口蹄疫研究進展

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院何后軍教授聯(lián)系電話-mail:hehoujun@主要內(nèi)容口蹄疫（FMD）概述口蹄疫（FMD）病毒口蹄疫（FMD）難以控制和根除的原因口蹄疫（FMD）的流行特點目前口蹄疫（FMD）疫苗的應(yīng)用風(fēng)險口蹄疫（FMD）流行毒株與疫苗毒株的生物特性口蹄疫（FMD）的綜合性防控措施口蹄疫（FMD）的研究熱點口蹄疫(FootandMouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠距離傳播的動物疫病。侵染對象是豬、牛、羊等主要畜種及其它家養(yǎng)和野生偶蹄動物，易感動物多達70余種。蹄部病變——蹄客脫落母豬乳頭水皰口蹄疫概述人對FMD病毒的感受性極低，即使感染也屬良性或無癥狀經(jīng)過、且多為幼齡兒童。FMD可導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失，引起幼畜死亡、產(chǎn)奶量下降、肉食減少、肉品下降、動物的生產(chǎn)性能降低，此外由于貿(mào)易的限制和禁止動物及其產(chǎn)品的出口而引致的損失更大，全世界每年由此造成的直接經(jīng)濟損失可達數(shù)百億美元，所以FMD在國際上被稱為“政治經(jīng)濟病”，歷來受到各國政府的重視。國際獸疫局(OIE)將FMD列為動物衛(wèi)生法典中的A類疫病之首。鑒于此，“無FMD國家和地區(qū)”投入巨大成本根除此病并維持其地位，而許多有疫國家則投入巨資執(zhí)行其控制和撲滅根除計劃。口蹄疫概述近兩年來，我國周邊的部分國家和地區(qū)連續(xù)發(fā)生口蹄疫，其流行之廣，損失之大，令人震驚。從口蹄疫的地理分布態(tài)勢可見，我國東與爆發(fā)疫病的日本、韓國和中國臺灣隔海相望，南與疫情常年發(fā)生的越南、緬甸陸路相通，北與疫情復(fù)雜的俄羅斯、蒙古比鄰而居。從所存在的病毒血清型種類、病毒存儲和變異的自然環(huán)境，以及社會、經(jīng)濟等方面的諸多因素來綜合分析。更大的威脅來自位于我國西南的有“口蹄疫毒庫”之稱的印度和西北的“病毒通道”中亞數(shù)國。這些接壤國家的A、C、Asial等毒型和眾多的O型變異株隨時都有可能侵入我國，并可能造成大的流行?？谔阋吒攀鲈诟腥玖丝谔阋卟《镜募?xì)胞培養(yǎng)液中，有大小不同的4種粒子。最大的粒子為完整病毒，其直徑為23±12nm，沉降系數(shù)為146S，具有感染性。第二種為不含RNA的空衣殼，其直徑為21nm，沉降系數(shù)為75S，無RNA，無感染性，有型特異性和免疫原性。第三種為衣殼蛋白亞單位，其直徑為7nm，沉降系數(shù)為12S，無RNA，無感染性，有抗原性。第四種為病毒感染相關(guān)抗原(VIA抗原)，沉降系數(shù)為4.5S，是一種不具有活性的RNA聚合酶，當(dāng)病毒粒了進入細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞蛋白激活才有酶活性，能誘發(fā)動物產(chǎn)生特異抗體，無型特異性，而有群特異性?？谔阋卟《究谔阋卟《灸壳坝蠥、O、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)及AsiaI(亞洲I型)等7個血清型。在A、O、C三個血清型中似乎以O(shè)型最常見。各型間彼此幾乎沒有交叉免疫性。但各型在發(fā)病癥狀方面的表現(xiàn)卻沒有什么不同。每一個血清型又分若干個亞型，同型各亞型之間僅有部分交叉免疫性。據(jù)最新報道，口蹄疫亞型已增加到70個以上。進入80年代后，對新亞型不再編號，甚至到目前已不再強調(diào)亞型的鑒定，只強調(diào)新的分離物與疫苗株進行比較，以便正確選擇疫苗種毒?？谔阋卟《練W洲流行Ｏ、Ａ、Ｃ３個型；亞洲主要流行Ｏ、Ａ、Ｃ和AsiaⅠ型，中東地區(qū)少數(shù)國家也流行SATⅠ型；非洲口蹄疫具有不同的特點，毒型眾多，疫情復(fù)雜，不僅有Ｏ、Ａ、Ｃ３個型，還有獨特流行于非洲南部各國的SAT-Ⅰ、SAT-Ⅱ和SAT-Ⅲ３個型；南美洲流行Ｏ、Ａ、Ｃ３個型。目前在我國內(nèi)地發(fā)生的4起口蹄疫疫情屬亞洲Ⅰ型?？谔阋卟《究谔阋卟《净蚪M結(jié)構(gòu)

