蛋白質(zhì)結(jié)晶的基本方法結(jié)晶的方法分3種：批量結(jié)晶、蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶、液/液擴(kuò)散結(jié)晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶的基本方法①批量結(jié)晶。批量結(jié)晶是最古老和最簡單的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法。它將所要結(jié)晶的蛋白質(zhì)與結(jié)晶劑按要求的濃度在實(shí)驗開始時，就混合起來以達(dá)到所要的過飽和度。實(shí)驗樣液的體積在50μL～幾個毫升左右。由于批量結(jié)晶的樣液體積較大，所以此法并不適于對最佳結(jié)晶條件的探索實(shí)驗。一種改進(jìn)的方法叫微量分批結(jié)晶技術(shù)。①批量結(jié)晶。批量結(jié)晶是最古老和最簡單的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法。它將所②蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶。摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件最常用的方法是應(yīng)用蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶的懸滴法。因為此法不但可節(jié)省樣品而且可有效利用儲存空間。此法是使任何揮發(fā)性的組分在小液滴和大樣品池間達(dá)到平衡，使蛋白質(zhì)液滴中沉淀劑及蛋白質(zhì)的濃度逐漸增加,達(dá)到過飽和狀態(tài),最終析出晶體。晶體生長的基本裝置是Linbro多孔組織培養(yǎng)板及用二甲基二氯硅烷硅化后的玻片或塑料蓋玻片。②蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶。摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件最常用的方法是應(yīng)用蒸發(fā)擴(kuò)散懸滴法長晶體包括以下四個步驟： 第一步,在作結(jié)晶實(shí)驗之前，最好對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行離心，以除去不溶解的蛋白和雜質(zhì),以減少不必要的成核中心,此外，對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行超濾，也是值得推薦的。 第二步,采用“吹氣法”除去培養(yǎng)晶體用的組織培養(yǎng)板和蓋玻片上可能帶有的灰塵。懸滴法長晶體包括以下四個步驟： 第一步,在作結(jié)晶實(shí)驗之前， 第三步，在組織培養(yǎng)板的孔中加入0.2-0.5ml經(jīng)過超濾的含沉淀劑及添加劑的緩沖液,作為池液,孔邊緣涂上真空脂。第四步,吸1ul或2ul池液放到硅化后的蓋玻片上,加等體積蛋白溶液至此池液上(這個體積比將決定平衡后的蛋白質(zhì)濃度)，混合均勻，應(yīng)避免氣泡出現(xiàn)。第五步,翻轉(zhuǎn)蓋玻片蓋在孔上,檢查密封是否良好。 第三步，在組織培養(yǎng)板的孔中加入0.2-0.5ml經(jīng)過超上述方法中步驟2和4目前己可在自動化儀器中進(jìn)行,但是,絕大部分擁有該儀器的實(shí)驗室最終還是樂意采用手工方法。起始的條件實(shí)驗常在感興趣的區(qū)域(通常低于沉淀蛋白所需的濃度)進(jìn)行，然后再進(jìn)行實(shí)驗條件的優(yōu)化。一般的,蛋白質(zhì)晶體生長所需的硫酸胺等沉淀劑濃度在理想濃度的1%或2%偏差范圍內(nèi),但對于不同分子量的聚乙醇胺（PEG）則可寬松一些。晶體在數(shù)小時至數(shù)月后出現(xiàn)。通常，微晶可用作晶種以長出合用的晶體。上述方法中步驟2和4目前己可在自動化儀器中進(jìn)行,但是,絕蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶的另一種形式是坐滴法,坐滴中含池液和蛋白溶液各1－2ul。此方法對于以下情況非常適用：即使用非離子去垢劑作為添加劑表面張力較低時；或用聚乙二醇或乙醇作為沉淀劑(由于凝結(jié)等問題,懸滴體積趨于增大)時；反向擴(kuò)散導(dǎo)致液滴增大時；或結(jié)晶條件已確定,需要大量晶體時。蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶的另一種形式是坐滴法,坐滴中含池液和蛋白溶液各③液/液擴(kuò)散結(jié)晶又叫自由界面結(jié)晶。位于毛細(xì)管中的樣品液約10L和結(jié)晶液由于存在濃度梯度，而在界面處發(fā)生自由擴(kuò)散，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液的過飽和及隨后的結(jié)晶。③液/液擴(kuò)散結(jié)晶又叫自由界面結(jié)晶。位于毛細(xì)管中的樣品液約10蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響因素①結(jié)晶蛋白質(zhì)的純度。獲得高純度的蛋白質(zhì)是對其進(jìn)行結(jié)晶的前提。Lin等通過采用FPLC快速液相色譜系統(tǒng)得到結(jié)晶級的蛋白質(zhì)，同時發(fā)現(xiàn)用此法得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶的可重復(fù)性及獲得晶體的衍射清晰度都大大提高。蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響因素①結(jié)晶蛋白質(zhì)的純度。獲得高純度的蛋白質(zhì)是②過飽和度。溶液的過飽和度是蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶的驅(qū)動力，其本質(zhì)就是過飽和溶液的實(shí)際溶解度與飽和溶液的溶解度即該蛋白質(zhì)的溶解度之間的化學(xué)勢的差值。過飽和度的高低決定了結(jié)晶過程中成核及晶體生長的快慢，從而決定了晶體質(zhì)量的好壞②過飽和度。溶液的過飽和度是蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶的驅(qū)動力，其本質(zhì)就③溫度。溫度的變化會引起蛋白質(zhì)溶解度的改變。研究表明，大多數(shù)的蛋白質(zhì)的結(jié)晶是在4～22℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。某些蛋白質(zhì)的鹽溶液在低溫時的溶解度趨向升高，而在聚乙二醇及甲基丙二醇溶劑中的溶解度隨溫度降低而降低。③溫度。溫度的變化會引起蛋白質(zhì)溶解度的改變。研究表明，大多數(shù)④pH值。蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，結(jié)晶體系pH值的變化對其結(jié)晶行為有著重要的影響。對于有些蛋白質(zhì)分子如：E.coli的閉環(huán)腺苷酸激酶，如果不考慮所得晶體的晶型，則結(jié)晶可在較寬的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行，但是如果涉及特定的晶型，則對pH值的要求非常嚴(yán)格，通常其波動范圍不超過1。一般來講，越靠近最佳pH值，晶型越單一，所得晶體質(zhì)量越高。④pH值。蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，結(jié)晶體系pH值的變化對其結(jié)晶結(jié)晶劑對于蛋白質(zhì)的結(jié)晶，結(jié)晶劑的作用主要在于對溶劑水的影響而非對蛋白質(zhì)分子的影響。一般來講，結(jié)晶劑主要分為6類：①鹽類，如：磷酸鹽、硫酸銨等；②高分子直鏈聚合物，如：聚乙二醇PEG、聚乙烯醇PVA、聚乙烯吡咯烷酮PVP等；③小分子多元醇MPD類，如：2-甲基2,4-戊二醇；④有機(jī)溶劑類，如：乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇、叔丁醇等；⑤磺酰類染料；⑥去離子水。在實(shí)際工作中，通常使用混合結(jié)晶劑以獲得更好的實(shí)驗效果。結(jié)晶劑對于蛋白質(zhì)的結(jié)晶，結(jié)晶劑的作用主要在于對溶劑水的影響而壓力Sazaki等用雙光束干涉儀測定了高壓下的溶菌酶蛋白四方結(jié)晶及正交結(jié)晶的溶解度變化。實(shí)驗表明，隨著壓力的增高其正交結(jié)晶的溶解度降低，而四方結(jié)晶的溶解度增大?？