關于大腸桿菌表達系統第一頁，共八十六頁，2022年，8月28日外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征

大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物第二頁，共八十六頁，2022年，8月28日外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征

大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質的復性功能缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白細胞周質內含有種類繁多的內毒素第三頁，共八十六頁，2022年，8月28日外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理啟動子終止子核糖體結合位點密碼子質粒拷貝數轉錄翻譯第四頁，共八十六頁，2022年，8月28日Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子第五頁，共八十六頁，2022年，8月28日

轉錄調控機理

具有多順反子結構，基因排列次序為：啟動子（lacP）-操縱基因（lacO）-結構基因（lacZ-lacY-lacA）

正調節(jié)因子CAP

負調節(jié)因子

lacI啟動子Lac

表達系統以大腸桿菌lac操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統

第六頁，共八十六頁，2022年，8月28日lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效轉錄cAMPCAPlacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉錄Lac

表達系統

正調節(jié)因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP復合物與

lac

操縱子上專一位點結合后，能促進RNA聚合酶與–35、–10序列的結合，進而促進Plac

介導的轉錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAP第七頁，共八十六頁，2022年，8月28日Lac

表達系統

lacUV5突變體

PlacUV5突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效的起始轉錄，受它控制的基因在轉錄水平上只受

lacI的調控，因此用它構建的表達載體在使用時比野生型Plac更易操作。第八頁，共八十六頁，2022年，8月28日Lac

表達系統

負調節(jié)因子

lacI

在無誘導物情形下，

lacI

基因產物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始。lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉錄lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效轉錄RNA聚合酶IPTGmRNA第九頁，共八十六頁，2022年，8月28日Tac

表達系統

tac啟動子是由

trp的–35序列和

lacUV5的–10序列拼接而成的雜合啟動子。

調控模式與lacUV5相似，但mRNA轉錄水平更高于trp和lacUV5

啟動子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達水平的情況下，選用tac啟動子比用lacUV5啟動子更優(yōu)越。第十頁，共八十六頁，2022年，8月28日lac、tac

啟動子對宿主菌的要求

在普通大腸桿菌中，LacI阻遏蛋白僅能滿足細胞染色體上lac操縱子轉錄調控的需要。

當多拷貝的

lacO隨著帶有l(wèi)acUV5、tac啟動子的表達質粒轉化進入大腸桿菌后，LacI阻遏蛋白與lacO

的比例顯著下降，無法保證每一個lacO都能獲得足夠的LacI阻遏蛋白參與轉錄調控。表現為在無誘導物存在的情形下，lacUV5、tac啟動子有較高的本底轉錄。第十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日lac、tac

啟動子對宿主菌的要求為了使以Lac、Tac表達系統具有嚴緊調控外源基因轉錄的能力，一種能產生過量的LacI阻遏蛋白的lacI

基因的突變體lacIq

被應用于表達系統。大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacIq

，常被選用為Lac、Tac

表達系統的宿主菌。

但是這些菌株也只能對低拷貝的表達載體實現嚴緊調控，在使用高拷貝復制子構建表達載體時，仍能觀察到較高水平的本底轉錄。

需在表達載體中插入lacIq

基因以保證有較多的LacI阻遏蛋白產生。第十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日lac、tac

表達系統存在的問題

IPTG用于誘導

lac、tac啟動子的轉錄，但由于IPTG本身具有一定的

毒性。從安全角度，對表達和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。

一些國家規(guī)定在生產人用重組蛋白質的生產工藝中不能使用IPTG

解決方法

lac

和tac啟動子的轉錄受溫度嚴緊調控乳糖替代IPTG誘導lac

和tac啟動子的轉錄第十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日lac、tac

表達系統存在的問題

lac

和tac啟動子的轉錄受溫度嚴緊調控

把阻遏蛋白LacI的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達載體或整合到染色體后，均能使lac

和tac啟動子的轉錄受到溫度嚴緊調控在較低溫度（30℃）時抑制，在較高溫度（42℃）時開放。用乳糖替代IPTG誘導lac

和tac啟動子的轉錄乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導劑的作用這一過程涉及乳糖的轉運和轉化，其效率受到多種因素的影響和制約因此乳糖誘導的有效劑量大大高于IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代lPTG作為誘導劑的研究要與發(fā)酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。第十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日