口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)

L-蛋白是FMDV中的一種毒力因子。Poly(C)的長短因毒株不同而有很大的差異，可能與病毒的毒力有關(guān)。Poly(A)尾巴與病毒的感染性有關(guān)，Poly(A)越長感染性越強。VP1蛋白大部分暴露在病毒的表面，是決定病毒抗原性的主要成分。VP1的第141～160位和200～213位氨基酸殘基是FMDV的主要抗原區(qū)，能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和抗體，也是抗原性的高變區(qū)。分析該高變區(qū)不僅對FMDV遺傳變異的研究具有指導(dǎo)意義，而且對FMD流行病學(xué)的研究以及新型疫苗的研制也很重要。一般認(rèn)為，F(xiàn)MDV衣殼蛋白VP1上的RGD序列是細(xì)胞表面受體的配體，是FMDV侵染細(xì)胞所必需的。VP1蛋白的G-H環(huán)具有識別受體及中和抗體互相作用的雙重功能。VP4與誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體有關(guān)。2C可能與RNA的復(fù)制有關(guān)，2B與病毒的感染譜有關(guān)?？谔阋卟《净蚪M結(jié)構(gòu)

FMDV-StructureG-HloopVP2VP1VP3口蹄疫病毒與其他動物病毒不同的特點之一就是它的互不免疫的血清型。每個血清型又有很多亞型，1977年世界口蹄疫中心公布口蹄疫病毒有7個血清型和65個亞型，每年還會有新的亞型出現(xiàn)。（多型性、易變性、互不免疫性）各型之間在臨床表現(xiàn)方面沒有什么不同，但彼此間無交叉免疫性。同型各亞型之間交叉免疫程度變化幅度較大，亞型內(nèi)各毒株之間也有明顯的抗原差異。據(jù)FMD世界咨詢實驗室對2000－2003年送檢病毒株的鑒定報告，本世紀(jì)最初4年全世界流行的FMD主要為。O、A,Asial,SAT1和SAT2型。其中鑒定為O型的占發(fā)病國家和地區(qū)的63.9%(39/61),A型為13.1%(8/61),Asial型為9.8%(6/61),SAT1和SAT2型均為6.6%(4/61)。但特別值得關(guān)注的是：南非獨特流行的SAT2型己傳至中東的科威特和沙特(2000年);亞洲獨特流行的AsiaI型已傳至歐洲的希臘、土爾其(2000年)和格魯吉亞(2001年)。豬的口蹄疫豬的口蹄疫人FMDFMD的易感動物種類多，而且重要經(jīng)濟畜種——豬、牛、羊都易感；FMDV基因組具有小RNA病毒準(zhǔn)種的特性，病毒變異性極強，有七個血清型，型間不能交叉免疫，免疫防控等于面對七種不同的傳染病。型內(nèi)不同病毒株間的遺傳變異可導(dǎo)致抗原差異，新變異株的出現(xiàn)，就會導(dǎo)致一次新的疫情流行；口蹄疫難以控制和根除的原因FMD病毒的感染性和致病力特別強。由于FMDV主要經(jīng)由吸入、攝入、損壞的上皮和治療途徑感染，感染動物能從多種途徑分泌/排泄出大量病毒，散布到環(huán)境中的病毒相對來說又有較強的抵抗力和存活力，而少量病毒就會引起易感動物感染。例如，牛只要吸入10個感染單位就可發(fā)病，而病畜的排毒量又特別大，病豬每天僅從呼吸道排出的病毒就高達108個感染單位。也就是說，一頭病豬一天呼出的病毒如全被牛吸入，可使1千萬頭牛發(fā)病。口蹄疫難以控制和根除的原因FMD有多種傳播方式和感染途徑，不但與感染動物(最頻繁的傳播方式)、污染的動物產(chǎn)品、人員、污染物及裝置的(直接或間接)接觸是FMD最主要的傳播途徑，還可通過氣溶膠經(jīng)空氣遠距離傳播，但并不常見，只有在適當(dāng)?shù)臍庀蠛偷乩項l件下，空氣向下風(fēng)方向的遠距離(幾十甚至上百公里)傳播才可能起著重要的作用；FMD的潛伏期短，發(fā)病急，動物感染病毒后最快十幾小時就可排毒發(fā)?。慌c其它動物病毒相比，動物機體對FMD病毒的免疫應(yīng)答程度較低。免疫注射動物，甚至發(fā)病后康復(fù)動物，再次受到同源病毒攻擊時有可能只保持臨床不再發(fā)病，但其免疫系統(tǒng)不能完全阻斷病毒感染。被FMD病毒感染過的反自動物或少數(shù)接種動物會成為不表現(xiàn)臨床癥狀(持續(xù)感染)或亞臨床感染(進一步傳播病毒的風(fēng)險很低)的帶毒動物。在不能屠宰所有發(fā)病和同群畜的情況下，帶毒動物就可能是一個潛在的、引發(fā)未來疫病暴發(fā)和在流行病學(xué)方面有重要意義的病毒傳染來源。病毒的特性發(fā)生改變，出現(xiàn)優(yōu)勢毒株

