第五節(jié)酶的免疫化學(xué)測(cè)定

二十世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，酶的定量分析技術(shù)中出現(xiàn)了許多利用酶蛋白的抗原性，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)直接測(cè)定酶的免疫化學(xué)測(cè)定法。與經(jīng)典的測(cè)定酶活性方法比較，這些方法不僅靈敏度高，而且能測(cè)定一些以前不易測(cè)定或測(cè)定條件不易掌握的酶。第五節(jié)酶的免疫化學(xué)測(cè)定1

(一)測(cè)定原理

放射免疫測(cè)定(RIA)分為直接法與間接法。

直接法是將放射性核素標(biāo)記的酶分子與相應(yīng)抗體作用產(chǎn)生沉淀，然后將沉淀分離并進(jìn)行定量測(cè)定。

間接法是將樣品中無(wú)放射性的酶蛋白與放射性標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)酶共同對(duì)有限量的抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，根據(jù)其競(jìng)爭(zhēng)程度來(lái)定量樣品中的酶蛋白量。以間接法為最常用。(一)測(cè)定原理2

另外還有免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(CLIA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、熒光酶免疫測(cè)定(FEIA)等。報(bào)告方式有兩類：一類是用酶活性濃度單位，如免疫抑制法測(cè)定CK-MB酶活性(actiyity)，結(jié)果常以U／L報(bào)告；另一類是用質(zhì)量濃度單位，如用免疫學(xué)方法測(cè)定CK-MB酶質(zhì)量(mass)(即蛋白量)，結(jié)果常直接用ng／ml或6μg／L報(bào)告。另外還有免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(3(二)免疫化學(xué)測(cè)定的優(yōu)缺點(diǎn)

血清酶活性變化分為酶蛋白質(zhì)量和酶活性同步變化及酶蛋白質(zhì)量未變而酶活性變化兩種情況。酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制劑對(duì)酶活性也有影響，因而酶活性常不能正確反映酶的情況，出現(xiàn)酶活性與酶蛋白絕對(duì)量不一致，有時(shí)甚至出現(xiàn)兩者變化完全相反的情況。(二)免疫化學(xué)測(cè)定的優(yōu)缺點(diǎn)4與傳統(tǒng)的酶活性測(cè)定法相比，免疫化學(xué)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)主要有：①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；②特異性高，不受體液中其他物質(zhì)，如酶抑制劑、激活劑等的影響；③能用于一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白，如各種酶原或去輔基酶蛋白，或因遺傳變異而導(dǎo)致合成無(wú)活性的酶蛋白的酶測(cè)定；④特別適用于同工酶的測(cè)定。與傳統(tǒng)的酶活性測(cè)定法相比，免疫化學(xué)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)主要有5酶的免疫化學(xué)測(cè)定也有其局限性。主要有：①要制備足夠量的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清常常是很困難的，而且工作量很大；②測(cè)定步驟多，操作繁瑣；③測(cè)定成本高。酶的免疫化學(xué)測(cè)定也有其局限性。主要有：6第六節(jié)同工酶及其亞型測(cè)定第六節(jié)同工酶及其亞型測(cè)定7此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。血漿酶可分成血漿特異酶和非血漿特異酶兩大類，后者可再分為外分泌酶和細(xì)胞酶等。另一大類以乳酸為底物的順向反應(yīng)(稱LD-L法)。這5種同工酶大致可分為三類：酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制劑對(duì)酶在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中，許多代謝物濃度的測(cè)定往往使用有工具酶的參與的反應(yīng)，即所謂共通反應(yīng)途徑。CK同工酶亞型(CK-MM型和CK-MB型)多用瓊脂糖凝膠高壓電泳和等電聚焦電泳等。如持續(xù)性升高達(dá)數(shù)周，常提示胰腺炎有反復(fù)，或有并發(fā)癥發(fā)生。常用色譜法是柱色譜，如離子交換色譜和親和色譜等用于同工酶的提純與制備，但方法費(fèi)時(shí)繁瑣，通常不適合臨床同工酶常規(guī)檢測(cè)。①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；七、淀粉酶及其同工酶γ-GT催化γ-谷氨?；鶑墓入赘孰?GSH)或其他含γ-谷氨?；镔|(zhì)中轉(zhuǎn)移到另一肽或氨基酸分子上。肺、胰、脾、淋巴結(jié)壞死和炎癥及各種惡性疾病時(shí)LD2、LD3、LD4升高；溶血性疾病時(shí)LD1和LD2升高，但仍為L(zhǎng)D2>LD1；我國(guó)多采用目前IFCC參考方法LD-L法，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。4-NPP在堿性溶液中為五色，在ALP催化下，4-NPP分裂出磷酸基團(tuán)，生成游離的對(duì)硝基苯酚。LD或?qū)⒈∧せ蚰z切割成小條或小薄片，分別浸泡在含緩沖液的試管中，低溫下將酶條帶洗脫，再進(jìn)行比色分析，亦可計(jì)算出各同工酶或亞型區(qū)帶的活力。膽堿酯酶(ChE)是一類催化?；憠A水解的酶類。一、概念同工酶是同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布和細(xì)胞內(nèi)定位不同的一類酶。亞型某些酶或同工酶從組織進(jìn)入體液后，可進(jìn)一步變化為數(shù)個(gè)不同類型即所謂“亞型，也稱為同工型(isoform)”。即指基因在編碼過(guò)程中由于翻譯后修飾的差異所形成的多種形式的一類酶。亞型往往在基因編碼產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)釋入血漿時(shí)因肽酶作用降解而形成。此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、8酶的免疫化學(xué)測(cè)定課件講義9三、分析方法

臨床同工酶的分析大致可分為兩步，即首先精確地分離出某酶的各同工酶組分，然后測(cè)定酶的總活性和各同工酶或亞型組分的活性。三、分析方法10臨床上習(xí)慣用U／L來(lái)表示體液中酶催化濃度。臨床上檢測(cè)AMY用于胰腺炎診斷時(shí)，應(yīng)注意AMY增高幅度與病情不成比例，如原AMY已升高卻發(fā)生與癥狀不相應(yīng)的降低時(shí)，常為兇險(xiǎn)的壞死性胰腺炎的預(yù)兆。(2)肌酶譜：主要用于對(duì)骨骼肌疾病的診斷和監(jiān)護(hù)。如果血清中ALP持續(xù)低值，則阻塞性黃疸的可能性很小。但神經(jīng)疾病引起的肌萎縮，CK活性一般正常。酶活性濃度測(cè)定是臨床酶學(xué)分析最為常用的方法。此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。根據(jù)酶促反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，可計(jì)算出酶活性濃度的高低。臨床上以檢測(cè)血清酶和同工酶應(yīng)用最廣，根據(jù)需要也可測(cè)定其他各種體液(如尿液、胸腔積液、腹水、腦脊液等)中的酶和同工酶或亞型。ChE的真正生理功能至今尚未闡明。各種CK同工酶還可進(jìn)一步根據(jù)所帶電荷和等電點(diǎn)不同分離數(shù)目不等的亞型。另一大類以乳酸為底物的順向反應(yīng)(稱LD-L法)。膽道疾患時(shí)AST亦可升高。而尿AMY約于發(fā)病后12～24h開始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期測(cè)定尿AMY更有價(jià)值。是否為抗酒石酸鹽的非PAP增高為毛細(xì)胞性白血病的重要鑒別要點(diǎn)。6、腹水LD／血清LD>0.由于ChE在肝臟合成后立即釋放到血漿中，故是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞合成功能的靈敏指標(biāo)，與清蛋白生成有密切關(guān)系，故測(cè)定血清ChE一般用作肝功能試驗(yàn)?；蛘咭?40nm波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)濁度的變化。各種CK同工酶還可進(jìn)一步根據(jù)所帶電荷和等電點(diǎn)不同分離數(shù)目不等的亞型。假如能同時(shí)測(cè)定AST，并計(jì)算AST／ALT之比，則對(duì)于急、慢性肝炎的診斷、鑒別診斷以及判斷轉(zhuǎn)歸也特別有價(jià)值。AST廣泛存在于多種器官中，按含量多少順序?yàn)樾?、肝、骨骼肌和腎等，肝中70％存在于肝細(xì)胞線粒體中。顯色后的區(qū)帶一般用光密度計(jì)或熒光計(jì)掃描定量分析。臨床上習(xí)慣用U／L來(lái)表示體液中酶催化濃度。11(一)電泳法

1．方法電泳法的使用最為廣泛。此法簡(jiǎn)便、快速、分離效果良好，并且一般不會(huì)破壞酶的天然狀態(tài)。目前國(guó)內(nèi)外的一些自動(dòng)化電泳分析系統(tǒng)則多采用分辨率更高的瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)，采用高壓或常壓電泳進(jìn)行各種同工酶及其亞型的分離與鑒定。此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。測(cè)定步驟主要分為區(qū)帶分離、活性顯色和檢測(cè)結(jié)果等。用電泳法進(jìn)行區(qū)帶分離的原理與其他蛋白電泳相似。(一)電泳法12

2．顯色染料

常用顯色染料有偶氮染料和四唑鹽等。它們易溶于水，難溶于一般的有機(jī)溶劑。酶學(xué)中只是利用所進(jìn)行的偶合反應(yīng)，由所生成不同顏色的偶氮色素進(jìn)行同工酶譜檢測(cè)，四唑鹽起著受氫體的作用，如將四唑鹽及雙四唑鹽分別還原成紫紅色的甲躦(formazan)和紫藍(lán)色的雙甲躦。常用的四唑鹽有：硝基四唑藍(lán)鹽(NBT)，碘化硝基四唑鹽(INT)、甲基噻唑四唑鹽(MTT)等。其中NBT生成的色素難以溶解，在局部區(qū)域染色良好，使用最多。2．顯色染料133．掃描定量

