基因工程研究技術(shù)Preparation,analysisandmanipulationofnucleicacidsandproteins基因工程研究技術(shù)Preparation,analysis1所有的分子生物學(xué)技術(shù)都是基于對核酸和蛋白質(zhì)性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上發(fā)展的雜交：

thebase-pairingcharacteristicsofDNAandRNAPCR：ThermophilicDNApolymeraseDNA克?。篋NApolymerase,restrictionendonucleasesandDNAligase所有的分子生物學(xué)技術(shù)都是基于對核酸和蛋白質(zhì)性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上發(fā)21.核酸研究技術(shù)電泳分離：SeparationbyElectrophoresis限制性內(nèi)切酶切割：CutbyRestrictionendonuclease雜交鑒定：IdentificationbyHybridizationPCR擴(kuò)增：

AmplificationbyPCRDNA克隆和基因表達(dá)：DNACloningandgeneexpressionDNA文庫的構(gòu)建和目的基因的篩選（ConstructionofDNAlibrary&screeningoftargetgene)基因組序列和分析：Genomesequence&analysis1.核酸研究技術(shù)電泳分離：SeparationbyEl31.凝膠電泳是根據(jù)DNA和RNA的分子量大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等性質(zhì)進(jìn)行分離一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率；電泳的遷移率與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。1.凝膠電泳是根據(jù)DNA和RNA的分子量大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等性4DNA、RNA由于其骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，帶有負(fù)電荷，在電場中向正電極移動。線性DNA分子根據(jù)其分子量大小來分離。分子量大的DNA電泳速度比分子量小的DNA要慢。環(huán)狀DNA的電泳速度與其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相關(guān)。不同構(gòu)型，相同大小分子量的DNA的電泳速度是：SCDNA>LDNA>OCDNADNA、RNA由于其骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，帶有負(fù)電荷5基因工程研究技術(shù)6Gelmatrix(膠支持物)膠支持物是凝膠狀的多孔物質(zhì)，能允許DNA分子通過其內(nèi)部的孔隙。瓊脂糖（Agarose）聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）Gelmatrix(膠支持物)膠支持物是凝膠狀的多孔物質(zhì)7溴化乙錠（ＥＢ）ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或者ＲＮＡ相鄰堿基之間，在300nm波長的紫外線照射下發(fā)出熒光。當(dāng)DNA和RNA用EB充分處理之后，其熒光強(qiáng)度與其分子量大小呈正比溴化乙錠（ＥＢ）ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或89瓊脂糖(Agarose):分離效果比聚丙烯酰胺差,能夠分離大分子DNA，分子量高達(dá)幾十Kb1kb0.5kb2kb3kb4kb9瓊脂糖(Agarose):1kb0.5kb2kb910聚丙稀酰胺(Polyacrylamide):分離能力高，能夠分辨相差一個堿基或者一個堿基對的DNA或者RNA分子只能分離小分子量大樣品

(1toafewhundredbp).10聚丙稀酰胺1011DNA分子的遷移方向隨電場方向的周期性變化而不斷改變.根據(jù)DNA地分子量大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來分離樣品.用來分離大分子的樣品，分子量超過50Kb，甚至高達(dá)幾M.Pulsed-fieldgelelectrophoresis(脈沖場電泳)11DNA分子的遷移方向隨電場方向的周期性變化而不斷改變.11Switchingbetweentwoorientations:thelargertheDNAis,thelongerittakestoreorientSwitchingbetweentwoorientat12RNA與DNA類似，帶有負(fù)電荷；RNA是單鏈分子，很容易自發(fā)形成分子內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，影響了電泳分離效果；用乙二醛處理RNA，阻止RNA的堿基配對，使得RNA與ＤＮＡ一樣，電泳遷移率與分子量大小相關(guān)RNA也可以用電泳方法分離RNA與DNA類似，帶有負(fù)電荷；RNA也可以用電泳方法分離132.限制性內(nèi)切酶在特定位點切割DNA分子識別位點粘性末端平末端同裂酶同尾酶？2.限制性內(nèi)切酶在特定位點切割DNA分子識別位點？143.DNA雜交-確定特殊的DNA分子雜交（Hybridization):不同來源的單鏈DNA或者RNA通過堿基配對形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的過程3.DNA雜交-確定特殊的DNA分子雜交（Hybridiz15探針-Probe探針：一段帶有特殊標(biāo)記的核苷酸序列，可以用來從混合的核苷酸中尋找含有與其序列互補(bǔ)的核苷酸序列。將要用探針雜交的混合核苷酸可以在電泳分離后的凝膠上，也可以在一個文庫的不同的克隆中。探針在雜交之前需要進(jìn)行標(biāo)記，以便于在探針與目標(biāo)序列雜交后能夠被檢測出。探針-Probe探針：一段帶有特殊標(biāo)記的核苷酸序列，可以用來16探針的標(biāo)記Radioactivelabeling:displayand/ormagnifythesignalsbyradioactivity.Non-radioactivelabeling:displayand/ormagnifythesignalsbyantigenlabeling:antibodybinding–enzymebinding-substrateapplication(signalrelease)探針的標(biāo)記Radioactivelabeling:dis17Southernblotting：將變性處理的后的DNA片段進(jìn)行凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交以顯示這些DNA，這種技術(shù)成為Southernblotting。Northernblotting：將RNA從瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交的技術(shù)。其原理與Southernblotting類似。探針雜交可以確認(rèn)電泳分離后的DNA和RNASouthernblotting：將變性處理的后的DNA18Northern/SouthernblotanalysisgelmembraneElectrophoresisblottingHybridizationNorthern/Southernblotanalysi19SouthernandNorthernblottingDNAonblotRNAonblotGenomicDNApreparation RNApreparationRestrictiondigestion -Denaturewithalkali -Agarosegelelectrophoresis DNAblotting/transferandfixationRNA6.Probelabeling 6.Hybridization (temperature) 7.Signaldetection(X-rayfilmorantibody)SouthernandNorthernblotting20WesternblottingWesternblotting：又稱為蛋白質(zhì)印跡法，用來檢測在不均一的蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標(biāo)蛋白質(zhì)的技術(shù)。操作程序與Souternblotting類似。先將蛋白質(zhì)經(jīng)過SDS電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜之類的固體支持物上，通過專一性抗體探測目標(biāo)蛋白質(zhì)；隨后用標(biāo)記的第二抗體檢測在印跡中是否存在免疫復(fù)合物（一抗與抗原的復(fù)合物）。WesternblottingWesternblotti2122BlottypeTargetProbeApplicationsSouthernDNADNAorRNAmappinggenomicclones