FMDV的7個血清型，抗原性各不相同，并且每一個單獨的血清型病毒都可以引起口蹄疫的暴發(fā)。研究顯示口蹄疫病毒的7個血清型在全世界并不是均勻分布，其中O型分布最廣，占76%，而居首位，也是引起口蹄疫暴發(fā)流行的主要血清型；

口蹄疫病毒有很強的變異性，在不斷流行與暴發(fā)中，

病毒也隨之發(fā)生不斷變異，

而在變異中病毒的遺傳特性和生物學(xué)特性必然也會發(fā)生一系列的改變。其中最顯著的改變就是病毒出現(xiàn)了對宿主異嗜性的變化。偶蹄動物對口蹄疫病毒都是易感的，但是在1997年3月臺灣暴發(fā)的口蹄疫卻只有豬發(fā)病且出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，而與豬接觸甚至人工感染的牛都不出現(xiàn)臨床癥狀；口蹄疫的流行特點

另外，2000年韓國暴發(fā)的口蹄疫也只有牛發(fā)病，而2002年再次暴發(fā)時卻主要為豬發(fā)病。病毒的這種宿主異嗜性的改變，給今后預(yù)防工作帶來很大的困難，那些不表現(xiàn)臨床癥狀的動物很可能是隱性感染，而成為今后暴發(fā)的傳染源。