顯色后的區(qū)帶一般用光密度計(jì)或熒光計(jì)掃描定量分析。或?qū)⒈∧せ蚰z切割成小條或小薄片，分別浸泡在含緩沖液的試管中，低溫下將酶條帶洗脫，再進(jìn)行比色分析，亦可計(jì)算出各同工酶或亞型區(qū)帶的活力。3．掃描定量14圖6-6為瓊脂糖凝膠電泳分離的血清LD同工酶譜(圖譜中從左至右分別為L(zhǎng)D1-LD5)。圖6-6為瓊脂糖凝膠電泳分離的血清LD同工酶譜(圖譜中從左至154．注意事項(xiàng)

用電泳法進(jìn)行同工酶分析時(shí)，如顯示的區(qū)帶數(shù)與同工酶數(shù)不一致時(shí)，要特別注意巨分子酶的存在。巨分子酶形成的原因主要有：①酶與免疫球蛋白形成的復(fù)合物，如CK—BB-IgG、CK-MM-IgA、LD-IgA等；②酶與其他蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物，如LD-β-脂蛋白；③酶亞基或酶分子之間形成的聚合物，如CK—Mt聚合物、LD亞基自身聚合等。如患者臨床癥狀不明顯，血清酶活性不正常，同工酶圖譜異常時(shí)要特別警惕血清中有無(wú)巨分子酶，以免造成對(duì)酶測(cè)定結(jié)果的錯(cuò)誤判斷和臨床誤診。

4．注意事項(xiàng)16(二)色譜法

常用色譜法是柱色譜，如離子交換色譜和親和色譜等用于同工酶的提純與制備，但方法費(fèi)時(shí)繁瑣，通常不適合臨床同工酶常規(guī)檢測(cè)。目前國(guó)外已有供臨床同工酶分析用的商品化微型色譜柱。也有應(yīng)用陰離子交換色譜結(jié)合免疫化學(xué)法、聚焦色譜結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)法進(jìn)行CK亞型分析和研究的報(bào)道。(二)色譜法17(三)免疫分析法

由于同工酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，因而免疫化學(xué)性質(zhì)也不同。利用純化的同工酶免疫動(dòng)物制備特異性的抗血清，此抗體只與該同工酶產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。因此，抗原決定簇不同的同工酶可用特異的免疫反應(yīng)來(lái)識(shí)別。應(yīng)用較多的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法等。(三)免疫分析法18(四)動(dòng)力學(xué)分析法(五)蛋白酶水解法(四)動(dòng)力學(xué)分析法19第七節(jié)臨床常用血清酶、同工酶及其亞型分析

臨床上可根據(jù)酶濃度的變化用以輔助診斷。若酶濃度變化由細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜通透性變化引起，表示臟器或組織損傷；若為細(xì)胞內(nèi)酶合成增加所致，提示組織再生、修復(fù)、成骨或異位分泌，或提示有惡性腫瘤的可能；若為酶排泄障礙引起者說(shuō)明有梗阻存在。同工酶的分析與鑒定則能反應(yīng)疾病的部位、性質(zhì)和程度。第七節(jié)臨床常用血清酶、同工酶及其20由于酶廣泛分布于全身各器官、組織，在血清中升高的機(jī)制又不盡相同，因此單憑某一酶的活性變化，很難做出獨(dú)立診斷。若同時(shí)測(cè)定一組性質(zhì)不同的酶，比較各酶活性的變化，就能根據(jù)酶增高或減少的“譜型”做出診斷，此種同時(shí)檢測(cè)一組酶，稱為酶譜。由于酶廣泛分布于全身各器官、組織，在血清中升高的機(jī)制21酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制劑對(duì)酶AMI發(fā)病6～8h即升高，48～60h達(dá)到高峰，4～5d恢復(fù)正常。生長(zhǎng)期兒童血清內(nèi)ALP大多數(shù)來(lái)自成骨母細(xì)胞和生長(zhǎng)中的骨軟骨細(xì)胞，少量來(lái)自肝。(二)免疫化學(xué)測(cè)定的優(yōu)缺點(diǎn)一類是用酶活性濃度單位，如免疫抑制法測(cè)定CK-MB酶活性(actiyity)，結(jié)果常以U／L報(bào)告；如果血清中ALP持續(xù)低值，則阻塞性黃疸的可能性很小。6、腹水LD／血清LD>0.四、乳酸脫氫酶及其同工酶臨床上測(cè)定LD及其同工酶常用于診斷和鑒別診斷心、肝和骨骼肌的疾病。在405nm波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)測(cè)定吸光度值的變化，即可計(jì)算血清ChE的活性濃度。人體中胰腺含AMY最多，由胰泡細(xì)胞合成后通過(guò)胰管分泌人小腸，唾液腺也分泌大量AMY入口腔開始消化多糖化合物。通常把酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性的酶稱為工具酶。③酶亞基或酶分子之間形成的聚合物，如CK—Mt聚合物、LD亞基自身聚合等。臨床常規(guī)測(cè)定CK同工酶多用電泳和免疫抑制法，但兩法均會(huì)受溶血和巨CK的干擾，免疫抑制法還會(huì)受到CK-BB的干擾。HK各種CK同工酶還可進(jìn)一步根據(jù)所帶電荷和等電點(diǎn)不同分離數(shù)目不等的亞型。增加，而肝內(nèi)膽汁淤積、急性肝炎、原發(fā)性肝癌等主要表現(xiàn)為肝ALP增多，大多數(shù)不出現(xiàn)膽汁ALP。酶活性濃度測(cè)定是臨床酶學(xué)分析最為常用的方法。LD同工酶都出現(xiàn)LDl／LD2>1，即所謂“反轉(zhuǎn)比率”現(xiàn)象，且持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)。①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；目前國(guó)內(nèi)外的一些自動(dòng)化電泳分析系統(tǒng)則多采用分辨率更高的瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)，采用高壓或常壓電泳進(jìn)行各種同工酶及其亞型的分離與鑒定。5可作為AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。如：(1)心肌酶譜：傳統(tǒng)的心肌酶譜由CK、AST、LD和α-HBD組成，這一組合在我國(guó)臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室一直應(yīng)用至今。目前最簡(jiǎn)單而有效的心肌酶譜可由CK、CK-MB、CK-MB型或CK-MM型組成。近年來(lái)心肌酶譜在AMI的早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值受到了心肌肌鈣蛋白的挑戰(zhàn)。(2)肌酶譜：主要用于對(duì)骨骼肌疾病的診斷和監(jiān)護(hù)。可供選擇的酶有CK、LD、AST及其各自同工酶。若能再加CK-MM亞型則更為理想。酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制22(3)肝酶譜：主要是用來(lái)判斷有無(wú)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷、肝內(nèi)外膽汁淤積等肝膽疾病。(4)腫瘤酶譜：具有器官特異性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；非器官特異性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。(3)肝酶譜：23(5)胰酶譜：主要用于急性胰腺炎的診斷和鑒別診斷。可供選擇的有AMY及其同工酶、LPS、彈力蛋白酶-1、磷脂酶A2、尿胰蛋白酶原-2等。(5)胰酶譜：24一、轉(zhuǎn)氨酶及其同工酶(一)生物化學(xué)特性轉(zhuǎn)氨酶是一組催化氨基在氨基酸與α-酮酸間轉(zhuǎn)移的酶類，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和(天)門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)是其中最重要的兩種。

一、轉(zhuǎn)氨酶及其同工酶25

AST廣泛存在于多種器官中，按含量多少順序?yàn)樾摹⒏?、骨骼肌和腎等，肝中70％存在于肝細(xì)胞線粒體中。AST有兩種同工酶ASTs和ASTm，ASTs存在于可溶性的細(xì)胞質(zhì)中,ASTm存在于線粒體中。細(xì)胞輕度損傷時(shí)ASTs升高顯著，而嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，則ASTm大量出現(xiàn)于血清中。正常血清所含AST的同工酶主要為ASTs，但在病理狀態(tài)下，如細(xì)胞壞死，則血清中以ASTm為主。血清AST活性升高，多來(lái)自心肌或肝臟損傷；腎臟或胰腺細(xì)胞損傷時(shí)，也可出現(xiàn)很高的AST活性。AST廣泛存在于多種器官中，按含量多少順序?yàn)?6ALT大量存在于肝臟組織中，其次為腎、心、骨骼肌等。血清ALT活性升高，通常表示肝臟損傷。ALT有兩種不同活性的同工酶α(ALTs)、β(ALTm)，分別存在于細(xì)胞質(zhì)及線粒體，后者的活性為前者的16倍。肝細(xì)胞壞死血清中以ALTm為主。ALT大量存在于肝臟組織中，其次為腎、心、骨骼肌等。27(二)測(cè)定方法

轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定多用比色法，以賴氏法最常用。目前，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室多采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。

ALT速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)式為：

ALTL-丙氨酸+α-酮戊二酸L-谷氨酸+L-丙酮酸LD丙酮酸+NADH+H+L-乳酸+NAD+

(二)測(cè)定方法28AST速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)式為：ASTL-門冬氨酸+α-酮戊二酸草酰乙酸+L-谷氨酸MD

草酰乙酸+NADH+H+L-蘋果酸+NAD+

上述偶聯(lián)反應(yīng)中，NADH的氧化速率與標(biāo)本中酶活性呈正比，可在340nm檢測(cè)吸光度下降速率。根據(jù)線性反應(yīng)期吸光度下降速率(-△A／min)，計(jì)算出ALT、AST的活性濃度。AST速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)式為：29(三)臨床意義