estimatinggenenumbers,etcNorthernRNADNAorRNARNAsizesandabundance(geneexpressionlevel)WesternProteinAntibodiesproteinsizeandabundance(geneexpressionlevel)ComparisonofSouthern,NorthernandWesternbolthybridization22BlottypeTargetProbeApplicat224.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) PCRistousedtoamplifyaDNAsequenceusingapairofprimerseachcomplementarytooneendoftheDNAtargetsequence.4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) PCRistoused23Denaturation(變性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg2+.ThePCRcycle:ThreedifferentstepsproceedineachPCRcycle.Denaturation(變性):Thetarget24DenaturationPrimerannealingPolymerizationDenaturationPrimerannealingP25NestedPCR:利用嵌套引物提高PCR擴(kuò)展的準(zhǔn)確性FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterestNestedPCR:FirstroundFirstro26反向PCR-reversePCR先用一種在靶DNA區(qū)段上沒有識別位點的核酸內(nèi)切限制酶，從距靶DNA區(qū)段有一定距離的兩側(cè)位置切割DNA分子，然后將這些片段作分子內(nèi)連接成環(huán)形。根據(jù)已知的靶DNA序列按向外延伸的要求設(shè)計一對向外引物，保證被擴(kuò)增的是位于靶DNA區(qū)段兩側(cè)的未知DNA序列。反向PCR-reversePCR先用一種在靶DNA區(qū)段上27用一種在靶序列上沒有酶切位點的核酸限制性內(nèi)切酶消化DNA；產(chǎn)生大小不同的線性DNA片段群體，其中靶DNA區(qū)段的DNA分子長度不超過2~3kb，經(jīng)連接后重新環(huán)化；按靶序列設(shè)計的一對引物與互補(bǔ)序列退火結(jié)合，其延伸方向如箭頭所指；用一種在靶序列上沒有酶切位點的核酸限制性內(nèi)切酶消化DNA；28反轉(zhuǎn)錄PCR：Reversetranscriptase(RT)-PCRPCR技術(shù)不僅可以擴(kuò)增DNA模板，還可以擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄成cDNA形式的RNA。這種在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行的PCR成為反轉(zhuǎn)錄PCR。反轉(zhuǎn)錄PCR：PCR技術(shù)不僅可以擴(kuò)增DNA模板，還可以擴(kuò)增反29反轉(zhuǎn)錄PCR：Reversetranscriptase(RT)-PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCR反轉(zhuǎn)錄PCR：AAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)1230PCR誘變(PCRmutagenesis)

通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響；也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點等。通過重疊延伸PCR進(jìn)行基因的定點突變。PCR誘變(PCRmutagenesis)通過改變基因特31根據(jù)靶DNA序列設(shè)計的一對互補(bǔ)的突變引物，在相同的位點具有相同的堿基突變；分別以兩個突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；除去未參與擴(kuò)增的多余引物，由于具有重疊序列，經(jīng)過變性退火形成異源雙鏈分子，其中一種結(jié)合方式不能延伸；正確配對的異源雙鏈分子利用靶DNA兩端的通用引物擴(kuò)增到突變位點位于靶DNA中間的序列根據(jù)靶DNA序列設(shè)計的一對互補(bǔ)的突變引物，在相同的位點具有相325.DNA克隆和表達(dá) TheabilitytoconstructrecombinantDNAmoleculesandmaintainthemincellsiscalledDNAcloning.5.DNA克隆和表達(dá) Theabilitytocon3334ProcessesofDNAcloning：Form

therecombinantDNAmolecules(重組DNA)byinsertingyourinterestedDNAfragmentsintoapropervector(載體).(Requirerestrictionenzymesandligase)Transform(轉(zhuǎn)化)therecombinantDNAmoleculesintocompetentcells(感受態(tài)細(xì)胞).PropagationofthecellscontainingtherecombinantDNAtoformaclone

