NextGenerationSequencingSamplefragmentationLibrarypreparationSequencingreactionDataanalysisRoche454焦磷酸測序PyrophosphateSequencingIlluminaSolexa合成測序SequencebySynthesizeABISOLiD連接法測序SequencebyLigation深度(高通量）測序技術(shù)簡介Roche454焦磷酸測序PyrophosphateSequencing基本原理

Roche454測序技術(shù)邊合成邊測序（sequencingbysynthesis）454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購目前，Roche454GSFLXTitanium每次運(yùn)行能產(chǎn)生100萬條序列，平均讀長能達(dá)到400nt，且第400個堿基的準(zhǔn)確率能達(dá)到99%。一次運(yùn)行所需時間為10小時，能獲得4-6億個堿基的序列信息。454sequencing：EmulsionPCR(emPCR)MixDNALibrary&capturebeads(limiteddilution)“Breakmicro-reactors”IsolateDNAcontainingbeadsGenerationofmillionsofclonallyamplifiedtemplatesoneachbeadNocloningandcolonypickingCreate“Water-in-oil”emulsion+PCRReagents+EmulsionOilPerformemulsionPCRAdaptercarryinglibraryDNAABMicro-reactorsAdaptercomplementEnrichAnnealSeqprimerCentrifugeStepLoadEnzymeBeads454sequencing：

DepositionofDNAbeadsinto thePicoTiter?PlateLoadbeadsintoPicoTiter?PlateIlluminaSolexa合成測序SequencebySynthesize基本原理

Illumina

Solexa測序技術(shù)Illumina公司于2007年初花費(fèi)6億美金巨資收購了Solexa,

2010年初，Illumina將其第二代測序儀GenomeAnalyzerIIx升級到HiSeq2000HiSeq2000含有兩張F(tuán)lowcell，可同時運(yùn)行或者只運(yùn)行其中一張。讀長為100nt，同時支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文庫。每次運(yùn)行最多可產(chǎn)生200GB的數(shù)據(jù)量（讀長為2x100nt）。ClonalSingleMoleculeArrays

單分子克隆~1000moleculesper~1μmcluster

~1000clustersper100μmsquare~40millionclustersperexperimentPrepareDNAfragmentsLigateadaptersAttachsinglemoleculestosurfaceAmplifytoformclusters20micronsSequenceReversibleTerminatorChemistry

可逆終止反應(yīng)OPPPHNNOOcleavagesitefluor3’blockNextcycleIncorporationDetectionDeblock;fluorremovalODNAHNNOO3’O5’free3’endXOHAll4labellednucleotidesin1reactionSequencing-by-Synthesis(SBS)

5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents Removeunincorporatedbases DetectsignalCycle2-n:Addsequencingreagentsandrepeat1、每輪測序反應(yīng)加入四種帶有熒光標(biāo)記的dNTP，末端帶有可以被去除的阻斷基團(tuán)2、每輪反應(yīng)只能整合一個核苷酸，儀器讀取相應(yīng)的熒光信號3、信號讀取結(jié)束，用化學(xué)方法去除阻斷基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測序反應(yīng)123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages根據(jù)每個點(diǎn)每輪反應(yīng)讀取的熒光信號序列，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA序列BasecallingfromtherawdataSolexa測序WorkflowABISOLiD連接法測序SequencebyLigation基本原理ABISOLiD測序技術(shù)2010年末又發(fā)布了最新產(chǎn)品--SOLiD5500xl測序平臺。SOLiD5500xl含有兩張微流體芯片（microfluidicFlowChip），每張芯片含有6條相互獨(dú)立的運(yùn)行通道（runlane）。每條lane都能運(yùn)行相對獨(dú)立的測序反應(yīng)，這樣的設(shè)計(jì)使得SOLiD5500xl測序平臺極具靈活性。最大測序讀長為75nt，同樣支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文庫。單次運(yùn)行能得到的最大數(shù)據(jù)量為300Gb（使用最新設(shè)計(jì)的nanobeads）。測序的系統(tǒng)準(zhǔn)確性能達(dá)到99.99%文庫制備：微珠單分子克隆1024種8堿基探針4色熒光，4種雙核苷酸，每色熒光有256個探針(4^6)SOLiD利用探針的連接反應(yīng)讀取模板的DNA序列連接法測序