ALT是反映肝損傷的一個(gè)很靈敏的指標(biāo)，臨床上主要用于肝臟疾病的診斷。各種急性病毒性肝炎、藥物或酒精中毒引起的急性肝損害時(shí)，血清ALT水平可在臨床癥狀(如黃疸)出現(xiàn)之前就急劇升高且ALT>AST。

(三)臨床意義30急性肝炎時(shí)血清ALT高低與臨床病情輕重相平行，且往往是肝炎恢復(fù)期最后降至正常的酶，是判斷急性肝炎是否恢復(fù)的一個(gè)很好指標(biāo)。假如能同時(shí)測(cè)定AST，并計(jì)算AST／ALT之比，則對(duì)于急、慢性肝炎的診斷、鑒別診斷以及判斷轉(zhuǎn)歸也特別有價(jià)值。急性肝炎時(shí)比值<1，肝硬化時(shí)比值≥2，肝癌時(shí)比值≥30．重癥肝炎時(shí)由于大量肝細(xì)胞壞死，血中ALT逐漸下降，而膽紅素卻進(jìn)行性升高，出現(xiàn)所謂“酶膽分離”現(xiàn)象，常是肝壞死的前兆。急性肝炎時(shí)血清ALT高低與臨床病情輕重相平行，且往往31AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的診斷。AMI發(fā)病6～8h即升高，48～60h達(dá)到高峰，4～5d恢復(fù)正常。但由于AST在AMI時(shí)升高遲于CK，恢復(fù)早于LD，故診斷AMI價(jià)值不大。在急性肝炎時(shí)，AST雖亦顯著升高，但升高程度不及ALT，而在慢性肝炎，特別是肝硬化時(shí)，AST升高程度超過(guò)ALT。膽道疾患時(shí)AST亦可升高。臨床上血清ALT、AST表現(xiàn)為輕度增加的有胰腺炎、乙醇性脂肪肝、肝硬化、肉芽腫、腫瘤；中度增加的有傳染性淋巴增多癥、慢性活動(dòng)性肝炎、肝外膽道梗塞、心肌梗死；重度增加的有病毒性肝炎、中毒性肝炎等。肝硬化、慢性活動(dòng)性肝炎和心肌梗死常有AST>ALT。AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的診斷。AMI發(fā)病32

二、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶(一)生物化學(xué)特征γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT或GGT)又稱γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，是一種線粒體酶。組織分布以腎臟含量最多，其次為胰、肺、肝等。血清中的γ-GT則主要來(lái)自肝膽，紅細(xì)胞中幾乎無(wú)γ-GT，因此溶血對(duì)其測(cè)定影響不大。γ-GT催化γ-谷氨酰基從谷胱甘肽(GSH)或其他含γ-谷氨酰基物質(zhì)中轉(zhuǎn)移到另一肽或氨基酸分子上。二、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶33根據(jù)酶促反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，可計(jì)算出酶活性濃度的高低。①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。由于ChE在肝臟合成后立即釋放到血漿中，故是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞合成功能的靈敏指標(biāo)，與清蛋白生成有密切關(guān)系，故測(cè)定血清ChE一般用作肝功能試驗(yàn)。但神經(jīng)疾病引起的肌萎縮，CK活性一般正常。有時(shí)單憑某一酶的活性變化，很難做出獨(dú)立診斷。一類以LD1為主，主要在心肌，可占總LD活性50％以上，也存在于紅細(xì)胞內(nèi)；在波長(zhǎng)405nm處連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度增高速率，計(jì)算ALP活性。膽堿酯酶(ChE)是一類催化酰基膽堿水解的酶類。ChE的真正生理功能至今尚未闡明。電泳法的使用最為廣泛。②特異性高，不受體液中其他物質(zhì)，如酶抑制劑、激活劑等的影響；0作為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)，但必須排除急性骨骼肌損傷。2．顯色染料由于ChE在肝臟合成后立即釋放到血漿中，故是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞合成功能的靈敏指標(biāo)，與清蛋白生成有密切關(guān)系，故測(cè)定血清ChE一般用作肝功能試驗(yàn)。6、腹水LD／血清LD>0.臨床上測(cè)定LD同工酶重癥肝炎時(shí)由于大量肝細(xì)胞壞死，血中ALT逐漸下降，而膽紅素卻進(jìn)行性升高，出現(xiàn)所謂“酶膽分離”現(xiàn)象，常是肝壞死的前兆。巨分子酶形成的原因主要有：假如能同時(shí)測(cè)定AST，并計(jì)算AST／ALT之比，則對(duì)于急、慢性肝炎的診斷、鑒別診斷以及判斷轉(zhuǎn)歸也特別有價(jià)值。此類方法可在400nm波長(zhǎng)下比濁，測(cè)出因橄欖油乳劑的變化吸光度的變化。本法簡(jiǎn)便、快速，易于自動(dòng)化。(二)測(cè)定方法

γ-GT的測(cè)定方法有數(shù)種，目前國(guó)內(nèi)外多采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定血清γ-GT活性。IFCC參考方法采用L-γ-谷氨酰-3-羧基—對(duì)硝基苯胺作為底物，以甘氨酰甘氨酸(雙甘肽)作為γ-谷氨?；氖荏w。在pH7.7的條件下，γ-GT催化底物生成γ-谷氨酰雙甘肽和黃色的2—硝基-5-氨基苯甲酸，在410nm波長(zhǎng)處直接連續(xù)監(jiān)測(cè)，吸光度的增高速率與γ-GT活性成正比關(guān)系。根據(jù)酶促反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，可計(jì)算出酶活性濃度34

(三)臨床意義

γ-GT是肝膽疾病檢出陽(yáng)性率最高的酶。膽道疾病如膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻時(shí)，γ-GT不僅陽(yáng)性率高，而且升高明顯。肝實(shí)質(zhì)疾病如肝炎、脂肪肝、肝硬化時(shí)γ-GT一般只是中度升高(ULN的2～5倍)，這點(diǎn)有助于肝膽疾病的鑒別診斷。若ALP升高而γ-GT正?？赏耆懦鼳LP的肝來(lái)源，若ALP和γ-GT均增加，則應(yīng)先排除肝外引起γ-GT增加的原因，一旦排除，則γ-GT增高即為肝病所致。(三)臨床意義35γ-GT還可用于判斷惡性腫瘤有無(wú)肝轉(zhuǎn)移，腫瘤患者如有γ-GT的升高，常說(shuō)明有肝轉(zhuǎn)移。γ-GT與乙醇的攝取量有關(guān)，飲酒時(shí)，由于乙醇對(duì)肝細(xì)胞線粒體的誘導(dǎo)導(dǎo)致γ-GT活性升高，故對(duì)乙醇性中毒的判定有相當(dāng)?shù)膬r(jià)值。長(zhǎng)期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者常有γ-GT升高。

γ-GT還可用于判斷惡性腫瘤有無(wú)肝轉(zhuǎn)移，腫瘤患者如有36用醋纖膜電泳可將γ-GT同工酶分為γ-GTl、γ-GT2、γ-GT3和γ-GT4四種，正常人只見γ-GT2和γ-GT3。重癥肝膽疾病和肝癌時(shí)常有γ-GTl出現(xiàn)，乙醇性肝壞死和膽總管結(jié)石時(shí)常有γ-GT2增加，膽總管結(jié)石及胰腺炎時(shí)γ-GT2也增加。γ-GT4與膽紅素增高密切相關(guān)。用醋纖膜電泳可將γ-GT同工酶分為γ-GTl、37三、肌酸激酶及其同工酶和亞型(一)生物化學(xué)特性

肌酸激酶(CK)催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的磷酸轉(zhuǎn)移的可逆性反應(yīng)，所產(chǎn)生的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收縮時(shí)能量的直接來(lái)源。CK廣泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦。CK是由M和B兩類亞基組成的二聚體。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在3種同工酶，即CK-BB(CK1)，CK-MB(CK2)和CK-MM(CK3)。在細(xì)胞線粒體內(nèi)還存在另一CK同工酶，即所謂線粒體CK(CK-Mt)，也稱CK4。各種CK同工酶還可進(jìn)一步根據(jù)所帶電荷和等電點(diǎn)不同分離數(shù)目不等的亞型。三、肌酸激酶及其同工酶和亞型38

(二)測(cè)定方法

CK的測(cè)定方法以酶偶聯(lián)法最常用，是CK的參考方法.有兩種工具酶及指示酶參與反應(yīng)。原理如下：CK磷酸肌酸+ADP

肌酸+ATPHKATP+葡萄糖

6-磷酸葡萄糖+ADP

G6PD6-磷酸葡萄糖+NADP+

6-磷酸葡萄糖酸鹽+NADPH+H+可在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定NADPH生成速率而計(jì)算CK活性濃度。

(二)測(cè)定方法39

臨床常規(guī)測(cè)定CK同工酶多用電泳和免疫抑制法，但兩法均會(huì)受溶血和巨CK的干擾，免疫抑制法還會(huì)受到CK-BB的干擾。因此現(xiàn)在推薦用免疫化學(xué)方法直接測(cè)定CK—MBmass，可不受溶血和巨CK的干擾。CK同工酶亞型(CK-MM型和CK-MB型)多用瓊脂糖凝膠高壓電泳和等電聚焦電泳等。