(克隆),asetofidenticalcellscontainingthesamerecombinantDNA.Selectthedesiredclonesusingtheselectivemarker.34ProcessesofDNAcloning：34基因工程研究技術(shù)35用同樣的限制性內(nèi)切酶處理外源插入基因和載體；利用連接酶將切割好的插入片段和載體連接起來；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；在含有四環(huán)素的LB平板上培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞用同樣的限制性內(nèi)切酶處理外源插入基因和載體；36質(zhì)粒和載體質(zhì)粒和載體37DNA文庫DNA文庫：由一組DNA的隨機(jī)克隆片段組成，每個單獨的片段都連接在一個載體上?；蚪M文庫：把某種生物的基因組DNA切割成適當(dāng)大小的片段，這些片段分別與載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞，這樣的DNA文庫稱為基因組文庫。cDNA文庫：將mRNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄形成的雙鏈DNA連接到載體上轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞，這樣的DNA文庫成為cDNA文庫。DNA文庫DNA文庫：由一組DNA的隨機(jī)克隆片段組成，每個單38對于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬個，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個目的基因在整個基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。為了解決這個難題，一種可行的方法就是將這個基因擴(kuò)增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而只能對所有的基因進(jìn)行擴(kuò)增，也就是構(gòu)建該生物材料的基因文庫，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因。對于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)39基因工程研究技術(shù)40基因組DNA文庫的類型

根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫噬菌體文庫粘粒文庫人工染色體文庫（細(xì)菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫等）載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb基因組DNA文庫的類型載體能夠容載的DNA片斷大小直接影41用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫的流程

該法簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫的流程該法簡單、快速、易于操作，42用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的流程用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的流程43用黏粒載體構(gòu)建基因組文庫的流程用黏粒載體構(gòu)建基因組文庫的流程44用酵母人工染色體構(gòu)建基因組文庫的流程用酵母人工染色體構(gòu)建基因組文庫的流程45基因工程研究技術(shù)46基因組DNA文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一個理想的基因組DNA文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力。載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆。克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序。克隆片段易于從載體分子上完整卸下。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選。基因組DNA文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)47

基因組DNA文庫構(gòu)建的程序載體DNA的制備；高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA的提取和大片段的制備；高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離；載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；重組克隆的挑選和保存。基因組DNA文庫構(gòu)建的程序48

基因組DNA文庫構(gòu)建的程序

1．載體DNA片段的制備

DNA分離純化→限制酶切→脫磷酸化反應(yīng)

2．供體DNA片段的制備總DNA分離純化→物理切割法[超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）]或酶切法（內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機(jī)片斷。）→分離特定大小DNA片段

基因組DNA文庫構(gòu)建的程序49DNA的不完全酶切目的片段低熔點瓊脂糖回收DNA的不完全酶切目的片段低熔點瓊脂糖回收50

3.載體與基因組DNA大片段的連接直接連接、人工接頭或同聚物加尾。

（1）粘性末端直接連接：載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。

（2）人工接頭法（adapter）

人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。接上人工接頭粘性末端3.載體與基因組DNA大片段的連接接上人工接頭粘性末端51

3.載體與基因組DNA大片段的連接

（3）同聚物加尾粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶3.載體與基因組DNA大片段的連接粘性末端CCCCCC524.重組DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（1）根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞常見的宿主細(xì)胞：

DH5:用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的－半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)互補(bǔ)。

HB101:用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉(zhuǎn)化效率高

JM101:可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主菌

JM109:支持帶有琥珀突變載體生長的重組缺陷的抑制型菌

MZ-1:溫度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌體ＰＬ啟動子質(zhì)粒載體的宿主菌4.重組DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞53一、基因組DNA文庫的構(gòu)建一、基因組DNA文庫的構(gòu)建54構(gòu)建DNA文庫的方法構(gòu)建DNA文庫的方法55annealReversetranscriptionRegularPCRConstructionofcDNAlibraryannealReversetranscriptionReg56Colonyscreening

Antibioticscreening(抗生素選擇)：onlytherecombinantplasmidsgrowontheantibiotic-containingplate.Blue-whitescreening(藍(lán)白斑選擇):DNAinsertioninthevectorshutsdowntheLacZgeneexpression,andturnsthecolonytowhite.Colonyhybridizationscreening(菌落雜交篩選)fromalibrary.ColonyscreeningAntibioticsc57Antibioticscreening：onlyintactplasmidsgrowontheantibiotic-containingplate.篩選方法1：抗生素選擇Antibioticscreening：篩選方法1：抗生素58AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites, 多克隆位點）LacpromoterlacZ’InsertionofaDNAfragmentinterruptstheORFoflacZ’gene,resultinginnon-functionalgeneproductthatcannotdigestitssubstratex-gal.篩選方法2：藍(lán)白斑篩選AmproripUC18MCS(Multipleclon59TransfertonitrocelluloseornylonmembraneDenatureDNA(NaOH)BakeontomembraneProbewith32p-labledDNAcomplementarytogeneofinterestExposetofilmSelectpositivefrommasterplateKeepmasterplate

Screeningbyplaquehybridization篩選方法3：菌落原位雜交TransfertonitrocelluloseDena60Analysisofaclone