轉錄調控機理色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復合物的阻遏，轉錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導Ptrp

介導的目的基因表達啟動子Trp

表達系統以大腸桿菌trp操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統

第十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日Trp

表達系統

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平轉錄高效轉錄mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效轉錄mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶第十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日PL

和PR

表達系統

以l噬菌體早期轉錄啟動子PL、PR

為核心構建的表達系統

在野生型l噬菌體中，PL

、PR

啟動子轉錄與否決定了l

噬菌體進入裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。啟動子第十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日PL

和PR

表達系統

轉錄調控的機理由

l噬菌體PE

啟動子控制的cI基因的產物是PL、PR啟動子轉錄的阻遏物。cI基因的產物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯綜復雜的平衡關系。由于通過細胞因子來控制cI

基因產物的產生和消失是相當困難的。

因此PL、PR

表達系統都選用溫度敏感突變體cI857(ts)

的基因產物來調控PL、PR

啟動子的轉錄。

在較低溫度（30℃）時以活性形式存在在較高溫度（42℃）時失活脫落第十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日PL

和PR

表達系統宿主菌中沒有cI基因產物，PL、PR啟動子的高強度直接轉錄，帶有PL

或

PR啟動子的表達載體在普通大腸桿菌中相當不穩(wěn)定。

對宿主菌的要求

用溶源化

l噬菌體的大腸桿菌作PL、PR

啟動子表達載體的宿主菌

N4830-1，POP2136等菌株已經溶源化cI857(ts)

l

噬菌體，可用作表達外源基因時的宿主菌。

把cI857(ts)

基因組裝在表達載體上宿主菌選擇范圍更大第十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日PL

和PR表達系統存在的問題

由于PL和

PR表達系統誘導時不加化學誘導劑，成本又低廉，最初幾個在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質都采用PL或

PR表達系統。

缺陷在熱脈沖誘導過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達的重組蛋白。在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30℃

提高到42℃需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影響誘導效果，對重組蛋白表達量有一定的影響。第二十頁，共八十六頁，2022年，8月28日

T7表達系統大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉錄體系，利用這一體系中的元件為基礎構建的表達系統稱為T7表達系統。第二十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日T7表達系統

T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉錄。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。

在細胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉錄競爭不過T7噬菌體轉錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉錄達到很高的水平。第二十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日T7表達系統轉錄調控的機理

T7噬菌體啟動子的轉錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA

聚合酶的轉錄調控模式就決定了表達系統的調控方式。

化學誘導型溫度誘導型雙質粒系統T7RNA

聚合酶T7啟動子目的基因

T7RNA聚合酶基因？啟動子第二十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日T7表達系統轉錄調控的機理

化學誘導型噬菌體DE3是

l噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI、lacUV5

啟動子和T7RNA聚合酶基因的

DNA片段被插入其

int基因中

用噬菌體DE3的溶源菌作為表達載體的宿主菌，調控方式為

化學誘導型，類似于Lac表達系統。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動子E.Coli（DE3）T7啟動子

目的基因T7RNA

聚合酶IPTG誘導第二十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日T7表達系統轉錄調控的機理

溫度誘導型

PL

啟動子控制T7RNA聚合酶基因，通過熱誘導方式激發(fā)

T7噬菌體啟動子的轉錄。

這種方式可以使本底轉錄降到很低的水平，尤其適用于表達對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質。

T7RNA聚合酶基因PL

啟動子E.Coli（CE6）T7啟動子

目的基因T7RNA

聚合酶熱誘導cI857第二十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日T7表達系統轉錄調控的機理

雙質粒系統一個質粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個質粒帶有T7啟動子和目的基因

兩個質粒的復制子和抗性標記不能相同調控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動子調控類型T7RNA

聚合酶熱誘導T7啟動子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpR第二十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日T7表達系統存在的問題

T7表達系統表達目的基因的水平是目前所有表達系統中最高的，但也不可避免出現在相對較高的本底轉錄，如果目的基因產物對大腸桿菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。