40酶可分為氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂解酶、異構(gòu)酶類和合成酶類等六大類。二、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶一類是用酶活性濃度單位，如免疫抑制法測(cè)定CK-MB酶活性(actiyity)，結(jié)果常以U／L報(bào)告；肝硬化、慢性活動(dòng)性肝炎和心肌梗死常有AST>ALT。此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。另一類采用人工合成底物1,2-二月桂基-rac-丙三氧基-3-戊二酸試靈酯設(shè)計(jì)的連續(xù)監(jiān)測(cè)法。一、概念第七節(jié)臨床常用血清酶、同工酶及其ATP+葡萄糖6-磷酸葡萄糖+ADP測(cè)定標(biāo)本應(yīng)及時(shí)分離血清(漿)并盡早測(cè)定。①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；但其診斷AMI特異性差，運(yùn)動(dòng)后、腎病綜合征等可呈現(xiàn)輕度升高(<3ULN)。按檢測(cè)方法分類主要方法有量氣法、分光光度法、熒光法和放射性核素法、電極法等，以分光光度法最常用。肝細(xì)胞壞死血清中以ALTm為主。臨床上檢測(cè)AMY用于胰腺炎診斷時(shí)，應(yīng)注意AMY增高幅度與病情不成比例，如原AMY已升高卻發(fā)生與癥狀不相應(yīng)的降低時(shí)，常為兇險(xiǎn)的壞死性胰腺炎的預(yù)兆。CK同工酶亞型(CK-MM型和CK-MB型)多用瓊脂糖凝膠高壓電泳和等電聚焦電泳等。由于酶廣泛分布于全身各器官、組織，在血清中升高的機(jī)制又不盡相同，因此單憑某一酶的活性變化，很難做出獨(dú)立診斷。其中NBT生成的色素難以溶解，在局部區(qū)域染色良好，使用最多。膽堿酯酶(ChE)是一類催化酰基膽堿水解的酶類。致，有時(shí)甚至出現(xiàn)兩者變化完全相反的情況。G6PD酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制劑對(duì)酶(三)臨床意義

CK及其同工酶和亞型是目前臨床上測(cè)定次數(shù)最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和腦疾患的診斷和鑒別診斷及預(yù)后判斷。AMI時(shí)總CK活性升高顯著，約在梗死后3～8h即升高，10～24h達(dá)峰值，3～4d恢復(fù)正常。CK極度升高(>3000U／L)主要見于全身疾病，特別是肌肉疾病，此時(shí)CK測(cè)定有助于肌萎縮病因的鑒別，如進(jìn)行性肌萎縮時(shí)可見CK顯著升高。酶可分為氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂解酶、異構(gòu)酶類和41此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。但神經(jīng)疾病引起的肌萎縮，CK活性一般正常。CK-MM亞型測(cè)定對(duì)早期AMI的檢出更為敏感，一般以CK-MM3／CK-MM1>1.0作為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)，但必須排除急性骨骼肌損傷。AMI發(fā)病2～4hCK-MM3／CK-MM1即開始升高，8～12h達(dá)峰值。CK-MB2亞型在AMI早期診斷和判斷有無(wú)再灌注上有很高的靈敏度和特異性。一般CK-MB2>1.9U／L或CK-MB2／CK-MBl>1.5可作為AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌42四、乳酸脫氫酶及其同工酶（一）生物化學(xué)特征乳酸脫氫酶(LD或LDH)催化乳酸氧化成丙酮酸，同時(shí)將氫轉(zhuǎn)移給輔酶而成為NADH，依條件不同而有可逆性。反應(yīng)式如下：L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD是一種含鋅的糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織中，以肝、心肌、腎、肌肉、紅細(xì)胞含量較多。四、乳酸脫氫酶及其同工酶43LD是由兩種不同亞基(M和H)組成的四聚體，形成5種結(jié)構(gòu)不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。這5種同工酶大致可分為三類：一類以LD1為主，主要在心肌，可占總LD活性50％以上，也存在于紅細(xì)胞內(nèi)；另一類以LD5為主，以橫紋肌為代表，肝臟中也有；第三類以LD3為主，存在于脾、肺。LD是由兩種不同亞基(M和H)組成的四聚體，形44(二)測(cè)定方法

目前根據(jù)LD催化反應(yīng)方向的不同，有兩大類測(cè)LD方法，一大類為以丙酮酸為底物的逆向反應(yīng)(稱LD-P法)；另一大類以乳酸為底物的順向反應(yīng)(稱LD-L法)。我國(guó)多采用目前IFCC參考方法LD-L法，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。LD同工酶測(cè)定以瓊脂糖凝膠電泳法更多用。一般成年人血中LD同工酶存在如下規(guī)律：LD2>LDl>LD3>LD4>LD5，部分正常兒童血中可見LDl>LD2。(二)測(cè)定方法45(三)臨床意義

臨床上測(cè)定LD及其同工酶常用于診斷和鑒別診斷心、肝和骨骼肌的疾病。AMI時(shí)，LD由于分子量較大，在常用心肌酶中升高最遲，通常在梗死8～18h升高，48～144h達(dá)峰值，可顯著升高(>5ULN)，因其半壽期較長(zhǎng)，增高持續(xù)時(shí)間可達(dá)5～10d，此時(shí)其他酶已恢復(fù)正常，在亞急性心肌梗死診斷上有一定價(jià)值。但其診斷AMI特異性差，運(yùn)動(dòng)后、腎病綜合征等可呈現(xiàn)輕度升高(<3ULN)。肝炎、休克、白血病、溶血性貧血及晚期惡性腫瘤等均可有中度或顯著升高。(三)臨床意義46測(cè)定血清及胸腹水中LD含量常用來(lái)鑒別其為漏出液抑或滲出液，若胸水LD／血清LD>0.6、腹水LD／血清LD>0.4為滲出液，反之為漏出液。測(cè)定血清及胸腹水中LD含量常用來(lái)鑒別其為漏出液47臨床上測(cè)定LD同工酶有助于相應(yīng)組織病變的診斷。心肌梗死和心肌炎時(shí)以LD1和LD2升高為主，且絕大多數(shù)的AMI患者血中LD同工酶都出現(xiàn)LDl／LD2>1，即所謂“反轉(zhuǎn)比率”現(xiàn)象，且持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)。

臨床上測(cè)定LD同工酶48

骨骼肌和肝細(xì)胞損傷時(shí)常出現(xiàn)LD5>LD4。肺、胰、脾、淋巴結(jié)壞死和炎癥及各種惡性疾病時(shí)LD2、LD3、LD4升高；溶血性疾病時(shí)LD1和LD2升高，但仍為L(zhǎng)D2>LD1；惡性腫瘤如轉(zhuǎn)移到肝臟往往伴有LD4、LD5升高。骨骼肌和肝細(xì)胞損傷時(shí)常出現(xiàn)LD5>LD4。49五、堿性磷酸酶及其同工酶

(一)生物化學(xué)特征堿性磷酸酶(ALP)廣泛存在于各器官組織中，其含量以肝臟為最多，其次為腎臟、胎盤、小腸、骨骼等。血清中ALP主要來(lái)自肝臟和骨骼。生長(zhǎng)期兒童血清內(nèi)ALP大多數(shù)來(lái)自成骨母細(xì)胞和生長(zhǎng)中的骨軟骨細(xì)胞，少量來(lái)自肝。尿中ALP并非來(lái)自血液，而是直接來(lái)自腎小管細(xì)胞。人體各組織ALP同工酶可分為3大類，即胎盤ALP、腸ALP和肝／骨／腎ALP同工酶。五、堿性磷酸酶及其同工酶50(二)測(cè)定方法

ALP的測(cè)定方法有多種，目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多的方法為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，以磷酸對(duì)硝基酚(4-NPP)為底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)或二乙醇胺(DEA)激活型緩沖液為磷酸?；氖荏w。4-NPP在堿性溶液中為五色，在ALP催化下，4-NPP分裂出磷酸基團(tuán)，生成游離的對(duì)硝基苯酚。后者在堿性溶液中轉(zhuǎn)變成醌式結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)較深的黃色。在波長(zhǎng)405nm處連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度增高速率，計(jì)算ALP活性。

(二)測(cè)定方法51(三)臨床意義

在骨生長(zhǎng)、妊娠、成長(zhǎng)、成熟和脂肪餐后分泌等生理情況下，ALP活性可增高。除外上述生理性增高，臨床上測(cè)定ALP主要用于骨骼、肝膽系統(tǒng)疾病等的診斷和鑒別診斷，尤其是黃疸的鑒別診斷。對(duì)于原因不明的高ALP血清水平，可測(cè)定同工酶以協(xié)助明確其器官來(lái)源。