Restrictionmapping:

digestionoftheplasmidpreparedfromaclonewithrestrictionenzymestoinvestigateiftheinterestedDNAisinsertedtherecombinantplasmid.Sequencing

theclonedDNAtoseeiftheinsertedDNAmaintainsthecorrectsequence.AnalysisofacloneRestrictio61RestrictionmappingNcoI&XhoIRestrictionmappingNcoI&Xho62SequencingSequencing63富集的混合培養(yǎng)物研究結(jié)果富集的混合培養(yǎng)物研究結(jié)果64黏附在纖維素上的菌群研究結(jié)果一類球菌通過絲狀物質(zhì)黏附在纖維素上；細(xì)菌降解濾紙后在纖維上形成孔洞，且與菌體形態(tài)類似，通過絲狀物質(zhì)與孔壁相連；黏附在纖維素上的球菌可能為纖維素降解菌黏附在纖維素上的菌群研究結(jié)果一類球菌通過絲狀物質(zhì)黏附在纖維素65基因工程研究技術(shù)6616SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹研究結(jié)果原核生物通用引物 530f/1492r克隆數(shù):49個，57%為未培養(yǎng)細(xì)菌OUT:16SrRNA>97% 7個OTUs:RFC1～RFC797%98%98%97%95%97%99%安，木聚糖纖維素降解環(huán)境乳桿菌纖維素降解環(huán)境來自牦牛（安）產(chǎn)甲烷菌16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹研究結(jié)果原核生物通用引物97%67基因表達(dá)基因表達(dá)6869Expressionvectors:

allowingtheexogenousDNAtobestoredandexpressedinanorganism.--E.coliexpressionvector--Yeastexpressionvector--MammalianexpressionvectorFeatures:Inadditiontotheoriginofreplication,selectivemarker,multiplecloningsite,expressionvectorhastocontainapromoterandterminatorfortranscription.Theinsertedgenehastohaveastartcodonandastopcodonfortranslation69Expressionvectors:69表達(dá)載體：pET28a表達(dá)載體：pET28a70外源基因表達(dá)策略目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增；連接克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；篩選陽性克隆子并測序鑒定；酶切陽性克隆子和表達(dá)載體；連接目的基因和表達(dá)載體；重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株；IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá)；SDS鑒定表達(dá)情況。外源基因表達(dá)策略目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增；71外源基因表達(dá)蛋白的SDS外源基因表達(dá)蛋白的SDS72FusionproteinsGenecloningandexpressionprovidesaverypowerfulwaytoobtainalargeamountofthetargetproteinfusedwithanenzyme,fluorescenceproteinoratagforidentification(鑒定)orpurification(純化).FusionproteinsGenecloningan73ExamplesLacfusions(Enzyme):fuseyourtargetgenewiththeLacZcodingsequence.

His-tagfusions(Tag):AsequenceencodesHis-tagwasinsertedattheN-orC-terminiofthetargetORF,allowingthefusionproteintobepurifiedbybindingtoNi2+column.GFPfusions

(Fluorescenceprotein):insertyourtargetedgeneattheN-orC-terminiofGFP(greenfluorescenceprotein,綠色熒光蛋白),andyourfusionproteinwillgiveyougreenfluorescencesignal.ExamplesLacfusions(Enzyme):74DNA測序兩種測序方法：1.MaxamandGilbert：化學(xué)修飾法很少應(yīng)用；2.Sanger：雙脫氧法，鏈終止法（Chain-terminationmethod），廣泛應(yīng)用。DNA測序兩種測序方法：75鏈終止法

(Chain-terminationmethod)理論基礎(chǔ)：DNA聚合酶能利用單鏈DNA為模板，準(zhǔn)確合成DNA的互補(bǔ)鏈DNA聚合酶能夠利用2’,3’-雙脫氧核苷酸ddNTPs作底物，使之連接到核苷酸鏈的3’-末端，從而終止DNA鏈的生長。鏈終止法(Chain-terminationmethod76雙脫氧核苷酸對DNA聚合酶的抑制機(jī)理：ddNTPs的核糖基團(tuán)上C2和C3的羥基被H取代，當(dāng)ddNTPs加到核苷酸鏈上之后，后來的核苷酸不能形成新的磷酸二酯鍵，從而終止鏈的合成。雙脫氧核苷酸對DNA聚合酶的抑制機(jī)理：77基因工程研究技術(shù)78四個獨立的反應(yīng)體系：dNTP+ddGTP,dNTP+ddATP

dNTP+ddCTP,dNTP+ddTTP每個ddNTP都帶有一個獨特的熒光信號，可以從電泳之后的凝膠上讀出。四個獨立的反應(yīng)體系：79AutomaticsequencerFluorescenceLabeledddNTP2.PolymerasecatalyzedAutomaticFluorescence80技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