O型病毒的泛亞株是一個新出現(xiàn)的具有較強的傳播能力和能力的病毒株。泛亞株的宿主范圍很廣，包括牛、水牛、綿羊、山羊、駱駝、鹿和羚羊等。該病毒的豬體適應(yīng)株與其他血清型共存?？谔阋卟《镜腣P1基因是突變率比較高的位點，而泛亞株卻相對穩(wěn)定，對11年中不同的泛亞毒株VP1基因的核苷酸序列進行的比較發(fā)現(xiàn)它們的差異不到5%。泛亞株對不同的動物在臨床上表現(xiàn)了不同的致病。在伊朗引起羔羊很高的致死率，在中國臺灣省和日本卻引起牛的亞臨床感染，在2001年英國流行中，對綿羊的感染較溫和的癥狀，給獸醫(yī)的診斷造成了很大的困難，延誤了疫情的控制而使病毒大量的擴散，形成了世界范圍的大流行，而且該毒株對豬的潛伏期可由通常的2～10d縮短至36h。泛亞株具有明顯的競爭優(yōu)勢，是造成2001年世界口蹄疫大流行的罪魁禍?zhǔn)祝o各國造成了不可估量的損失。因此泛亞株已經(jīng)成為目前世界口蹄疫的優(yōu)勢毒株。亞洲Ⅰ型口蹄疫是新傳入中國的急性、烈性傳染病，主要感染牛、豬、羊等偶蹄類動物，不屬人畜共患病，對人的健康和安全不會造成威脅。病毒傳播速度加快，造成的危害更大

口蹄疫病毒具有極高的傳染性，并且能通過空氣、旅行和食品等傳播。易感動物也可以通過多種方式感染病毒，如消化道、呼吸道等途徑。由于病毒的不斷的演化而出現(xiàn)的競爭優(yōu)勢毒株具備更強的入侵能力和更好的適應(yīng)環(huán)境變化的能力，能沖破國際防疫屏障，實現(xiàn)跨國傳播，造成范圍更廣的口蹄疫的暴發(fā)。

2000年3月韓國、日本相繼報道暴發(fā)口蹄疫，而僅1個月后，病毒就進入了俄羅斯、蒙古引發(fā)兩國的口蹄疫暴發(fā)。2001年2月英國暴發(fā)口蹄疫是1968年后的再次暴發(fā)，并且也是只經(jīng)過了1個月，病毒就擴散到了北愛爾蘭、愛爾蘭、法國和荷蘭等國家，造成了歐洲乃至整個世界口蹄疫的大暴發(fā)。

泛亞株較強的環(huán)境適應(yīng)性及入侵能力,能在很短的時間內(nèi)造成大范圍的流行，因此而造成的損失也是無法估計的。1997年臺灣暴發(fā)口蹄疫造成的經(jīng)濟損失約為136億元新臺幣，

而對外貿(mào)易的損失近1,000億新臺幣。2001年英國口蹄疫造成的損失是史無前例的，此次流行中僅在英國就宰殺了5920419頭動物，加上歐洲其他國家至少要有630萬頭的動物要被宰殺。這次口蹄疫的流行造成的直接經(jīng)濟損失有27億英鎊，另外由于此次口蹄疫也嚴(yán)重影響了英國旅游業(yè)，使英國減少了約25萬個就業(yè)的機會，從2001年2月到10月僅8個月的時間，英國的旅游業(yè)就損失了33億英鎊。據(jù)ULRBC(英國皇家商品公司)稱自2月份口蹄疫暴發(fā)至11月底，

他們共損失了約51億英鎊。另有人估計，這次流行給英國的間接損失可達200億英鎊，

這相當(dāng)于英國國內(nèi)生產(chǎn)總值(GDP)的215%。山東省泰安市岱岳區(qū)、江蘇省無錫市惠山區(qū)、新疆和布克賽爾縣和北京市延慶縣相繼發(fā)生四起亞洲I型口蹄疫疫情，4383頭病牛及同群牛已全部撲殺，疫情已得到有效控制。中國政府將對每只被捕殺的牛給予4000元到6000元人民幣的補償。非口蹄疫國家重新暴發(fā)口蹄疫

1991年歐盟開始對口蹄疫實施了不免疫政策，到1997年歐盟已經(jīng)無口蹄疫。2000年5月24日。OIE國際委員會通過了54個國家為非免疫無口蹄疫國家，其中歐洲就占了32個，美洲12個、