(三)臨床意義52長(zhǎng)期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者常有γ-GT升高。假如能同時(shí)測(cè)定AST，并計(jì)算AST／ALT之比，則對(duì)于急、慢性肝炎的診斷、鑒別診斷以及判斷轉(zhuǎn)歸也特別有價(jià)值。一、概念此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。膽堿酯酶(ChE)是一類催化酰基膽堿水解的酶類。急性肝炎時(shí)比值<1，肝硬化時(shí)比值≥2，肝癌時(shí)比值≥30．臨床上測(cè)定LD及其同工酶常用于診斷和鑒別診斷心、肝和骨骼肌的疾病。①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；膽堿酯酶(ChE)是一類催化?；憠A水解的酶類。具有器官特異性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；活性也有影響，因而酶活性常不能正確反映酶的情況，出現(xiàn)酶活性與酶蛋白絕對(duì)量不一而尿AMY約于發(fā)病后12～24h開始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期測(cè)定尿AMY更有價(jià)值。血清中的γ-GT則主要來(lái)自肝膽，紅細(xì)胞中幾乎無(wú)γ-GT，因此溶血對(duì)其測(cè)定影響不大。這5種同工酶大致可分為三類：在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中，許多代謝物濃度的測(cè)定往往使用有工具酶的參與的反應(yīng)，即所謂共通反應(yīng)途徑。丁酰硫代膽堿法是目前測(cè)定血清ChE最常用的方法。致，有時(shí)甚至出現(xiàn)兩者變化完全相反的情況。此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。2．顯色染料臨床上還可利用酶的抗原性，通過(guò)免疫化學(xué)方法直接進(jìn)行酶濃度測(cè)定。急性肝炎時(shí)比值<1，肝硬化時(shí)比值≥2，肝癌時(shí)比值≥30．酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制劑對(duì)酶急性肝炎包括病毒性肝炎和中毒性肝炎，ALP增高達(dá)2～5ULN，而肝硬化、膽石癥和腫瘤引起的膽汁淤積，ALP增高達(dá)ULN的5～20倍。90％以上的肝外膽道阻塞患者血清ALP升高，升高的程度常和阻塞程度及病程成正比。如果血清中ALP持續(xù)低值，則阻塞性黃疸的可能性很小。若血清膽紅素逐漸升高，而ALP不斷下降表示病情惡化。長(zhǎng)期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者常有γ-GT升高。53肝外阻塞性黃疸、轉(zhuǎn)移性肝癌、肝膿腫和膽石癥時(shí)膽汁ALP檢出率很高，并伴有肝ALP增加，而肝內(nèi)膽汁淤積、急性肝炎、原發(fā)性肝癌等主要表現(xiàn)為肝ALP增多，大多數(shù)不出現(xiàn)膽汁ALP。各種疾病所致骨損傷等，均引起ALP活性升高，尤其是骨ALP同工酶增高。肝外阻塞性黃疸、轉(zhuǎn)移性肝癌、肝膿腫和膽石癥時(shí)膽汁AL54六、酸性磷酸酶及其同工酶

(一)生物化學(xué)特征酸性磷酸酶(ACP)存在于人體不同組織，如前列腺、紅細(xì)胞等，主要存在于細(xì)胞的溶酶體中，以前列腺含量最多。正常男性血清中ACP約主要來(lái)自前列腺，其余部分及女子血清中的ACP可能來(lái)自血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞及破骨細(xì)胞等。ACP同工酶分前列腺ACP(PAP)和非前列腺ACP(如紅細(xì)胞ACP、溶酶體ACP、破骨細(xì)胞或吞噬細(xì)胞ACP等)兩大類，在前列腺中含有豐富的PAP，比其他組織約多100倍。測(cè)定標(biāo)本應(yīng)及時(shí)分離血清(漿)并盡早測(cè)定。六、酸性磷酸酶及其同工酶55(二)測(cè)定方法

ACP的測(cè)定底物、原理和方法與ALP相似，只是反應(yīng)pH為酸性。國(guó)外多推薦使用磷酸百里酚酞為底物的比色法，因?yàn)镻AP對(duì)此底物親和力高，測(cè)定結(jié)果基本能反映ACP含量高低。此外還可通過(guò)用L-酒石酸這類抑制劑鑒別和估量PAP活性。由于ACP不穩(wěn)定，酶活性測(cè)定困難，目前已發(fā)展一些免疫學(xué)方法特異而靈敏地測(cè)定ACP(特別是PAP)。(二)測(cè)定方法56(三)臨床意義

ACP及其同工酶測(cè)定主要用于診斷前列腺癌。前列腺癌時(shí)血清ACP活性顯著升高，前列腺癌患者血清PAP也明顯增高，其中腫瘤分化較好者增高尤為顯著。急性尿潴留、變形性骨炎、癌腫骨轉(zhuǎn)移及甲亢時(shí)ACP可輕度升高。是否為抗酒石酸鹽的非PAP增高為毛細(xì)胞性白血病的重要鑒別要點(diǎn)。(三)臨床意義57

七、淀粉酶及其同工酶

(一)生物化學(xué)特征淀粉酶(AMY)：人和動(dòng)物只含α-AMY。人體中胰腺含AMY最多，由胰泡細(xì)胞合成后通過(guò)胰管分泌人小腸，唾液腺也分泌大量AMY入口腔開始消化多糖化合物。AMY是一種需鈣的金屬酶，其最適pH在6.5～7.5之間，鹵素和其他陰離子有激活作用。AMY分子量較小，易由腎臟排出，半壽期很短，約2h，所以病變時(shí)血清AMY增高持續(xù)時(shí)間很短。除肝素外，其他抗凝劑如枸櫞酸、草酸鹽及EDTA等都有抑制作用，故不宜用去鈣血漿測(cè)定AMY。七、淀粉酶及其同工酶58(二)測(cè)定方法

國(guó)內(nèi)外目前測(cè)定AMY應(yīng)用較多的是以麥芽多糖為底物的方法，如2-氯-對(duì)硝基苯麥芽三糖苷(CNP-G3)和亞乙基封閉的對(duì)硝基苯麥芽庚糖苷(4NP-C7)法(亦稱EPS法)，以后者最常用，也是IFCC的推薦方法。反應(yīng)最后生成對(duì)硝基苯酚，其生成量在一定范圍內(nèi)與AMY活性成比，在405nm可以進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)即可測(cè)出AMY的活性。(二)測(cè)定方法59(三)臨床意義

長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，AMY水平一直作為評(píng)價(jià)胰腺外分泌功能的一種輔助診斷指標(biāo)。人體胰腺和腮腺組織損傷時(shí)，血清和尿中的總AMY可顯著增高，腎功能不全患者也有部分AMY增高。(三)臨床意義60

在急性胰腺炎發(fā)病后2～3hAMY開始升高，多在12～24h達(dá)峰值，2～5d下降至正常。如持續(xù)性升高達(dá)數(shù)周，常提示胰腺炎有反復(fù)，或有并發(fā)癥發(fā)生。而尿AMY約于發(fā)病后12～24h開始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期測(cè)定尿AMY更有價(jià)值。臨床上檢測(cè)AMY用于胰腺炎診斷時(shí)，應(yīng)注意AMY增高幅度與病情不成比例，如原AMY已升高卻發(fā)生與癥狀不相應(yīng)的降低時(shí)，常為兇險(xiǎn)的壞死性胰腺炎的預(yù)兆。AMY水平正常也不能完全排除急性胰腺炎。在急性胰腺炎發(fā)病后2～3hAMY開始升高，多在12～261堿性磷酸酶(ALP)廣泛存在于各器官組織中，其含量以肝臟為最多，其次為腎臟、胎盤、小腸、骨骼等。但其診斷AMI特異性差，運(yùn)動(dòng)后、腎病綜合征等可呈現(xiàn)輕度升高(<3ULN)。ALT是反映肝損傷的一個(gè)很靈敏的指標(biāo)，臨床上主要用于肝臟疾病的診斷。膽堿酯酶(ChE)是一類催化酰基膽堿水解的酶類。假如能同時(shí)測(cè)定AST，并計(jì)算AST／ALT之比，則對(duì)于急、慢性肝炎的診斷、鑒別診斷以及判斷轉(zhuǎn)歸也特別有價(jià)值。各種急性病毒性肝炎、藥物或酒精中毒引起的急性肝損害時(shí)，血清ALT水平可在臨床癥狀(如黃疸)出現(xiàn)之前就急劇升高且ALT>AST。ChE的真正生理功能至今尚未闡明。致，有時(shí)甚至出現(xiàn)兩者變化完全相反的情況。此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。酶學(xué)中只是利用所進(jìn)行的偶合反應(yīng)，由所生成不同顏色的偶氮色素進(jìn)行同工酶譜檢測(cè)，四唑鹽起著受氫體的作用，如將四唑鹽及雙四唑鹽分別還原成紫紅色的甲躦(formazan)和紫藍(lán)色的雙甲躦。我國(guó)多采用目前IFCC參考方法LD-L法，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。正常情況下血清中酶活性相對(duì)恒定。膽堿酯酶(ChE)是一類催化?；憠A水解的酶類。AMI發(fā)病2～4hCK-MM3／CK-MM1即開始升高，8～12h達(dá)峰值。其中NBT生成的色素難以溶解，在局部區(qū)域染色良好，使用最多。亞型某些酶或同工酶從組織進(jìn)入體液后，可進(jìn)一步變化為數(shù)個(gè)不同類型即所謂“亞型，也稱為同工型(isoform)”?；钚砸灿杏绊?，因而酶活性常不能正確反映酶的情況，出現(xiàn)酶活性與酶蛋白絕對(duì)量不一γ-GT與乙醇的攝取量有關(guān)，飲酒時(shí)，由于乙醇對(duì)肝細(xì)胞線粒體的誘導(dǎo)導(dǎo)致γ-GT活性升高，故對(duì)乙醇性中毒的判定有相當(dāng)?shù)膬r(jià)值。細(xì)胞輕度損傷時(shí)ASTs升高顯著，而嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，則ASTm大量出現(xiàn)于血清中。ALP的測(cè)定方法有多種，目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多的方法為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，以磷酸對(duì)硝基酚(4-NPP)為底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)或二乙醇胺(DEA)激活型緩沖液為磷酸?；氖荏w。于550nm波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度的變化即可計(jì)算LPS活性濃度。三、肌酸激酶及其同工酶和亞型八、脂肪酶

(一)生物化學(xué)特征脂肪酶(Lipase，LPS或LlP)是胰腺外分泌酶。LPS可被巰基化合物、膽汁酸、Ca2+及輔脂肪酶等激活劑激活，而被重金屬、絲氨酸所抑制。血清中LPS主要來(lái)自胰腺，少量來(lái)自胃腸粘膜。堿性磷酸酶(ALP)廣泛存在于各器官組織中，其含量以肝臟為62

