)過低熔點蠟，再經(jīng)過高熔點蠟。

包埋

用石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程包105高溶點蠟也稱硬蠟溶點在60℃--62℃硬蠟箱的溫度控制在62℃--64℃之間組織浸蠟時間一般不超過1小時

低溶點蠟也稱軟蠟溶點在48℃--50℃軟蠟箱的溫度控制在52℃—54℃之間組織浸蠟時間一般可達2—4小時高溶點蠟也稱硬蠟溶點在60℃--62℃低溶點蠟也稱軟蠟溶點106二、包埋組織浸蠟完成后，接著進行組織塊包埋。用于包埋的是硬蠟。包埋在包埋器中完成。修整蠟塊時，組織塊應(yīng)距蠟塊邊緣2—3毫米，以利于連續(xù)切片。

二、包埋107切片

石蠟切片組織切片中應(yīng)用最為廣泛的一種切片就是用石蠟作為包埋劑制作的切片。易于制作大量菲薄的組織標本，而且包埋塊可長期保存。切片石蠟切片108一、儀器及器材一、儀器及器材109二、切片過程：

調(diào)節(jié)恒溫水箱水溫至47℃左右；固定蠟塊于固定器；快修裝置修整包埋面；調(diào)節(jié)切片厚度至4—6微米；連續(xù)切片；攤片于水箱內(nèi)；將蠟片貼于涂好粘片劑的載玻片上；置于溫箱內(nèi)烤片。二、切片過程：110三、切片的注意事項

①切片前要將切片機各部位的螺絲旋緊，否則會引起切片機各部件震動，造成切片厚薄不勻。②包埋塊的切面和切片刀的傾斜度之間的夾角應(yīng)按切片機刀臺上的刻度作適當調(diào)整。③恒溫水箱的溫度應(yīng)比包埋蠟的溶點低5℃--6℃。三、切片的注意事項111染色

一、染料

指分子中含有發(fā)色團和助色團的有機化合物，有鮮艷的色彩，對于組織有極強的親和力。根據(jù)來源可分為兩類：天然染料（卡紅、蘇木精）人工合成染料（苦味酸、桔黃G）根據(jù)其化學性質(zhì)分為：堿性染料(basicdye)酸性染料(aciddye)中性(neutrophilia)染料等染色一、染料112二、染色的原理

染色就是染料和組織細胞的分子相互結(jié)合，使組織和細胞著色?；瘜W反應(yīng)在組織細胞內(nèi)含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)。染色時酸性物質(zhì)與堿性染料結(jié)合；堿性物質(zhì)與酸性染料結(jié)合。細胞核中主要由酸性物質(zhì)組成（如核酸等），所以與蘇木精等堿性染料有很強的親和力。細胞質(zhì)主要由堿性物質(zhì)組成，所以與伊紅等酸性染料有很強的親和力。能被堿性染料著色的物質(zhì)：嗜堿性(basophilia)；能被酸性染料著色的物質(zhì)：嗜酸性(acidophilia)。二、染色的原理染色就是染料和組織細胞的分子113物理反應(yīng)細胞中有許多微小的毛細小孔，染料的色素離子通過這些小孔滲入細胞內(nèi)，染料與細胞沒有牢固的結(jié)合，但分散的色素離子和組織細胞分子之間通過分子間相互作用使細胞著色。物理反應(yīng)細胞中有許多微小的毛細小孔，染料的色素離子通過這114三、染色的注意事項：1.溶媒：水和乙醇。2.濃度：低濃度，長時間。3.溫度：高，染色效果明顯。4.適當使用媒染劑、促染劑和分化劑。媒染劑：能增強染料對組織的著色能力，其本身與染料或組織不發(fā)生結(jié)合的試劑。如配制各種蘇木精染色液時添加的鉀明礬、銨明礬等。促染劑：能增強染料對組織的著色能力，本身并不參與染色反應(yīng)。如伊紅染色液中添加的冰乙酸等。分化劑：能除去組織上和切片上過染的染色液，使染色部位與周圍組織對比鮮明，著色深淺適當；例如低濃度的鹽酸、醋酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等。三、染色的注意事項：115封固一、封固最后一道程序是滴加封固劑，用蓋玻片覆蓋，以利于鏡下觀察。阻斷組織片與外界的接觸，防止組織片脫片、受潮、干裂、機械磨損等，延長切片的使用時間。這一步驟稱為封固。封固分為干封和濕封兩種。封固一、封固116干封：切片染色經(jīng)脫水和透明后，用中性樹膠之類無水封固劑封固。數(shù)年不褪色。濕封：切片染色后直接用含甘油、明膠及少量的水和防腐劑組成的封固劑封固。濕封的標本保存時間不長，主要用于某些組織化學或特殊染色的標本。干封：切片染色經(jīng)脫水和透明后，用中性樹膠之類無水封固劑封固。117二、封固時的注意事項：①

封固時避免產(chǎn)生氣泡。②

封固劑應(yīng)濃度適中。③

選擇大小合適的蓋玻片，以蓋好組織后四周約有2毫米左右的間隙為適當。④

封固劑應(yīng)避光保存

。

二、封固時的注意事項：118組織脫水、透明步驟

脫水：70%乙醇30`→80%乙醇30`→95%乙醇Ⅰ20`→

95%乙醇Ⅱ20`→100%乙醇Ⅰ20`→100%乙醇Ⅱ20`

透明：苯甲酸甲酯過夜組織脫水、透明步驟

脫水：70%乙醇30`→80%乙醇3119