解決辦法之一

在表達系統中低水平表達T7溶菌酶基因。因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還能與

T7RNA聚合酶結合抑制其轉錄的活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉化質拉導入表達系統，它能明顯降低本底轉錄，但對誘導后目的基因的表達水平無明顯影響。第二十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日

營養(yǎng)調控型采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因

phoA啟動子或甘油3’-磷酸轉移系統ugp

啟動子構建表達載體。

這兩個啟動子受在培養(yǎng)基中的無機磷（Pi）濃度調控（Pi﹥5mmol/L

時抑制，Pi﹤1mmol/L時激活)，具有較高的轉錄水平。其他表達系統第二十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日

糖原調控型采用的有大腸桿菌半乳糖轉移系統（mglBAEC)mgl啟動子或沙門氏菌阿拉伯糖基因araB啟動子構建表達載體。

這兩個啟動子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導物。其調控機理類似于Lac表達系統.其他表達系統第二十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日pH調控型采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因cadA

啟動子構建表達載體。

cadA啟動子受培養(yǎng)基中H+濃度，即pH值調控。（在pH﹥8時抑制，pH﹤6時激活，pH=6時轉錄活力最高）。

該表達系統要求菌體發(fā)酵溫度控制在27～30℃之間才能使目的基因得到穩(wěn)定的表達.其他表達系統第三十頁，共八十六頁，2022年，8月28日溶氧調控型采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl

啟動子，硝基還原酶基因nirB啟動子或透明顫菌血紅蛋白基因

vgb

啟動子構建表達載體。這些啟動子中都含有對氧響應的調節(jié)因子fnr

的作用位點。

在富氧條件下轉錄被抑制，在貧氧或微氧條件下轉錄被激活。其他表達系統第三十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日溶氧調控型大腸桿菌GJ100有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因表達質粒，vgb基因的轉錄是受環(huán)境溶氧濃度調控的，在貧氧條件下vgb基因的啟動子被激活。

因此，用大腸桿菌GJ100作為宿主時，表達系統調控方式為貧氧誘導型，菌體發(fā)酵時的溶氧濃度可以通過控制攪拌轉速和通氣量加以調節(jié)，與其他調控模式相比更適合于產業(yè)化生產過程。其他表達系統第三十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日生物素調控型

用大腸桿菌生物素操縱子及其調控區(qū)構建表達載體，菌體生長過程中生物素會不斷消耗，當濃度到達2ng/ml以下時啟動子被激活。

能夠在沒有外界的物理，化學信號的介入條件下自動誘導表達目的基因是這類表達載體的特點，其缺陷是不容易精確控制自動誘導的時刻。其他表達系統第三十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日強化轉錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉錄過頭現象，即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續(xù)轉錄質粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物過長轉錄物的產生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下：轉錄產物越長，RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需的時間就相應增加，外源基因本身的轉錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標記基因和復制子結構等，則RNA聚合酶在此處的轉錄可能干擾質粒的復制及其它生物功能，甚至導致重組質粒的不穩(wěn)定性；過長的mRNA往往會產生大量無用的蛋白質，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴重的是，過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構，從而大大降低外源基因編碼產物的翻譯效率終止子第三十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日強終止子的選擇與使用目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2

以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯的特殊結構，以增強其轉錄終止作用終止子第三十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日核糖體結合位點外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數百倍。

mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）

核糖體結合位點第三十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日第三十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日核糖體結合位點大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列

5’UAAGGAGG3’

即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結合將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結合位點第三十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日核糖體結合位點對外源基因表達的影響

SD序列的影響一般來說，mRNA與核糖體的結合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與

16SrRNA的堿基互補性，其中以GGAG

四個堿基序列尤為重要。對多數基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導致翻譯效率大幅度降低核糖體結合位點第三十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日核糖體結合位點對外源基因表達的影響

SD序列與起始密碼子之間的序列的影響

SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而

CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。

緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達水平低20倍核糖體結合位點第四十頁，共八十六頁，2022年，8月28日核糖體結合位點對外源基因表達的影響

SD序列與起始密碼子之間的距離的影響

SD序列與起始密碼子AUG

之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復合物結構中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。