(二)測(cè)定方法

迄今測(cè)定LPS的方法可分為3類：測(cè)定產(chǎn)物(游離脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分光光度法、熒光法和pH電極法等)；測(cè)定底物的減少量(如比濁法、擴(kuò)散法等)；測(cè)定LPS的實(shí)際質(zhì)量(雙抗體夾心免疫分析法、乳膠凝集法)。目前在國(guó)內(nèi)大多實(shí)驗(yàn)室主要以滴定法、比濁法和分光光度法為主。(二)測(cè)定方法63

比濁法以橄欖油懸液為底物，其與水混合常呈乳糜狀，血清中的LPS分解橄欖油乳劑生成水溶性的甘油和脂肪酸，濁度隨之下降，根據(jù)濁度降低的程度，可計(jì)算出LPS活性濃度。此類方法可在400nm波長(zhǎng)下比濁，測(cè)出因橄欖油乳劑的變化吸光度的變化?；蛘咭?40nm波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)濁度的變化。以連續(xù)監(jiān)測(cè)法為常用。比濁法以橄欖油懸液為底物，其與水混合常呈乳糜狀，血清64分光光度法目前有兩類比較常用：

一類為酶偶聯(lián)顯色比色法，多用1，2-甘油二酯為底物，在LPS和單酸甘油酯脂肪酶的催化下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通過(guò)甘油激酶作用生成3-磷酸甘油，再通過(guò)甘油磷酸氧化酶／過(guò)氧化物酶體系和4-AAP色素原體系產(chǎn)生紫紅色。于550nm波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度的變化即可計(jì)算LPS活性濃度。此類方法特異性高，通過(guò)雙試劑也基本可解決內(nèi)源性甘油的干擾問題。分光光度法目前有兩類比較常用：65另一類采用人工合成底物1,2-二月桂基-rac-丙三氧基-3-戊二酸試靈酯設(shè)計(jì)的連續(xù)監(jiān)測(cè)法。該底物在堿性環(huán)境中，在LPS和輔脂肪酶作用下，水解生成1,2-二月桂基甘油和戊二酸-6’-甲基試鹵靈。后者不穩(wěn)定，可自發(fā)分解生成戊二酸和甲基試鹵靈。甲基試鹵靈在577nm波長(zhǎng)附近有吸收峰，連續(xù)監(jiān)測(cè)其吸光度變化可定量測(cè)定LPS活性濃度。此法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定和抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)。另一類采用人工合成底物1,2-二月桂基-rac-丙三66(三)臨床意義

正常人血清LPS含量極少，但在急性胰腺炎時(shí)，2～12h血清LPS顯著升高，24h至峰值，可達(dá)10ULN，甚至50～60ULN，至48-72h可能恢復(fù)正常，但隨后又可持續(xù)升高8～15d。由于血清LPS在急性胰腺炎時(shí)活性升高的時(shí)間早，上升的幅度的大，持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，故其診斷價(jià)值優(yōu)于AMY。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，凡血清AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高，約有2／3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰腺炎的急腹癥有血清AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝膽疾患等血清LPS可有不同程度的升高。(三)臨床意義67

九、膽堿酯酶

(一)生物化學(xué)特征膽堿酯酶(ChE)是一類催化?；憠A水解的酶類。人體主要有兩種，即乙酰膽堿酯酶(AChE)又稱真性膽堿酯酶或膽堿酯酶Ⅰ、丁酰膽堿酯酶(BuChE)又稱假性膽堿酯酶或稱擬乙酰膽堿酯酶(PChE)或膽堿酯酶Ⅱ。臨床常規(guī)檢查的膽堿酯酶(SChE)即指后者，通常簡(jiǎn)稱為ChE。九、膽堿酯酶68

AChE主要分布于神經(jīng)組織、肌肉、紅細(xì)胞、肺等處，其生理功能是催化水解乙酰膽堿，能使神經(jīng)細(xì)胞反復(fù)除極。ChE／BuChE主要在肝臟合成，也分布于胰臟、心臟、小腸粘膜、大腦灰質(zhì)、血漿及淋巴液等處。ChE的真正生理功能至今尚未闡明。許多抑制劑對(duì)兩種ChE有抑制作用，如生物堿(嗎啡、毒扁豆堿)、枸櫞酸鹽、氟化物、有機(jī)磷殺蟲劑等AChE主要分布于神經(jīng)組織、肌肉、紅細(xì)胞69

(二)測(cè)定方法主要有兩類方法用于臨床常規(guī)ChE測(cè)定，一類以乙酰膽堿為底物，測(cè)定水解反應(yīng)生成的酸。常用指示劑(如間-硝基酚或溴百里酚藍(lán))測(cè)pH法。特別是紙片法簡(jiǎn)便快速，適用于急診有機(jī)磷中毒的快速篩查。但此類方法準(zhǔn)確度較差。另一類以人工合成底物測(cè)定膽堿衍生物的生成。(二)測(cè)定方法70丁酰硫代膽堿法是目前測(cè)定血清ChE最常用的方法。測(cè)定原理如下：丁酰硫代膽堿+H2O

*又稱Ellman試劑或簡(jiǎn)稱DTNB

在405nm波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)測(cè)定吸光度值的變化，即可計(jì)算血清ChE的活性濃度。本法簡(jiǎn)便、快速，易于自動(dòng)化。但只能測(cè)定血清ChE，而不能測(cè)定紅細(xì)胞AChE。丁酰硫代膽堿法是目前測(cè)定血清ChE最常用的方法。測(cè)定原理如下71LD是由兩種不同亞基(M和H)組成的四聚體，形成5種結(jié)構(gòu)不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，AMY水平一直作為評(píng)價(jià)胰腺外分泌功能的一種輔助診斷指標(biāo)。細(xì)胞輕度損傷時(shí)ASTs升高顯著，而嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，則ASTm大量出現(xiàn)于血清中。臨床上檢測(cè)AMY用于胰腺炎診斷時(shí)，應(yīng)注意AMY增高幅度與病情不成比例，如原AMY已升高卻發(fā)生與癥狀不相應(yīng)的降低時(shí)，常為兇險(xiǎn)的壞死性胰腺炎的預(yù)兆。此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。(2)肌酶譜：主要用于對(duì)骨骼肌疾病的診斷和監(jiān)護(hù)。重癥肝炎時(shí)由于大量肝細(xì)胞壞死，血中ALT逐漸下降，而膽紅素卻進(jìn)行性升高，出現(xiàn)所謂“酶膽分離”現(xiàn)象，常是肝壞死的前兆。酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制劑對(duì)酶有時(shí)單憑某一酶的活性變化，很難做出獨(dú)立診斷。90％以上的肝外膽道阻塞患者血清ALP升高，升高的程度常和阻塞程度及病程成正比。血清中LPS主要來(lái)自胰腺，少量來(lái)自胃腸粘膜。目前國(guó)內(nèi)外的一些自動(dòng)化電泳分析系統(tǒng)則多采用分辨率更高的瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)，采用高壓或常壓電泳進(jìn)行各種同工酶及其亞型的分離與鑒定。測(cè)定LPS的實(shí)際質(zhì)量(雙抗體夾心免疫分析法、乳膠凝集法)。臨床上以檢測(cè)血清酶和同工酶應(yīng)用最廣，根據(jù)需要也可測(cè)定其他各種體液(如尿液、胸腔積液、腹水、腦脊液等)中的酶和同工酶或亞型。若為細(xì)胞內(nèi)酶合成增加所致，提示組織再生、修復(fù)、成骨或異位分泌，或提示有惡性腫瘤的可能；腎臟或胰腺細(xì)胞損傷時(shí)，也可出現(xiàn)很高的AST活性。②特異性高，不受體液中其他物質(zhì)，如酶抑制劑、激活劑等的影響；①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；一、概念一、概念通常把酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性的酶稱為工具酶。肝炎、休克、白血病、溶血性貧血及晚期惡性腫瘤等均可有中度或顯著升高。(三)臨床意義

血漿或血清中AChE的含量甚微，臨床上測(cè)定紅細(xì)胞中的AChE用于有機(jī)磷中毒的診斷。由于ChE在肝臟合成后立即釋放到血漿中，故是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞合成功能的靈敏指標(biāo)，與清蛋白生成有密切關(guān)系，故測(cè)定血清ChE一般用作肝功能試驗(yàn)。肝、膽疾病時(shí)ALT、γ-GT均升高，往往難以鑒別，如增加血清ChE測(cè)定，可發(fā)現(xiàn)ChE降低者均為肝臟疾患，而正常者多為膽道疾患。血清ChE減少主要見于肝病和有機(jī)磷中毒，增加主要見于腎病綜合征。LD是由兩種不同亞基(M和H)組成的四聚體，形成5種結(jié)構(gòu)不同72

小結(jié)

酶是能催化生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的一類特殊蛋白質(zhì)。體內(nèi)大多數(shù)酶為結(jié)合酶，除含酶蛋白外，還含有輔因子(輔酶和輔基)。酶可分為氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂解酶、異構(gòu)酶類和合成酶類等六大類。酶促反應(yīng)具有高效、高度特異性和可調(diào)節(jié)性等特點(diǎn)，影響因素主要有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、電解質(zhì)及輔酶、激活劑及抑制劑等。其中底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響可用米-曼氏方程表示。小結(jié)73血漿酶可分成血漿特異酶和非血漿特異酶兩大類，后者可再分為外分泌酶和細(xì)胞酶等。正常情況下血清中酶活性相對(duì)恒定。但一些病理情況常導(dǎo)致血清中酶活性的改變。性別、年齡、運(yùn)動(dòng)、妊娠、人種及環(huán)境因素等可引起人血清中某些酶的生理性變化。血漿酶可分成血漿特異酶和非血漿特異酶兩大類，后者可再74