赡苁怯捎诓煌偷牡鞍踪|(zhì)分子的疏水親水程度不同，隨著壓力的變化，與水的作用效果不同并反映出溶解度的變化的不同。因此，已有越來越多的研究者開始利用壓力作為蛋白質(zhì)結(jié)晶過程中的一個重要的調(diào)整參數(shù)以得到目的產(chǎn)物。壓力Sazaki等用雙光束干涉儀測定了高壓下的溶菌酶蛋白四蛋白質(zhì)結(jié)晶的基本方法結(jié)晶的方法分3種：批量結(jié)晶、蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶、液/液擴(kuò)散結(jié)晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶的基本方法①批量結(jié)晶。批量結(jié)晶是最古老和最簡單的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法。它將所要結(jié)晶的蛋白質(zhì)與結(jié)晶劑按要求的濃度在實(shí)驗開始時，就混合起來以達(dá)到所要的過飽和度。實(shí)驗樣液的體積在50μL～幾個毫升左右。由于批量結(jié)晶的樣液體積較大，所以此法并不適于對最佳結(jié)晶條件的探索實(shí)驗。一種改進(jìn)的方法叫微量分批結(jié)晶技術(shù)。①批量結(jié)晶。批量結(jié)晶是最古老和最簡單的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法。它將所②蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶。摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件最常用的方法是應(yīng)用蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶的懸滴法。因為此法不但可節(jié)省樣品而且可有效利用儲存空間。此法是使任何揮發(fā)性的組分在小液滴和大樣品池間達(dá)到平衡，使蛋白質(zhì)液滴中沉淀劑及蛋白質(zhì)的濃度逐漸增加,達(dá)到過飽和狀態(tài),最終析出晶體。晶體生長的基本裝置是Linbro多孔組織培養(yǎng)板及用二甲基二氯硅烷硅化后的玻片或塑料蓋玻片。②蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶。摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件最常用的方法是應(yīng)用蒸發(fā)擴(kuò)散懸滴法長晶體包括以下四個步驟： 第一步,在作結(jié)晶實(shí)驗之前，最好對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行離心，以除去不溶解的蛋白和雜質(zhì),以減少不必要的成核中心,此外，對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行超濾，也是值得推薦的。 第二步,采用“吹氣法”除去培養(yǎng)晶體用的組織培養(yǎng)板和蓋玻片上可能帶有的灰塵。懸滴法長晶體包括以下四個步驟： 第一步,在作結(jié)晶實(shí)驗之前， 第三步，在組織培養(yǎng)板的孔中加入0.2-0.5ml經(jīng)過超濾的含沉淀劑及添加劑的緩沖液,作為池液,孔邊緣涂上真空脂。第四步,吸1ul或2ul池液放到硅化后的蓋玻片上,加等體積蛋白溶液至此池液上(這個體積比將決定平衡后的蛋白質(zhì)濃度)，混合均勻，應(yīng)避免氣泡出現(xiàn)。第五步,翻轉(zhuǎn)蓋玻片蓋在孔上,檢查密封是否良好。 第三步，在組織培養(yǎng)板的孔中加入0.2-0.5ml經(jīng)過超上述方法中步驟2和4目前己可在自動化儀器中進(jìn)行,但是,絕大部分擁有該儀器的實(shí)驗室最終還是樂意采用手工方法。起始的條件實(shí)驗常在感興趣的區(qū)域(通常低于沉淀蛋白所需的濃度)進(jìn)行，然后再進(jìn)行實(shí)驗條件的優(yōu)化。一般的,蛋白質(zhì)晶體生長所需的硫酸胺等沉淀劑濃度在理想濃度的1%或2%偏差范圍內(nèi),但對于不同分子量的聚乙醇胺（PEG）則可寬松一些。晶體在數(shù)小時至數(shù)月后出現(xiàn)。通常，微晶可用作晶種以長出合用的晶體。