技術(shù)路線與要求制備單鏈模板81鏈終止法對DNA聚合酶的要求高酶活性：保證不會反應(yīng)提前終止；無5’→3’外切酶活性：保證不切除新合成鏈的5’端，改變鏈長度，給讀序造成誤差；無3’→5’外切酶活性：證不切除新合成鏈的3’端，改變鏈長度，給讀序造成誤差；鏈終止法對DNA聚合酶的要求高酶活性：保證不會反應(yīng)提前終止；82測序的DNA聚合酶目前普遍采用的測序酶為Sequenase,來自T7噬菌體測序的DNA聚合酶目前普遍采用的測序酶為Sequenase,83將DNA克隆到質(zhì)粒載體這種方法是獲得測序模板DNA最常用的方法。獲得的DNA通過熱變性或者堿變性轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA進(jìn)行測序。優(yōu)點：可雙向測序。缺點：樣品可能有少量細(xì)菌的DNA或者RNA污染，會干擾測序。鏈終止反應(yīng)要求單鏈作為模板如何得到單鏈DNA？將DNA克隆到質(zhì)粒載體鏈終止反應(yīng)要求單鏈作為模板如何得到單鏈84將DNA克隆到M13噬菌體載體M13噬菌體載體是專為得到單鏈DNA測序模板而設(shè)計的。M13噬菌體本來含有單鏈DNA基因組，感染大腸桿菌的M13可轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈復(fù)制型。M13噬菌體載體是雙鏈的，相當(dāng)于M13噬菌體的復(fù)制型。用含有待測序片段的M13噬菌體載體感染大腸桿菌，大腸桿菌分泌的噬菌體就含有單鏈DNA基因組。缺點：只能用于短片段DNA，大于3kb的片段在克隆過程中會發(fā)生缺失和重排。將DNA克隆到M13噬菌體載體M13噬菌體載體是專為得到單85Shotgunsequencingofabacterialgenome(鳥槍法測細(xì)菌的基因組)通過一定方法將細(xì)菌基因組打碎成隨機(jī)片段，每個片段的平均長度為1kb左右，然后將這些隨機(jī)片段連接到載體上；隨機(jī)挑取每個含有基因組片段的重組質(zhì)粒，利用載體上的引物序列做引物，在自動測序儀上測序。Shotgunsequencingofabacter86Inuseofshotgunsequencingstrategy,multiplesequencecoverageisrequiredtoobtainallgenomesequence.Forexample:ThegenomeofbacteriaHemophilusinfluenzaeis1.8Mb,eachsequencereadproduces600bpofsequence.If33,000differentcloneswerepickedforsequencing,atotalof600bpx33,000=20Mbsequencewasproduced.Inuseofshotgunsequencings87Theshotgunstrategy

permitsapartialassemblyoflargegenomesequenceThecoretechniquesforsequencingthelargegenomes,e.g.human,are

automatedshotgunsequencing(obtainsequence)thenthesubsequentuseofcomputertoassemblethedifferentsequences(analyzesequence,whichistherate-limitingstep).Theshotgunstrategy

permits8889 ContigsarelinkedbysequencingtheendsoflargeDNAfragments(plasmidlibrarycontaininglargerDNAfragments).89 Contigsarelinkedbyseque89研究基因組時最常用的工具：BLAST:BasicLocalAlignmentSearchTool可以搜索不同的編碼蛋白質(zhì)的基因之間的相似序列。Inputaquerysequence(詢問序列):astretchofaminoacidsortheDNAsequenceencodingyourinterestedproteinfunction.AskthecomputertosearchforthehomologoussequencesinaproteinorDNAdatabase,andyouwillgetalltheavailablegenesthatmayhavethesimilarproteinfunction.研究基因組時最常用的工具：90BLAST結(jié)果BLAST結(jié)果91蛋白質(zhì)研究技術(shù)蛋白質(zhì)研究技術(shù)92Proteinpurification(蛋白質(zhì)純化)Affinitychromatographycanfacilitatemorerapidproteinpurification(親和層析純化)ProteinseparationbyPAGEgelelectrophoresis(蛋白質(zhì)分離)andidentificationbyWesternanalysisProteinsequencing(蛋白質(zhì)測序)Proteomics(蛋白質(zhì)組學(xué))Proteinpurification(蛋白質(zhì)純化)93蛋白質(zhì)的純化對于研究蛋白質(zhì)的功能非常重要。.Althoughtherearethousandsofproteinsinasinglecell,eachproteinhasuniqueproperties,suchassize,charge(電荷),shape,andinmanyinstance,function,thatmakeitspurificationsomewhatdifferentfromothers.1.Proteinpurification(蛋白質(zhì)純化)蛋白質(zhì)的純化對于研究蛋白質(zhì)的功能非常重要。.1.Prote94柱層析法是分離蛋白質(zhì)的有效方法 Inthisapproach,proteinfractionsarepassedthoughglasscolumnsfilledwithappropriatedmodifiedsmallacrylamideoragarosebeads.柱層析法是分離蛋白質(zhì)的有效方法 Inthisapproa95離子交換層析根據(jù)所帶的電荷分離蛋白質(zhì).Thebeadsaremodifiedwitheithernegative-chargedorpositive-chargedchemicalgroups.Proteinsbindmorestronglyrequiresmoresalttobeeluted.