（一）綠宇生物科技專業(yè)建庫測序QQ:110199525每個探針進(jìn)行檢測的兩個堿基后面有三個匹配堿基，因此一條測序引物讀取的序列是不完整的測序引物與adapter退火探針連接，檢測熒光切除熒光基團(tuán)第二輪探針連接，檢測熒光切除熒光基團(tuán)連接法測序

（二）測序引物沿著Adapter移動5次，確保每個位點(diǎn)都被檢測連接法測序

（三）0位置是Adapter的最后一個堿基，因此只檢測一次，該堿基是進(jìn)行解碼所必須的。Advantage&disadvantage454sequencing讀取長度大，400bp可以對未知基因組進(jìn)行從頭測序denovosequencing當(dāng)遇到polymer時，如AAAAAA等，熒光強(qiáng)度和堿基個數(shù)不成線性關(guān)系，判定重復(fù)堿基個數(shù)有困難Solexasequencing高度自動化的系統(tǒng)讀取片段多，適合進(jìn)行大量小片段的測序，如microRNAprofiling基于可逆反應(yīng)，隨反應(yīng)輪數(shù)增加，效率降低，信號衰減，讀取序列較短，給denovosequencing拼接帶來困難SOLiDsequencing每個堿基讀取兩次非常高的準(zhǔn)確性，特別是對于SNP的檢測靈活的系統(tǒng)，完善的磁珠編碼系統(tǒng)，可以進(jìn)行樣品的pooling，分割測序區(qū)域讀取長度受連接反應(yīng)的輪數(shù)限制，給denovosequencing拼接帶來困難高通量測序的應(yīng)用Denovo

測序基因深度測序（genomere-sequencing）轉(zhuǎn)錄組深度測序（transcriptomere-sequencing）DigitalexpressionprofilingChIP-seqMethy-seqTranscriptomeresequencing：malignantpleuralmesotheliomas(MPMs)：惡性胸膜間皮瘤pulmonaryadenocarcinoma(ADCA)：肺腺癌TranscriptomecharacteristicsSolidline：atleastonereadDashedline：atleast20readsExpressiondifferencebetweenMPMandADCAsamplecomparetoalungtissuecontrolAnalysisofpercent-ageofreadscontainingknowncodingregionSNVsinthesixtissuesamples.SNV：SingleNucleotideSubstitutionVariantDigitalexpressionprofiling（1）：

人大腦組織與UHR（UniversalHumanReference）的表達(dá)差異DigitalexpressionprofilingµRNAre-sequencing：hESC：humanembryonicstemcellsEB：embryoidbodiesChIP-seq（1）：人一號染色體DNA-蛋白相互作用ChIP-seq（2）：Sequencedshortreads(typically
25–50bp)fromChIP-Seqexperimentsare?rstmappedontothereferencegenome.Themappedreadsarethenusedtoestimatestatisticalparameters,whichincludetheestimationoftheaveragelengthFofsequencedDNAfragments.Methy-seq（1）：腫瘤和MCF7細(xì)胞系中BRCA!啟動子區(qū)域的甲基化差異Somehighlights:

CorrelationbetweenChIP-SeqandhispriorSAGE-likemethod(calledGMAT)hasr=0.906

‘HowevertheresolutionwithChIP-Seqwasdramaticallyhigher.Furthermore,ChIP-Seqwasmoresensitiveandgeneratedlessfalse-negativeregions’

12,726geneswhosetranscriptionlevelsareknowninCD4+T-cellswerecorrelatedwiththehistonemodificationsand35,961PolIIbindingsite‘islands’wereidentified

‘Thiscost-effectivemethodproducesdigital-qualitydataandshouldfindbroadapplicationsinoureffortstounderstandthecontributionofthehumanepigenomesingeneexpressionandepigeneticinheritance’

Methy-seq（2）：第三代測序技術(shù)簡介第二代測序技術(shù)在制備測序文庫的時候都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測序的讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時會遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)。簡介如下：1.