上述方法中步驟2和4目前己可在自動化儀器中進(jìn)行,但是,絕蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶的另一種形式是坐滴法,坐滴中含池液和蛋白溶液各1－2ul。此方法對于以下情況非常適用：即使用非離子去垢劑作為添加劑表面張力較低時；或用聚乙二醇或乙醇作為沉淀劑(由于凝結(jié)等問題,懸滴體積趨于增大)時；反向擴(kuò)散導(dǎo)致液滴增大時；或結(jié)晶條件已確定,需要大量晶體時。蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶的另一種形式是坐滴法,坐滴中含池液和蛋白溶液各③液/液擴(kuò)散結(jié)晶又叫自由界面結(jié)晶。位于毛細(xì)管中的樣品液約10L和結(jié)晶液由于存在濃度梯度，而在界面處發(fā)生自由擴(kuò)散，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液的過飽和及隨后的結(jié)晶。③液/液擴(kuò)散結(jié)晶又叫自由界面結(jié)晶。位于毛細(xì)管中的樣品液約10蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響因素①結(jié)晶蛋白質(zhì)的純度。獲得高純度的蛋白質(zhì)是對其進(jìn)行結(jié)晶的前提。Lin等通過采用FPLC快速液相色譜系統(tǒng)得到結(jié)晶級的蛋白質(zhì)，同時發(fā)現(xiàn)用此法得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶的可重復(fù)性及獲得晶體的衍射清晰度都大大提高。蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響因素①結(jié)晶蛋白質(zhì)的純度。獲得高純度的蛋白質(zhì)是②過飽和度。溶液的過飽和度是蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶的驅(qū)動力，其本質(zhì)就是過飽和溶液的實(shí)際溶解度與飽和溶液的溶解度即該蛋白質(zhì)的溶解度之間的化學(xué)勢的差值。過飽和度的高低決定了結(jié)晶過程中成核及晶體生長的快慢，從而決定了晶體質(zhì)量的好壞②過飽和度。溶液的過飽和度是蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶的驅(qū)動力，其本質(zhì)就③溫度。溫度的變化會引起蛋白質(zhì)溶解度的改變。研究表明，大多數(shù)的蛋白質(zhì)的結(jié)晶是在4～22℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。某些蛋白質(zhì)的鹽溶液在低溫時的溶解度趨向升高，而在聚乙二醇及甲基丙二醇溶劑中的溶解度隨溫度降低而降低。③溫度。溫度的變化會引起蛋白質(zhì)溶解度的改變。研究表明，大多數(shù)④pH值。蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，結(jié)晶體系pH值的變化對其結(jié)晶行為有著重要的影響。對于有些蛋白質(zhì)分子如：E.coli的閉環(huán)腺苷酸激酶，如果不考慮所得晶體的晶型，則結(jié)晶可在較寬的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行，但是如果涉及特定的晶型，則對pH值的要求非常嚴(yán)格，通常其波動范圍不超過1。一般來講，越靠近最佳pH值，晶型越單一，所得晶體質(zhì)量越高。④pH值。蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，結(jié)晶體系pH值的變化對其結(jié)晶結(jié)晶劑對于蛋白質(zhì)的結(jié)晶，結(jié)晶劑的作用主要在于對溶劑水的影響而非對蛋白質(zhì)分子的影響。一般來講，結(jié)晶劑主要分為6類：①鹽類，如：磷酸鹽、硫酸銨等；②高分子直鏈聚合物，如：聚乙二醇PEG、聚乙烯醇PVA、聚乙烯吡咯烷酮PVP等；③小分子多元醇MPD類，如：2-甲基2,4-戊二醇；④有機(jī)溶劑類，如：乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇、叔丁醇等；⑤磺酰類染料；⑥去離子水。在實(shí)際工作中，通常使用混合結(jié)晶劑以獲得更好的實(shí)驗效果。結(jié)晶劑對于蛋白質(zhì)