亞洲4個、大洋州4個、非洲2個。但由于口蹄疫是變異性很強的病毒，病毒突變株的廣泛存在以及感染宿主的廣泛性和環(huán)境因素的復(fù)雜性，使疫情的暴發(fā)往往不可預(yù)測并且難以控制。事實也證明，對口蹄疫來說，破壞力最大的時候就是在以前無病毒存在的區(qū)域或者是一個血清型進入一個新的地區(qū)的時候。1997年中國臺灣2000年韓國、日本以及2001年的英國的口蹄疫疫情就是變異株在原為無口蹄疫國家重新大規(guī)模暴發(fā)的最好例子。韓國和日本都是亞洲的島嶼國家，

對外來病毒的傳入有天然屏障的優(yōu)勢，

加上兩國都有嚴(yán)格的出入境檢疫政策，

因此在1908年(日本)、1933年(韓國)就已經(jīng)消滅了口蹄疫，使其成為了亞洲少有的無口蹄疫國家。但是2000年3月兩國都暴發(fā)嚴(yán)重的口蹄疫，蒙受了巨大的經(jīng)濟損失。而2001年英國的口蹄疫也開始流行，這是自1981年以來首次大暴發(fā)，據(jù)英國報道，此次流行懷疑可能是由英威爾特郡波頓鎮(zhèn)的一個實驗中心保存的一只盛有口蹄疫病毒的試管被人偷走而引起的，另外英國口蹄疫專家詹姆斯博士認(rèn)為，從病毒類型來判斷造成流行的疫源可能是由南非走私的肉制品而制成的豬飼料。目前市面上FMD疫苗在各血清型的交叉保護性很低。他們分別是由對抗FMDV的七種亞型：A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2及SAT3所制成的。這些疫苗皆是經(jīng)由幼倉鼠腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖而得的病毒液。這些疫苗所引起的免疫反應(yīng)都是針對特殊亞型，為了反映最新分離的野毒株，這些產(chǎn)品必須常常重新更新。此外，由于這些病毒很有可能會從生產(chǎn)工廠中流露出來和具有去活化不完全的危險，所以生產(chǎn)及使用不活化病毒疫苗都是具有危險性的。由于后者的危險性，接種疫苗的國家要出口牲畜及動物產(chǎn)品到口蹄疫非疫國是禁止的。受FMDV感染而恢復(fù)的豬有一年或至更久的免疫力，可保護他們避免受到同種病毒的感染，但并不是終身保護。目前口蹄疫疫苗應(yīng)用風(fēng)險利用目前的疫苗來控制口蹄疫有幾點困難：(1)FMDV具高度傳染性；(2)病毒抗原性具多樣性及變異性；(3)感染或接種疫苗后，免疫期短；(4)接種疫苗及自然感染動物的分辨。然而，目前不能只靠免疫計劃來清除口蹄疫。基于這個理由對于分辨非感染、接種疫苗、和自然感染的動物而言就相當(dāng)重要。由于長期應(yīng)用疫苗，在免疫選擇壓力的作用下，病毒變異速度加快。FMDV混合種(quasispecies)的存在，導(dǎo)致持續(xù)感染。認(rèn)為FMDV病毒種群不是由一種定義的分子種群組成的，而是由一種或幾種在基因組中占優(yōu)勢的少數(shù)顯性主序列(mastersequence)和一些不相同但相關(guān)的分子種群構(gòu)成的。Domingo認(rèn)為，從持續(xù)感染牛體分離的持續(xù)感染毒株的變異性可通過RNA基因組種群動態(tài)分布模型得到完美的解釋。即在機體內(nèi)每一個變異株都與其他的突變株競爭突變以達到在種群分布的優(yōu)勢地位。在長期的進化過程中，變異基因組受到宿主正向選擇壓力的影響，也受到一個或幾個感染顆粒從一種感染宿主傳播到另一種敏感宿主的隨機性的影響。這些突變的病毒株就可以逃避原毒株已誘生的體液和細(xì)胞免疫，導(dǎo)致病毒的持續(xù)性感染。宿主體液免疫和/或細(xì)胞免疫對病毒直接選擇可能導(dǎo)致病毒抗原變異。不科學(xué)免疫防控造成免疫選擇壓力——（免疫質(zhì)量不佳——密度不夠或群體抗體水平低下或不整齊——導(dǎo)致半免疫狀態(tài)——形成免疫壓力篩選——造成病毒變異）半免疫狀態(tài)：是指機體的抗體水平不足以徹底清除侵入的病原而與其呈一種動態(tài)平衡關(guān)系的狀態(tài)。造成上述狀態(tài)的主要原因有以下諸方面：■免疫時機不科學(xué)如無免疫監(jiān)測指導(dǎo)的免疫接種致疫苗毒中和原有處于保護界值以上較高水平的抗體；■疫苗選擇不當(dāng)或免疫方法不科學(xué)前者如FMD出現(xiàn)地方亞型株但擇苗時并非此型（苗不對型），后者如使用質(zhì)量沒保證的非法生產(chǎn)FMD疫苗或接種量不足或空注等。■免疫抑制性疫病的影響如CSFV、PRV等。■消毒和清潔衛(wèi)生管理不佳或缺乏造成飼養(yǎng)環(huán)境中病原密度過大（超過機體最大免疫抗病水平的承受能力）。此種狀態(tài)和臨界免疫狀態(tài)可形成一種強大的免疫壓力，致使病原發(fā)生以下變化：■組織嗜性或宿主群逐步變寬；■病原發(fā)生變異——出現(xiàn)亞型毒株；■病原毒力變強——出現(xiàn)所謂的超強毒株。從生物學(xué)的角度看，實質(zhì)上這是病原體與其宿主動物體兩者相互作用而逐漸選擇適應(yīng)的必然結(jié)果，是病原體適應(yīng)環(huán)境生存的一種進化表征?？谔阋吡餍卸局昱c疫苗毒株