在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導致翻譯起始效率不同程度的降低核糖體結合位點第四十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日核糖體結合位點對外源基因表達的影響

起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG

三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常GUG為AUG的

50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關重要，至少這一序列不能與mRNA的

5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結構，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位

目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結合位點序列，序列和間隔是最佳的。核糖體結合位點第四十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體φX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現的頻率較高；在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優(yōu)勢密碼子與反密碼子相互作用的自由能性中等強度規(guī)律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多細胞內tRNA的含量密碼子生物體對密碼子的偏愛性第四十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達的影響

由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。

一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達：

外源基因全合成同步表達相關tRNA編碼基因第四十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日質粒拷貝數質?？截悢祵毦L代謝的影響目前實驗室里廣泛使用的表達型質粒在每個大腸桿菌細胞中可達數百甚至上千個拷貝，質粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數生長期內，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降

解決上述難題的一種有效策略是將重組質粒的擴增納入可控制的軌道第四十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日

外源基因在大腸桿菌中的表達蛋白質的合成是在細胞之中進行的目標蛋白在細胞質中表達的主要優(yōu)點是：表達質粒的構建比較簡單；能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞總蛋白的

20%～40%。目標蛋白在大腸桿菌系統表達的形式有二種：

在細胞內表現為不溶性的包涵體顆粒

包涵體存在于大腸桿菌細胞質中

在細胞內表現為可溶性的蛋白質

可溶性的目標蛋白質除可存在于細胞質中外，還可借助于本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質加工、運輸體系，最終分泌到周質空間，或外泌到培養(yǎng)液中。第四十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日大腸桿菌基因工程菌的構建策略

包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統的構建外源基因在大腸桿菌中的表達第四十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日包涵體及其性質在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。富含蛋白質的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達質粒構建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵體型異源蛋白的表達第四十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點

包涵體表達形式的優(yōu)點在一定程度上保持表達產物的結構穩(wěn)定能夠避免細胞內蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集

簡化外源基因表達產物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來

能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白。包涵體型異源蛋白的表達第四十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點

包涵體表達形式的缺點以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復性操作的效率對目標產物的收率至關重要。

經過復性處理的目標蛋白不一定能完全恢復原來的生物學活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當目標蛋白分子中的

Cys殘基數目較高時，體外復性蛋白質的成功率相當低，一般不超過30%

復性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。包涵體型異源蛋白的表達第五十頁，共八十六頁，2022年，8月28日包涵體的變性與復性操作包涵體的溶解與變性包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復性途徑中。

能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：

清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復性和純化

促溶劑鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應

混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯合使用，溶解力增強

極端pH

廉價，但許多蛋白質在極端pH條件下發(fā)生修飾反應包涵體型異源蛋白的表達第五十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日包涵體的變性與復性操作

包涵體的復性與重折疊（refolding）包涵體的復性與重折疊的主要任務：將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊通過次級鍵的形成使蛋白質復性包涵體型異源蛋白的表達第五十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日在細胞內表現為可溶性的蛋白質目標蛋白以可溶性蛋白質形式表達雖然可以避免包涵體復性帶來的問題，但是也有一定的缺陷，主要表現為大腸桿菌本身存在于細胞質中的蛋白質往往只含有少量的，甚至沒有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質大部份被轉運到細胞的其他部位。

分泌型異源蛋白的表達第五十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日

這是因為大腸桿菌細胞質微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢不利于蛋白質二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構象的目標蛋白在大腸桿菌的細胞質中往往不能正確折疊。解決這一問題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因trxB缺陷株作為宿主菌表達目標蛋白。研究表明trxB缺陷株細胞質的氧化還原態(tài)勢發(fā)生了變化，蛋白質在trxB缺陷株的細胞質中能夠形成二硫鍵。這一菌株對于表達結構復雜的蛋白質而言是一·個相當重要的工具。分泌型異源蛋白的表達第五十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日在細胞質中直接表達不帶有前導序列的成熟蛋白質