Helicos公司Helicos公司的Heliscope單分子測序儀基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機(jī)打斷成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)記。用小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一種dNTP。將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，檢測上一步記錄的雜交位置上是否有熒光信號，如果有則說明該位置上結(jié)合了所加入的這種dNTP。用化學(xué)試劑去掉熒光標(biāo)記，以便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。Heliscope的讀取長度約為30-35nt，每個循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為21-28Gb。2.

PacificBiosciences公司PacificBiosciences公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測序的思想，以SMRT芯片為測序載體進(jìn)行測序反應(yīng)。SMRT芯片是一種帶有很多ZMW(zero-modewaveguides)孔的厚度為100nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。當(dāng)一個dNTP被添加到合成鏈上的同時，它會進(jìn)入ZMW孔的熒光信號檢測區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。此外由于dNTP在熒光信號檢測區(qū)停留的時間（毫秒級）與它進(jìn)入和離開的時間（微秒級）相比會很長，所以信號強(qiáng)度會很大。其它未參與合成的dNTP由于沒進(jìn)入熒光型號檢測區(qū)而不會發(fā)出熒光。在下一個dNTP被添加到合成鏈之前，這個dNTP的磷酸基團(tuán)會被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號檢測區(qū)。3.

OxfordNanoporeTechnologies公司OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)是一種基于電信號測序的技術(shù)。他們設(shè)計(jì)了一種以α-溶血素為材料制作的納米孔，在孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭環(huán)糊精。用核酸外切酶切割ssDNA時，被切下來的單個堿基會落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度，這種電流強(qiáng)度的變化幅度就成為每種堿基的特征。三代測序技術(shù)的原理各有特點(diǎn)，適用范圍也不近相同。第一代測序技術(shù)憑借其長的序列片段和高的準(zhǔn)確率，適合對新物種進(jìn)行基因組長距框架的搭建以及后期GAP填補(bǔ)，但是成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品的測序工作。第二代測序技術(shù)中，454序列片段最長，比較適合對未知基因組從頭測序，搭建主體結(jié)構(gòu)，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時準(zhǔn)確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價位低的特點(diǎn)，可以用于大基因組和小基因組的測序和重測序。Solexa雙末端測序(paired-endsequencing)可以為基因組進(jìn)一步拼接提供定位信息，但是隨著反應(yīng)輪數(shù)增加，序列長度和質(zhì)量均有所下降，而且在閱讀AT區(qū)時有明顯錯誤傾向。SOLiD基于雙堿基編碼系統(tǒng)的糾錯能力以及較高的測序通量，適合轉(zhuǎn)錄本研究以及比較基因組學(xué)特別是SNP檢測等，但是測序的片段短限制了該技術(shù)在基因組拼接中的廣泛應(yīng)用。第三代測序技術(shù)目前正在研發(fā)階段，尚未正式投入使用。部分參考文獻(xiàn)閱讀Genomere-sequencing

vanOrsouwNJ,HogersRC,JanssenA,etal.Complexityreductionofpolymorphicsequences(CRoPS):anovelapproachforlarge-scalepolymorphismdiscoveryincomplexgenomes.PLoSONE,2007,2(11):e1172HillierLW,MarthGT,QuinlanAR,etal.Whole-genomesequencingandvariantdiscoveryinC.elegans.NatMethods,2008,5(2):183—188Transcriptomere-sequencingMortazaviA,WilliamsBA,McCueK,etal.MappingandquantifyingmammaliantranscriptomesbyRNA-Seq.NatMethods,2008,5(7):621—628SugarbakerDJ,RichardsWG,GordonGJ,etal.Transcriptomesequencingofmalignantpleuralmesotheliomatumors.ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(9):3521—3526DigitalexpressionprofilingRubyJG,JanC,PlayerC,etal.Large-scalesequencingreveals21U-RNAsandadditionalmicroRNAsandendogenoussiRNAsinC.elegans.Cell,2006,127(6):1193—1207MorinRD,O'ConnorMD,GriffithM,etal.ApplicationofmassivelyparallelsequencingtomicroRNAprofilinganddiscoveryinhumanembryonicstemcells.GenomeRes,2008,18(4):610—621ChIP-seqJohnsonDS,MortazaviA,MyersRM,etal.Genome-wid