酶活性濃度測(cè)定是臨床酶學(xué)分析最為常用的方法。根據(jù)酶促反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，可計(jì)算出酶活性濃度的高低。按檢測(cè)方法分類主要方法有量氣法、分光光度法、熒光法和放射性核素法、電極法等，以分光光度法最常用。酶活性濃度測(cè)定是臨床酶學(xué)分析最為常用的方法。根據(jù)酶75按反應(yīng)時(shí)間分類，可分為定時(shí)法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法兩大類。其中連續(xù)監(jiān)測(cè)法是目前臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的方法，可分為直接法和間接法兩大類。直接法是在不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過(guò)測(cè)定吸光度、熒光等，從而計(jì)算出酶活性濃度。其中以分光光度法應(yīng)用最為廣泛。間接法以酶偶聯(lián)法應(yīng)用最多。測(cè)定酶活性濃度時(shí)可受到一些如其他酶和物質(zhì)的干擾、酶的污染、非酶反應(yīng)、分析容器的污染和沉淀形成等因素的影響，可通過(guò)試劑空白管檢出并加以校正或改用雙試劑加以解決。按反應(yīng)時(shí)間分類，可分為定時(shí)法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法兩大類76

通常把酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性的酶稱為工具酶。在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中，許多代謝物濃度的測(cè)定往往使用有工具酶的參與的反應(yīng)，即所謂共通反應(yīng)途徑。用自動(dòng)生物化學(xué)分析儀進(jìn)行酶學(xué)測(cè)定時(shí)，要合理選擇方法并進(jìn)行參數(shù)的設(shè)置。在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存時(shí)要特別注意溶血、抗凝劑及溫度等技術(shù)因素對(duì)測(cè)定的影響。通常把酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性的酶稱77

用自動(dòng)生物化學(xué)分析儀進(jìn)行酶學(xué)測(cè)定時(shí)，要合理選擇方法并進(jìn)行參數(shù)的設(shè)置。在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存時(shí)要特別注意溶血、抗凝劑及溫度等技術(shù)因素對(duì)測(cè)定的影響。酶活性單位有慣用單位、國(guó)際單位和Katal單位。臨床上習(xí)慣用U／L來(lái)表示體液中酶催化濃度。用自動(dòng)生物化學(xué)分析儀進(jìn)行酶學(xué)測(cè)定時(shí)，要合理選擇方法并進(jìn)78酶測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化工作可從使用推薦方法和參考方法、使用公認(rèn)的酶校正物或酶參考物兩方面人手。近來(lái)IFCC決定建立包括參考測(cè)定方法、參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)和參考物等要素在內(nèi)的酶催化濃度測(cè)定的全球參比體系。

酶測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化工作可從使用推薦方法和參考方法、使用公認(rèn)的79臨床上還可利用酶的抗原性，通過(guò)免疫化學(xué)方法直接進(jìn)行酶濃度測(cè)定。與傳統(tǒng)的酶活性濃度測(cè)定法相比，這些免疫化學(xué)法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，能用于一些不表現(xiàn)酶活性或無(wú)活性的酶測(cè)定，而且特別適用于同工酶的測(cè)定。臨床上還可利用酶的抗原性，通過(guò)免疫化學(xué)方法直接進(jìn)行酶濃度80

同工酶是具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布和細(xì)胞內(nèi)定位不同的一類酶。亞型指基因在編碼過(guò)程中，由于翻譯修飾差異所形成的多種形式的一類酶。往往在基因編碼產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)釋人血漿時(shí)因肽酶的降解作用而形成。同工酶的分析大致可分為兩步，即首先精確地分離出某酶的各同工酶組分，然后測(cè)定酶的總活性和各同工酶組分的活性。常用方法有電泳法、色譜法、免疫分析法、動(dòng)力學(xué)分析法和蛋白酶水解法等。臨床常規(guī)中以電泳法最常用。同工酶是具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、81臨床上以檢測(cè)血清酶和同工酶應(yīng)用最廣，根據(jù)需要也可測(cè)定其他各種體液(如尿液、胸腔積液、腹水、腦脊液等)中的酶和同工酶或亞型。有時(shí)單憑某一酶的活性變化，很難做出獨(dú)立診斷。若同時(shí)測(cè)定一組性質(zhì)不同的酶，比較各酶活性的變化，就能根據(jù)酶增高或減少的“譜型”做出診斷，此種同時(shí)檢測(cè)一組酶，稱為酶譜。常用的如心肌酶譜、肌酶譜、肝酶譜、腫瘤酶譜和胰酶譜等。臨床上以檢測(cè)血清酶和同工酶應(yīng)用最廣，根據(jù)需要也可測(cè)定其他82此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。一般成年人血中LD同工酶存在如下規(guī)律：LD2>LDl>LD3>LD4>LD5，部分正常兒童血中可見LDl>LD2。而尿AMY約于發(fā)病后12～24h開始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期測(cè)定尿AMY更有價(jià)值。主要用于急性胰腺炎的診斷和鑒別診斷。丁酰硫代膽堿+H2OALT大量存在于肝臟組織中，其次為腎、心、骨骼肌等。③能用于一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白，如各種酶原或去輔基酶蛋白，或因遺傳變異而導(dǎo)致合成無(wú)活性的酶蛋白的酶測(cè)定；八、脂肪酶有時(shí)單憑某一酶的活性變化，很難做出獨(dú)立診斷。血清ALT活性升高，通常表示肝臟損傷。肌酸激酶(CK)催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的磷酸轉(zhuǎn)移的可逆性反應(yīng)，所產(chǎn)生的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收縮時(shí)能量的直接來(lái)源。(一)測(cè)定原理臨床上檢測(cè)AMY用于胰腺炎診斷時(shí)，應(yīng)注意AMY增高幅度與病情不成比例，如原AMY已升高卻發(fā)生與癥狀不相應(yīng)的降低時(shí)，常為兇險(xiǎn)的壞死性胰腺炎的預(yù)兆。另一大類以乳酸為底物的順向反應(yīng)(稱LD-L法)。第五節(jié)酶的免疫化學(xué)測(cè)定③酶亞基或酶分子之間形成的聚合物，如CK—Mt聚合物、LD亞基自身聚合等。但由于AST在AMI時(shí)升高遲于CK，恢復(fù)早于LD，故診斷AMI價(jià)值不大。γ-GT催化γ-谷氨?；鶑墓入赘孰?GSH)或其他含γ-谷氨?；镔|(zhì)中轉(zhuǎn)移到另一肽或氨基酸分子上。各種急性病毒性肝炎、藥物或酒精中毒引起的急性肝損害時(shí)，血清ALT水平可在臨床癥狀(如黃疸)出現(xiàn)之前就急劇升高且ALT>AST。增加，而肝內(nèi)膽汁淤積、急性肝炎、原發(fā)性肝癌等主要表現(xiàn)為肝ALP增多，大多數(shù)不出現(xiàn)膽汁ALP。酶的免疫化學(xué)測(cè)定也有其局限性。CK是由M和B兩類亞基組成的二聚體。謝謝！此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技83第五節(jié)酶的免疫化學(xué)測(cè)定

二十世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，酶的定量分析技術(shù)中出現(xiàn)了許多利用酶蛋白的抗原性，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)直接測(cè)定酶的免疫化學(xué)測(cè)定法。與經(jīng)典的測(cè)定酶活性方法比較，這些方法不僅靈敏度高，而且能測(cè)定一些以前不易測(cè)定或測(cè)定條件不易掌握的酶。第五節(jié)酶的免疫化學(xué)測(cè)定84

(一)測(cè)定原理

放射免疫測(cè)定(RIA)分為直接法與間接法。

直接法是將放射性核素標(biāo)記的酶分子與相應(yīng)抗體作用產(chǎn)生沉淀，然后將沉淀分離并進(jìn)行定量測(cè)定。

間接法是將樣品中無(wú)放射性的酶蛋白與放射性標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)酶共同對(duì)有限量的抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，根據(jù)其競(jìng)爭(zhēng)程度來(lái)定量樣品中的酶蛋白量。以間接法為最常用。(一)測(cè)定原理85

另外還有免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(CLIA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、熒光酶免疫測(cè)定(FEIA)等。報(bào)告方式有兩類：一類是用酶活性濃度單位，如免疫抑制法測(cè)定CK-MB酶活性(actiyity)，結(jié)果常以U／L報(bào)告；另一類是用質(zhì)量濃度單位，如用免疫學(xué)方法測(cè)定CK-MB酶質(zhì)量(mass)(即蛋白量)，結(jié)果常直接用ng／ml或6μg／L報(bào)告。另外還有免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(86(二)免疫化學(xué)測(cè)定的優(yōu)缺點(diǎn)