在細胞質中直接表達不帶有前導序列的成熟蛋白質需要起始密碼，通常為編碼甲硫氨酸的ATG。⑴在多數情況下，N端附加的甲硫氨酸對蛋白質的性質沒有特別的影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴重影響蛋白質生物學活力的報道。⑵另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質的免疫性質和藥理性質。從制備用于醫(yī)療目的的蛋白質的角度來看，這是一個需要引起重視的問題。

第五十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日去除附加的甲硫氨酸有二種方法：

⑴在表達系統中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵在分離純化后在體外用外肽酶處理。但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。第五十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日目標蛋白與有親合配基的序列融合表達

與純化包涵體相比，細胞質中以可溶性形式表達蛋白質的分離純化過程比較復雜，一般要通過親合層析才能達到比較高的純度。目標蛋白與有親合配基的序列融合表達既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到沒有附加甲硫氨酸目標蛋白。金黃色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉移酶，大腸桿菌麥芽糖結合蛋白，His-tag等是目前常用的與目標基因融合表達的序列。第五十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日第五十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日目標蛋白在周質空間中表達目標蛋白在周質空間中表達的優(yōu)點⑴大腸桿菌周質空間中自身蛋白質的數量約為100種，只占菌體總蛋白數量的4%。蛋白水解酶的含最與在細胞質中相比也少得多，因此目標蛋白在周質空間中表達有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。⑵目標蛋白從細胞質轉運到周質空間過程中信號肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的產生。⑶周質空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢使目標蛋白能夠較好折疊，維持正確的構象。第五十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日目標蛋白外泌表達

把所表達的目標蛋白外泌到細胞外的培養(yǎng)基中可以進一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。目前成功的例子主要是采用以下方案:

（1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達（2）與一些能提高細胞外膜通透性的因子融合或共表達（3）改變培養(yǎng)基的成分歸納現有的研究結果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。第六十頁，共八十六頁，2022年，8月28日四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術表達質粒的優(yōu)化和設計共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因提高目標基因mRNA和目標基因產物的穩(wěn)定性高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞第六十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術表達質粒的優(yōu)化和設計在各種表達載體中，啟動子和SD序列的下游都設計了一段含有各種限制性酶切位點的序列，用于目標基因的插入。這一插入位點附近的序列將成為核糖體結合位點的一部分，因此它對于構建高效表達質粒是至關重要的。由于每一個基因都具有各自獨特的5’端結構，最終構建成的各種表達質粒所具有的核糖體結合位點是一個變量。第六十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日第六十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日第六十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術表達質粒的優(yōu)化和設計

構建表達質粒時首先要考慮使目標基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個適當的范圍內。核糖體結合位點序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響，具體表現為：

SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3～6倍翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6～8個堿基長度，與AAGAA的最適距離是5～7個堿基長度

ATG與UAAGGAGG至少相隔3～4個堿基，與AAGAA至少相隔5

個堿基；mRNA的翻譯才能進行

ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T堿基豐富時，mRNA翻譯效率較高。第六十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日

核糖體結合位點本身和附近的序列決定了目標基因mRNA5’端的二級結構，研究表明討mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結構阻礙了mRNA與核糖體30S亞基的結合，從而抑制了翻譯的起始。盡量提高核糖體結合位點本身和附近的序列中A/T堿基的含量，降低mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結構的可能性，也是構建表達質粒時需要注意的事項。在必要的情況下，還可通過定點突變，PCR等技術改變個別關鍵的堿基來破壞mRNA5’端的“莖環(huán)”結構。把目標基因設計成多順反子結構，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標基因，一起插入表達載體。這一方法通常適用于目標基因5’端序列容易形成二級結構，而又不宜改變其序列的情形下第六十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日表達質粒的優(yōu)化和設計

在構建表達質粒時，充分利用各個基因的結構特征和特點，注意引入翻譯增強子序列

能提高mRNA翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強子。

四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第六十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因

表達水平高的基因呈現的密碼子偏愛性高于表達水平低的基因?，F已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有：編碼Arg的密碼子AGA、AGG、CGA、CGG

編碼Pro的密碼子CCC、CCU、CCA

編碼Cys的密碼子UGU、UGC;