離子交換層析根據(jù)所帶的電荷分離蛋白質(zhì).96基因工程研究技術(shù)97凝膠過濾層析

該方法根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀分離不同的蛋白質(zhì)。

Thebeadsforithaveavarietyofdifferentsizedporesthroughout.Smallproteinscanenterallofthepores,andtakelongertoelute;butlargeproteinspassquickly.凝膠過濾層析該方法根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀分離不同的蛋白質(zhì)。98基因工程研究技術(shù)992.Affinitychromatographycanfacilitatemorerapidproteinpurification Ifthetargetproteinisknowntoestablishaspecificandhigh-affinityinteractionwithaspecificprotein/nucleicacids/smallmolecule,wecancouplethisspecificpartnerofthetargetproteintothecolumnandthusthetargetproteinwillbeselectivelyboundtothecolumn.Thismethodiscalledaffinitychromatography.2.Affinitychromatographycan100AffinitychromatographyEnzyme-substratebindingReceptor-ligandbindingAntibody-antigenbindingNi2+-Histag-fusionproteinbindingAffinitychromatographyEnzyme-101Immunoaffinitychromatography

(免疫親和層析)Anantibodythatisspecificforthetargetisattachedtothebead,andideallyonlythetargetproteincanbindtothecolumn.缺點:有時候目標(biāo)蛋白與抗體結(jié)合力太強(qiáng)不能被洗脫.Immunoaffinitychromatography

102Sometimestags(epitopes,抗原決定基)canbeaddedtotheN-orC-terminalofthetargetprotein,usingDNAcloningmethod,tomakethefusionprotein.Thisallowsthemodifiedfusionproteinstobepurifiedusingimmunoaffinitypurificationandaheterologousantibodyspecificforthetag.Importantly,thebindingaffinitycanchangeaccordingtothecondition.e.g.theconcentrationoftheCa2+inthesolution.Sometimestags(epitopes,抗原決定103Immunoprecipitation(免疫沉淀)將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應(yīng)體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合物沉淀到試管的底部或微膜上。

It’sausefulmethodtodetectwhatproteinsorothermoleculesareassociatedwiththetargetprotein.Immunoprecipitation(免疫沉淀)將靶蛋白1043.ProteinseparationbyPAGEgelelectrophoresis,followedbyawesternanalysis天然蛋白質(zhì)沒有固定的電荷和二級結(jié)構(gòu)IfwetreattheproteinwithastrongdetergentSDS,thehigherstructureisusuallyeliminated.SDS處理之后的蛋白質(zhì)都帶負(fù)電荷。3.ProteinseparationbyPAGE105106Sometimes,mercaptoethanol(巰基乙醇)isneedtobreakthedisulphidebond.Thus,theproteinmoleculescanberesolvedbyelectrophoresis

inthepresenceofSDSaccordingtothelengthofindividualpolypeptide.Afterelectrophoresis,theproteinscanbevisualizedwithastain,suchasCoomassiebrilliantblue(考馬氏亮藍(lán)).ProteinsfromthePAGEgelcanbetransferredtoamembrane,followedbyawesternanalysisofthetargetproteinbyacorrespondingantibody.106Sometimes,mercaptoethanol1061074.Proteinsequencing(蛋白質(zhì)測序)Twosequencemethod: Edmandegradation

(Edman切割法)

Tandemmassspectrometry(MS/MS)(串連質(zhì)譜).Duetothevastresourceofcompleteornearlycompletegenome,thedeterminationofevenasmallstretchofproteinsequenceissufficienttoidentifythegene.1074.Proteinsequencing(蛋白質(zhì)測1075.Proteomics(蛋白質(zhì)組學(xué))Proteomicsisconcernedwiththeidentificationofthefullsetofproteinsproducedbyacelloratissueunderaparticularbyaparticularsetofconditions.蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)（protein）和基因組（genome）研究在形式和內(nèi)容兩方面的組合，該技術(shù)致力于研究某一物種、個體、器官、組織或細(xì)胞在特定條件、特定時間所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)圖譜。5.Proteomics(蛋白質(zhì)組學(xué))Proteomic108蛋白質(zhì)組學(xué)研究的三種方法1.雙向電泳forproteinseparation(蛋白質(zhì)分離).2.質(zhì)譜分析fortheprecisedeterminationofthemolecularweightandidentifyofaprotein(蛋白質(zhì)鑒定).3.Bioinformaticsforassigningproteinsandpeptidestothepredictedproductsofproteincodingsequenceinthegenome(蛋白質(zhì)確定).蛋白質(zhì)組學(xué)研究的三種方法1.雙向電泳forprotei109雙向電泳(Two－DimensionalElectrophoresis，2-D)技術(shù):等電聚焦（Isoelectricfocusing）及SDS-聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳技術(shù)。蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同pH緩沖液中表現(xiàn)出不同的帶電性，因此，在兩性電解質(zhì)電泳體系中，不同等電點的蛋白質(zhì)會聚集在介質(zhì)上不同的區(qū)域（等電點）從而被分離。雙向電泳(Two－DimensionalElectroph110111111111蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究方法蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究方法112Gelretardation(凝膠阻滯)凝膠滯緩試驗（gelretardationassay），又叫作DNA遷移率變動試驗（DNAmobilityshiftassay），是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。Gelretardation(凝膠阻滯)凝膠滯緩試驗（g113DNAboundtotwoproteinsDNA-proteincomplexBareDNAADNAboundwithmorethanoneproteintoformalargercomplex.DNAboundtoDNA-proteinBareDN114DNaseIfootprinting

(DNaseI足跡法)確定DNA上與蛋白質(zhì)結(jié)合的精確位點5’*SequenceladderisrequiredtodeterminetheprecisepositionAATAAGDNaseIfootprinting

(DNaseI115一種確定DNA結(jié)合蛋白在DNA分子上的結(jié)合位點的方法。原理：將含有特定順式元件的雙鏈DNA片段進(jìn)行單鏈單末端標(biāo)記，與初步純化的DNA結(jié)合蛋白在體外行結(jié)合作用，然后加入DNaseI對DNA一蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行隨機(jī)切割，產(chǎn)生一系列不同長度的DNA片段，其相鄰片段只相差一個核苷酸。DNA結(jié)合蛋白與其特異序列結(jié)合后，由于空間位阻等多種效應(yīng)，DNaseI不能對其進(jìn)行切割.一種確定DNA結(jié)合蛋白在DNA分子上的結(jié)合位點的方法。116BindproteinDNase(mild),thenremoveproteinanddenatureDNADNasefootprinting

（1）TheproteinprotectsDNAfromattackbyDNase.