血清酶活性變化分為酶蛋白質(zhì)量和酶活性同步變化及酶蛋白質(zhì)量未變而酶活性變化兩種情況。酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制劑對(duì)酶活性也有影響，因而酶活性常不能正確反映酶的情況，出現(xiàn)酶活性與酶蛋白絕對(duì)量不一致，有時(shí)甚至出現(xiàn)兩者變化完全相反的情況。(二)免疫化學(xué)測(cè)定的優(yōu)缺點(diǎn)87與傳統(tǒng)的酶活性測(cè)定法相比，免疫化學(xué)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)主要有：①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；②特異性高，不受體液中其他物質(zhì)，如酶抑制劑、激活劑等的影響；③能用于一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白，如各種酶原或去輔基酶蛋白，或因遺傳變異而導(dǎo)致合成無(wú)活性的酶蛋白的酶測(cè)定；④特別適用于同工酶的測(cè)定。與傳統(tǒng)的酶活性測(cè)定法相比，免疫化學(xué)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)主要有88酶的免疫化學(xué)測(cè)定也有其局限性。主要有：①要制備足夠量的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清常常是很困難的，而且工作量很大；②測(cè)定步驟多，操作繁瑣；③測(cè)定成本高。酶的免疫化學(xué)測(cè)定也有其局限性。主要有：89第六節(jié)同工酶及其亞型測(cè)定第六節(jié)同工酶及其亞型測(cè)定90此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。血漿酶可分成血漿特異酶和非血漿特異酶兩大類，后者可再分為外分泌酶和細(xì)胞酶等。另一大類以乳酸為底物的順向反應(yīng)(稱LD-L法)。這5種同工酶大致可分為三類：酶在一些病理?xiàng)l件下或受操作條件等影響而失活，一些激活劑或抑制劑對(duì)酶在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中，許多代謝物濃度的測(cè)定往往使用有工具酶的參與的反應(yīng)，即所謂共通反應(yīng)途徑。CK同工酶亞型(CK-MM型和CK-MB型)多用瓊脂糖凝膠高壓電泳和等電聚焦電泳等。如持續(xù)性升高達(dá)數(shù)周，常提示胰腺炎有反復(fù)，或有并發(fā)癥發(fā)生。常用色譜法是柱色譜，如離子交換色譜和親和色譜等用于同工酶的提純與制備，但方法費(fèi)時(shí)繁瑣，通常不適合臨床同工酶常規(guī)檢測(cè)。①靈敏度高，能測(cè)定其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；七、淀粉酶及其同工酶γ-GT催化γ-谷氨?；鶑墓入赘孰?GSH)或其他含γ-谷氨?；镔|(zhì)中轉(zhuǎn)移到另一肽或氨基酸分子上。肺、胰、脾、淋巴結(jié)壞死和炎癥及各種惡性疾病時(shí)LD2、LD3、LD4升高；溶血性疾病時(shí)LD1和LD2升高，但仍為L(zhǎng)D2>LD1；我國(guó)多采用目前IFCC參考方法LD-L法，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。4-NPP在堿性溶液中為五色，在ALP催化下，4-NPP分裂出磷酸基團(tuán)，生成游離的對(duì)硝基苯酚。LD或?qū)⒈∧せ蚰z切割成小條或小薄片，分別浸泡在含緩沖液的試管中，低溫下將酶條帶洗脫，再進(jìn)行比色分析，亦可計(jì)算出各同工酶或亞型區(qū)帶的活力。膽堿酯酶(ChE)是一類催化?；憠A水解的酶類。一、概念同工酶是同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布和細(xì)胞內(nèi)定位不同的一類酶。亞型某些酶或同工酶從組織進(jìn)入體液后，可進(jìn)一步變化為數(shù)個(gè)不同類型即所謂“亞型，也稱為同工型(isoform)”。即指基因在編碼過(guò)程中由于翻譯后修飾的差異所形成的多種形式的一類酶。亞型往往在基因編碼產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)釋入血漿時(shí)因肽酶作用降解而形成。此外，病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、91酶的免疫化學(xué)測(cè)定課件講義92三、分析方法

臨床同工酶的分析大致可分為兩步，即首先精確地分離出某酶的各同工酶組分，然后測(cè)定酶的總活性和各同工酶或亞型組分的活性。三、分析方法93臨床上習(xí)慣用U／L來(lái)表示體液中酶催化濃度。臨床上檢測(cè)AMY用于胰腺炎診斷時(shí)，應(yīng)注意AMY增高幅度與病情不成比例，如原AMY已升高卻發(fā)生與癥狀不相應(yīng)的降低時(shí)，常為兇險(xiǎn)的壞死性胰腺炎的預(yù)兆。(2)肌酶譜：主要用于對(duì)骨骼肌疾病的診斷和監(jiān)護(hù)。如果血清中ALP持續(xù)低值，則阻塞性黃疸的可能性很小。但神經(jīng)疾病引起的肌萎縮，CK活性一般正常。酶活性濃度測(cè)定是臨床酶學(xué)分析最為常用的方法。此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。根據(jù)酶促反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，可計(jì)算出酶活性濃度的高低。臨床上以檢測(cè)血清酶和同工酶應(yīng)用最廣，根據(jù)需要也可測(cè)定其他各種體液(如尿液、胸腔積液、腹水、腦脊液等)中的酶和同工酶或亞型。ChE的真正生理功能至今尚未闡明。各種CK同工酶還可進(jìn)一步根據(jù)所帶電荷和等電點(diǎn)不同分離數(shù)目不等的亞型。另一大類以乳酸為底物的順向反應(yīng)(稱LD-L法)。膽道疾患時(shí)AST亦可升高。而尿AMY約于發(fā)病后12～24h開始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期測(cè)定尿AMY更有價(jià)值。是否為抗酒石酸鹽的非PAP增高為毛細(xì)胞性白血病的重要鑒別要點(diǎn)。6、腹水LD／血清LD>0.由于ChE在肝臟合成后立即釋放到血漿中，故是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞合成功能的靈敏指標(biāo)，與清蛋白生成有密切關(guān)系，故測(cè)定血清ChE一般用作肝功能試驗(yàn)?；蛘咭?40nm波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)濁度的變化。各種CK同工酶還可進(jìn)一步根據(jù)所帶電荷和等電點(diǎn)不同分離數(shù)目不等的亞型。假如能同時(shí)測(cè)定AST，并計(jì)算AST／ALT之比，則對(duì)于急、慢性肝炎的診斷、鑒別診斷以及判斷轉(zhuǎn)歸也特別有價(jià)值。AST廣泛存在于多種器官中，按含量多少順序?yàn)樾?、肝、骨骼肌和腎等，肝中70％存在于肝細(xì)胞線粒體中。顯色后的區(qū)帶一般用光密度計(jì)或熒光計(jì)掃描定量分析。臨床上習(xí)慣用U／L來(lái)表示體液中酶催化濃度。94(一)電泳法

1．方法電泳法的使用最為廣泛。此法簡(jiǎn)便、快速、分離效果良好，并且一般不會(huì)破壞酶的天然狀態(tài)。目前國(guó)內(nèi)外的一些自動(dòng)化電泳分析系統(tǒng)則多采用分辨率更高的瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)，采用高壓或常壓電泳進(jìn)行各種同工酶及其亞型的分離與鑒定。此外還可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行分析。測(cè)定步驟主要分為區(qū)帶分離、活性顯色和檢測(cè)結(jié)果等。用電泳法進(jìn)行區(qū)帶分離的原理與其他蛋白電泳相似。(一)電泳法95

2．顯色染料

常用顯色染料有偶氮染料和四唑鹽等。它們易溶于水，難溶于一般的有機(jī)溶劑。酶學(xué)中只是利用所進(jìn)行的偶合反應(yīng)，由所生成不同顏色的偶氮色素進(jìn)行同工酶譜檢測(cè)，四唑鹽起著受氫體的作用，如將四唑鹽及雙四唑鹽分別還原成紫紅色的甲躦(formazan)和紫藍(lán)色的雙甲躦。常用的四唑鹽有：硝基四唑藍(lán)鹽(NBT)，碘化硝基四唑鹽(INT)、甲基噻唑四唑鹽(MTT)等。其中NBT生成的色素難以溶解，在局部區(qū)域染色良好，使用最多。2．顯色染料963．掃描定量

顯色后的區(qū)帶一般用光密度計(jì)或熒光計(jì)掃描定量分析?；?qū)⒈∧せ蚰z切割成小條或小薄片，分別浸泡在含緩沖液的試管中，低溫下將酶條帶洗脫，再進(jìn)行比色分析，亦可計(jì)算出各同工酶或亞型區(qū)帶的活力。3．掃描定量97圖6-6為瓊脂糖凝膠電泳分離的血清LD同工酶譜(圖譜中從左至右分別為L(zhǎng)D1-LD5)。圖6-6為瓊脂糖凝膠電泳分離的血清LD同工酶譜(圖譜中從左至984．注意事項(xiàng)

用電泳法進(jìn)行同工酶分析時(shí)，如顯示的區(qū)帶數(shù)與同工酶數(shù)不一致時(shí)，要特別注意巨分子酶的存在。巨分子酶形成的原因主要有：①酶與免疫球蛋白形成的復(fù)合物，如CK—BB-IgG、CK-MM-IgA、LD-IgA等；②酶與其他蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物，如LD-β-脂蛋白；③酶亞基或酶分子之間形成的聚合物，如CK—Mt聚合物、LD亞基自身聚合等。如患者臨床癥狀不明顯，血清酶活性不正常，同工酶圖譜異常時(shí)要特別警惕血清中有無(wú)巨分子酶，以免造成對(duì)酶測(cè)定結(jié)果的錯(cuò)誤判斷和臨床誤診。

4．注意事項(xiàng)99(二)色譜法

常用色譜法是柱色譜，如離子交換色譜和親和色譜等用于同工酶的提純與制備，但方法費(fèi)時(shí)繁瑣，通常不適合臨床同工酶常規(guī)檢測(cè)。目前國(guó)外已有供臨床同工酶分析用的商品化微型色譜柱。也有應(yīng)用陰離子交換色譜結(jié)合免疫化學(xué)法、聚焦色譜結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)法進(jìn)行CK亞型分析和研究的報(bào)道。(二)色譜法100(三)免疫分析法

由于同工酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，因而免疫化學(xué)性質(zhì)也不同。利用純化的同工酶免疫動(dòng)物制備特異性的抗血清，此抗體只與該同工酶產(chǎn)生特異