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SDIFST山東省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SDIFST0004—2021貝類過敏原的小鼠模型致敏性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程Codeofpracticeforallergenicityassessmentofmolluscallergeninamousemodel2022-10-28發(fā)布 2022-10-28山東省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì) 發(fā)布T/SDIFST0004—2021T/SDIFST0004—2021前 言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文本的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)海洋大學(xué)提出。本文件由山東省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位：中國(guó)海洋大學(xué)、黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、榮成銀海水產(chǎn)有限公司。本文件主要起草人：李振興、林洪、張自業(yè)、牟偉麗、解慶剛、王象欣、姜森。貝類過敏原的小鼠模型致敏性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程范圍本文件確立了貝類過敏原致敏性小鼠模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程，規(guī)定了術(shù)語(yǔ)和定義、一般要求、儀器設(shè)備、試劑與溶液配制、評(píng)價(jià)流程圖、評(píng)價(jià)程序的要求。本文件適用于小鼠模型評(píng)價(jià)貝類過敏原致敏性過程中的技術(shù)操作。GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T6682GB14922.214924.314925GB19489GB/T30891水產(chǎn)品抽樣規(guī)范GB/T35892實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1貝類過敏原molluscallergen貝類中能夠誘發(fā)過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)。其中，貝類包括但不限于：牡蠣等雙殼貝類、螺等單殼貝類、魷魚等頭足貝類。3.2貝類過敏原致敏性molluscallergenallergenicity由貝類過敏原誘發(fā)機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)的能力。3.3免疫球蛋白EimmunoglobulinE(IgE)是介導(dǎo)I型變態(tài)反應(yīng)中起主要作用的免疫分子。3.4過敏小鼠模型Amousemodelformolluscallergy利用小鼠建立評(píng)價(jià)貝類過敏原致敏性的動(dòng)物模型。SPFLBc（68GB14922.1和GB14922.2動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)條件應(yīng)符合GB14925GB19489的規(guī)定，飲用水應(yīng)符合GB5749料應(yīng)符合GB14924.3315W3。2.5m20min~30min動(dòng)物倫理審批應(yīng)按照GB/T35892GB14925貝類樣品取樣應(yīng)符合GB/T30891波長(zhǎng)范圍：330nm～1100nm、吸光度范圍：0.000A～4.000A。感量0.01g、0.0001g。1mL、5mL。最大離心力大于6000×g。濾膜孔徑0.22μm。轉(zhuǎn)速范圍:50r/min～1500r/min。轉(zhuǎn)速范圍:5000r/min～12000r/min、可均質(zhì)樣品范圍:0.03mL～2000mL。注射器容量1mL。冷藏室溫度0℃～10℃、冷凍室-10℃～-20℃。冷凍室溫度-40℃～-80℃。除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?，水?yīng)符合GB/T6682一級(jí)水的規(guī)定。0.01mol/L（PBS）7.90g1.44g1.80g0.20g980mLpH1000μm產(chǎn)品。稱取74.55g氯化鉀，2.42g三羥甲基氨基甲烷，77.00mg二硫蘇糖醇，用800mL超純水溶解后，調(diào)pH至7.5，然后用超純水定容至1000mL。稱取0.29g氫氧化鈉和0.16g碳酸鈉溶于適量超純水中，而后用超純水定容至100mL。10.88mL98%100。TBST8.755g2.422g0.5mL吐溫-20800mL1mol/L的鹽酸調(diào)pH7.51000mL。IgE二抗純度>95%，可選用同類商品化產(chǎn)品。TMB可選用各種同類商品化產(chǎn)品?？蛇x用各種同類商品化產(chǎn)品。貝類過敏原致敏性評(píng)價(jià)流程包括6個(gè)步驟，評(píng)價(jià)流程圖見圖1。圖1 貝過原敏評(píng)價(jià)程GB/T308911mm（5.8）10000r/min5min104℃固8。（5.5）6000g15min加入2（WV=21000攪拌4h后，6000×g離心15min，取沉淀。此步驟重復(fù)三次。6000×g15min8h取10g0W6.2（100抽12。6000g15min0.22μm-20BALB/c（F級(jí)ABc680g2gSPF級(jí)hh12S5～8只。0d7d14d21d28d0.2mL0.05mg貝8.1的BSV=111h1IgES02LBSVV11；10mg/（PBS組給予相同體積的PBS1h1清中特異性IgEPBSIgEPBS組小鼠，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為過敏小鼠模型構(gòu)建成功。圖2 小免方案0.2mL1.0mg貝類過敏原的PBS溶液8.11gE（PBS組0.2mLPBS過敏原給予后約1h觀察小鼠的過敏癥狀，根據(jù)小鼠過敏癥狀的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。小鼠過敏癥狀評(píng)分表見表1。1過敏癥狀評(píng)分無癥狀0反復(fù)撓耳朵、鼻子1眼睛、耳朵腫脹；腹瀉；呼吸急促；活動(dòng)減少2嘴巴、尾巴發(fā)紺；哮喘；呼吸困難3肌肉收縮痙攣4休克；死亡5IgE1h（1000g10min）-18℃以下。（63中（0gL。6100L孔4用TBST（6.5）3（5%300μL/。37℃2hTBST3次。11（VV（10μL孔4次日，取出酶標(biāo)板后用TBST5次。11100E100L孔37孵育2。6.4.2.9用TT5次，再加入TB（10L孔320。（6.4，50μL/孔（52測(cè)定50nmD450ngE（）計(jì)算：R=（A2?A0）×100% （1）A1?A0式中：R——血清IgE抗體效價(jià)；A2——樣品組的吸光度；A0——空白孔的吸光度；A1——對(duì)照組的吸光度。以平行樣的平均值為最終血清IgE抗體效價(jià)，計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后兩位。8.4.18.4.2IgEIgEIgE根據(jù)8.5填寫貝類過敏原致敏性評(píng)價(jià)報(bào)告，以小鼠過敏癥狀評(píng)分的平均值和血清IgE抗體效價(jià)的平均值對(duì)貝類過敏原致敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)，報(bào)告格式見附錄A。附 錄 A（資料性）評(píng)價(jià)報(bào)告貝類過敏原的小鼠模型致敏性評(píng)價(jià)報(bào)告見表A.1。樣品受理編號(hào)：1頁(yè)/樣品受理編號(hào)：1頁(yè)/1頁(yè)樣品稱 檢驗(yàn)別托 送檢位 檢驗(yàn)的致性價(jià) 檢驗(yàn)期 一、試驗(yàn)?zāi)康囊?guī)格量 經(jīng)口給予受試物后，在短時(shí)間內(nèi)觀察小鼠動(dòng)物所產(chǎn)生的過敏反應(yīng)，評(píng)價(jià)貝類過敏原的致敏性。二、試驗(yàn)條件SPF級(jí)健康BALB/c18g～22g7d，SPF25℃±2℃50%±5%，12h12h黑夜，飼料不含貝類過敏原成