（2）TreattheDNA-proteincomplexwithDNaseIundermildconditions,sothatanaverageofonlyonecutoccurper

DNAmolecule.

Electrophoresis,autoradiographBindproteinDNase(mild),thenr117015[Protein]ThethreelanesrepresentDNAthatwasboundto0,1,and5unitsofprotein.

Thelanewithnoprotein

showsaregularladderoffragments.Thelanewithoneunitshowssome

protection,andthelane

with5unitsshowscompleteprotectioninthemiddle.

Byincludingsequencingladders,wecantellexactlywheretheproteinbound.TCGGAGCAACGCAAACAAACGTGCTTGG015[Protein]Thethreelanesre118DeterminingtheStructureofProteinandnucleicacidsX-raycrystallography(X-晶體衍射)NMR(核磁共振)DeterminingtheStructureofX-119X-raycrystallography

DeterminingthetertiarystructureX-射線晶體衍射結(jié)構(gòu)分析法(X-raycrystallography):測定X-射線穿過晶體時候產(chǎn)生的衍射斑的位置和強(qiáng)度，繪制蛋白質(zhì)分子的電子密度圖；結(jié)合蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)和二硫鍵信息，解出蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象。確定多肽鏈上所有原子空間排布，氫原子除外Averypowerfultoolinunderstandingproteintertiarystructure（三級結(jié)構(gòu)）X-raycrystallographyX-射線晶體衍射120X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析的步驟制備蛋白質(zhì)晶體收集處理衍射數(shù)據(jù)計算電子密度圖解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ManyproteinshavebeencrystallizedandanalyzedX-射線衍射結(jié)構(gòu)分析的步驟制備蛋白質(zhì)晶體Manyprote121TheribosomestructureanditsinteractionwithmRNAandtRNATheribosomestructureandits122根據(jù)電場中質(zhì)子的核磁共振波譜確定蛋白質(zhì)的構(gòu)象

確定液體中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不同于X-射線衍射法Proteinmeasuredareusuallysmallerthan30KDa.核磁共振法（NMR）根據(jù)電場中質(zhì)子的核磁共振波譜確定蛋白質(zhì)的構(gòu)象確定液體中蛋白123與X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析法的比較X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析法常常會破壞蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，NMR不會；X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析法只能測定晶體蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象，NMR能夠測定溶液中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析法只能測定靜態(tài)構(gòu)象，而NMR蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化過程與X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析法的比較X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析法常常會破124NMR的應(yīng)用測定溶液中蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象；測定各種因子（溫度，pH，變性劑）對蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的影響；研究底物、產(chǎn)物、抑制劑、輔基、效應(yīng)物與酶分子的相互作用，獲得結(jié)構(gòu)中心的信息；研究相同或者不同蛋白質(zhì)之間的相互作用或核酸蛋白質(zhì)之間的相互作用。NMR的應(yīng)用測定溶液中蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象；125核酸研究技術(shù): Electrophoresis;Restrictiondigestion;Hybridization(southern&northern);PCRamplification;sequencingandgenomesequencing;DNAcloningandgeneexpression.蛋白質(zhì)研究技術(shù): Proteinpurification;affinitychromatography;Proteinseparationandidentificationbywesternblot;Proteinsequencing;Proteomics.核酸與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) Gelretardation&Nucleaseprotectionassays研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的技術(shù)

X-raycrystallography,NMR核酸研究技術(shù):126基因工程研究技術(shù)Preparation,analysisandmanipulationofnucleicacidsandproteins基因工程研究技術(shù)Preparation,analysis127所有的分子生物學(xué)技術(shù)都是基于對核酸和蛋白質(zhì)性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上發(fā)展的雜交：

thebase-pairingcharacteristicsofDNAandRNAPCR：ThermophilicDNApolymeraseDNA克?。篋NApolymerase,restrictionendonucleasesandDNAligase所有的分子生物學(xué)技術(shù)都是基于對核酸和蛋白質(zhì)性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上發(fā)1281.核酸研究技術(shù)電泳分離：SeparationbyElectrophoresis限制性內(nèi)切酶切割：CutbyRestrictionendonuclease雜交鑒定：IdentificationbyHybridizationPCR擴(kuò)增：