編碼Gly的密碼子GGA、GGG

編碼Leu的密碼子CUA、CUC

編碼Ile的密碼子AUA

編碼Ser的密碼子UCA、AUG、UCG、UCC

編碼Thr的密碼子ACA四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第六十八頁，共八十六頁，2022年，8月28日共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因

由于同義密碼子的使用頻率與細胞內對應的tRNA的豐度有正比關系稀有密碼子對應的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。

解決這一問題的辦法：通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。在表達系統中共表達稀有密碼子tRNA基因，以提高大腸桿菌細胞內稀有密碼子tRNA的豐度四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第六十九頁，共八十六頁，2022年，8月28日

在所有的大腸桿菌稀有密碼子tRNA中，tRNAArg(AGG/AGA)含量最少，而AGG和AGA密碼子在真核基因中經常出現。人尿激酶原ProUK，新型組織纖溶酶原激活劑NTA等基因中都含有較多的AGG和AGA密碼子，在大腸桿菌中直接表達的水平很低，但在大腸桿菌中共表達tRNAArg(AGG/AGA)基因argU后，這些基因的表達水平能明顯得到提高?，F在還沒有一個固定規(guī)則來判定稀有密碼子的存在是否確實會對翻譯過程產生明顯的不利影響。因為稀有密碼子存在的位置、分布的均勻性、mRNA的二級結構的不同決定了它對翻譯過程的影響是有差別的。所有的結論要通過實驗才能得出。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第七十頁，共八十六頁，2022年，8月28日提高目標基因mRNA和目標基因產物的穩(wěn)定性由于大腸桿菌防御體系的自身保護作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標基因mRNA和目標基因產物，這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第七十一頁，共八十六頁，2022年，8月28日蛋白水解酶的特點細胞質是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域，目標蛋白在細胞質中最容易受到蛋白水解酶的作用。通過對已知大腸桿菌細胞內半衰期的蛋臼質的統計學分析，發(fā)現N末端為Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp殘基的蛋白質，含有ProGlu、Ser、Thr豐富區(qū)的蛋白質容易降解，穩(wěn)定性較差。

在細胞內有多肽碎片、突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件下，大腸桿菌細胞內的蛋白水解酶活力往往能達到比較高的水平。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第七十二頁，共八十六頁，2022年，8月28日提高目標蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有：利用蛋白轉運系統把目標蛋白最終累積在周質空間，或分泌到培養(yǎng)基中采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯聚合表達。共表達能提高特定目標蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。對蛋白質序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造。在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第七十三頁，共八十六頁，2022年，8月28日

但必須指出的是，由于目標蛋白本身的性質和用途的不同，上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的。主要表現為：大腸桿菌對分子量較大的目標蛋白的較運和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)饃制備的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長速率慢，使高密度發(fā)酵比較困難。融合表達使目標蛋白的構象與天然狀態(tài)不一樣，導致生物比活力降低，甚至沒有活性。融合蛋白和串聯聚合蛋白需要用酶或化學的方法切割出單體目標蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除。化學法比酶法成本低，但不少裂解試劑有毒性。對蛋白質序列進行改造需要有基本的蛋白質結構數據，而目前這方面的數據庫還不完整。第七十四頁，共八十六頁，2022年，8月28日四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標基因的表達水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數量的成倍增加來實現總表達量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種

第七十五頁，共八十六頁，2022年，8月28日構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌

高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標基因的高效表達有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題。雖然在發(fā)酵過程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補料速度等措施來控制溶氧飽和度，減少乙酸的產生。但從實際應用上看，這些措施都有一定的滯后效應，難以做到比較精確的控制。因此構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌，是從恨本上解決問題的途徑之一。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第七十六頁，共八十六頁，2022年，8月28日

利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學性質，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb

導入大腸桿菌細胞內以增加其對溶氧的寬容度。從而降低菌體產生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值。用基因敲除技術缺失大腸桿菌的磷酸轉乙酰酶基因pta1

和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷。改變代謝流的方向，通過共轉化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶基因adh2導入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3‘-羥基丁酮或乙醇的方向進行。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術第七十七頁，共八十六頁，2022年，8月28日構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌對于以可溶性或分泌形式表達的目標蛋日而言，隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積，目標蛋白會遭到蛋白水解