AmplificationbyPCRDNA克隆和基因表達(dá)：DNACloningandgeneexpressionDNA文庫的構(gòu)建和目的基因的篩選（ConstructionofDNAlibrary&screeningoftargetgene)基因組序列和分析：Genomesequence&analysis1.核酸研究技術(shù)電泳分離：SeparationbyEl1291.凝膠電泳是根據(jù)DNA和RNA的分子量大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等性質(zhì)進(jìn)行分離一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率；電泳的遷移率與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。1.凝膠電泳是根據(jù)DNA和RNA的分子量大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等性130DNA、RNA由于其骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，帶有負(fù)電荷，在電場中向正電極移動。線性DNA分子根據(jù)其分子量大小來分離。分子量大的DNA電泳速度比分子量小的DNA要慢。環(huán)狀DNA的電泳速度與其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相關(guān)。不同構(gòu)型，相同大小分子量的DNA的電泳速度是：SCDNA>LDNA>OCDNADNA、RNA由于其骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，帶有負(fù)電荷131基因工程研究技術(shù)132Gelmatrix(膠支持物)膠支持物是凝膠狀的多孔物質(zhì)，能允許DNA分子通過其內(nèi)部的孔隙。瓊脂糖（Agarose）聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）Gelmatrix(膠支持物)膠支持物是凝膠狀的多孔物質(zhì)133溴化乙錠（ＥＢ）ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或者ＲＮＡ相鄰堿基之間，在300nm波長的紫外線照射下發(fā)出熒光。當(dāng)DNA和RNA用EB充分處理之后，其熒光強(qiáng)度與其分子量大小呈正比溴化乙錠（ＥＢ）ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或134135瓊脂糖(Agarose):分離效果比聚丙烯酰胺差,能夠分離大分子DNA，分子量高達(dá)幾十Kb1kb0.5kb2kb3kb4kb9瓊脂糖(Agarose):1kb0.5kb2kb135136聚丙稀酰胺(Polyacrylamide):分離能力高，能夠分辨相差一個堿基或者一個堿基對的DNA或者RNA分子只能分離小分子量大樣品

(1toafewhundredbp).10聚丙稀酰胺136137DNA分子的遷移方向隨電場方向的周期性變化而不斷改變.根據(jù)DNA地分子量大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來分離樣品.用來分離大分子的樣品，分子量超過50Kb，甚至高達(dá)幾M.Pulsed-fieldgelelectrophoresis(脈沖場電泳)11DNA分子的遷移方向隨電場方向的周期性變化而不斷改變.137Switchingbetweentwoorientations:thelargertheDNAis,thelongerittakestoreorientSwitchingbetweentwoorientat138RNA與DNA類似，帶有負(fù)電荷；RNA是單鏈分子，很容易自發(fā)形成分子內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，影響了電泳分離效果；用乙二醛處理RNA，阻止RNA的堿基配對，使得RNA與ＤＮＡ一樣，電泳遷移率與分子量大小相關(guān)RNA也可以用電泳方法分離RNA與DNA類似，帶有負(fù)電荷；RNA也可以用電泳方法分離1392.限制性內(nèi)切酶在特定位點切割DNA分子識別位點粘性末端平末端同裂酶同尾酶？2.限制性內(nèi)切酶在特定位點切割DNA分子識別位點？1403.DNA雜交-確定特殊的DNA分子雜交（Hybridization):不同來源的單鏈DNA或者RNA通過堿基配對形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的過程3.DNA雜交-確定特殊的DNA分子雜交（Hybridiz141探針-Probe探針：一段帶有特殊標(biāo)記的核苷酸序列，可以用來從混合的核苷酸中尋找含有與其序列互補(bǔ)的核苷酸序列。將要用探針雜交的混合核苷酸可以在電泳分離后的凝膠上，也可以在一個文庫的不同的克隆中。探針在雜交之前需要進(jìn)行標(biāo)記，以便于在探針與目標(biāo)序列雜交后能夠被檢測出。探針-Probe探針：一段帶有特殊標(biāo)記的核苷酸序列，可以用來142探針的標(biāo)記Radioactivelabeling:displayand/ormagnifythesignalsbyradioactivity.Non-radioactivelabeling:displayand/ormagnifythesignalsbyantigenlabeling:antibodybinding–enzymebinding-substrateapplication(signalrelease)探針的標(biāo)記Radioactivelabeling:dis143Southernblotting：將變性處理的后的DNA片段進(jìn)行凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交以顯示這些DNA，這種技術(shù)成為Southernblotting。Northernblotting：將RNA從瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，再用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交的技術(shù)。其原理與Southernblotting類似。探針雜交可以確認(rèn)電泳分離后的DNA和RNASouthernblotting：將變性處理的后的DNA144Northern/SouthernblotanalysisgelmembraneElectrophoresisblottingHybridizationNorthern/Southernblotanalysi145SouthernandNorthernblottingDNAonblotRNAonblotGenomicDNApreparation RNApreparationRestrictiondigestion -Denaturewithalkali -Agarosegelelectrophoresis DNAblotting/transferandfixationRNA6.Probelabeling 6.Hybridization (temperature) 7.Signaldetection(X-rayfilmorantibody)SouthernandNorthernblotting146WesternblottingWesternblotting：又稱為蛋白質(zhì)印跡法，用來檢測在不均一的蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標(biāo)蛋白質(zhì)的技術(shù)。操作程序與Souternblotting類似。先將蛋白質(zhì)經(jīng)過SDS電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜之類的固體支持物上，通過專一性抗體探測目標(biāo)蛋白質(zhì)；隨后用標(biāo)記的第二抗體檢測在印跡中是否存在免疫復(fù)合物（一抗與抗原的復(fù)合物）。WesternblottingWesternblotti147148Blottype