的生物學(xué)特性口蹄疫病毒對細(xì)胞與實驗動物的適應(yīng)性

口蹄疫病毒可在牛舌上皮細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、牛胎皮膚-肌肉細(xì)胞以及豬和羊胎腎細(xì)胞、胎兔肺細(xì)胞、倉鼠腎細(xì)胞內(nèi)增殖，并常引起細(xì)胞病變（CPE），其中致豬腎細(xì)胞的CPE較牛腎細(xì)胞更明顯，犢牛甲狀腺細(xì)胞對口蹄疫病毒極為敏感，并產(chǎn)生極高效價的病毒。BHK-21細(xì)胞系和IB-RS-2細(xì)胞系亦被廣泛用于口蹄疫病毒的增殖。但口蹄疫病毒在細(xì)胞上的增殖能力在各毒株間存在很大差異。Nair在1987年比較了口蹄疫病毒AsiaI型的野外分離毒株Mukteswar，Bl、B2與制苗毒株AsiaI63/72在BHK-21細(xì)胞上的生長狀況、空斑大小、補體結(jié)合抗原滴度、病毒產(chǎn)生的CPE、抗原特性及免疫原性的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AsiaI63/72與Bl毒株能很好地適應(yīng)細(xì)胞，病毒穩(wěn)定地擴增，于接毒l0-l2h即可產(chǎn)生100%的CPE。用這2株病毒制成疫苗免疫6月齡以上的動物幾乎無不良反應(yīng)，免疫原性很好，而Mukteswar及B2對BHK-21細(xì)胞的適應(yīng)性不如AsiaI63/72和Bl毒株?？谔阋吡餍卸局昱c疫苗毒株是生物學(xué)特性近年來的研究認(rèn)為，口蹄疫病毒極其保守的RGD序列在病毒與細(xì)胞結(jié)合中起重要作用?？谔阋卟《九c敏感細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合后形成特異性吸附，而病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的G-H環(huán)上的RGD序列是病毒與細(xì)胞結(jié)合所必須的，但口蹄疫病毒侵染宿主細(xì)胞是個很復(fù)雜的過程，詳細(xì)機制仍在研究中。此外，Carillo等研究發(fā)現(xiàn)，口蹄疫病毒A-24毒株在體外抗體壓力下，獲得了與弱毒突變株相同的表型性狀，由此看來，弱毒株的突變在疫苗制造上是一個極大的潛在性危險。目前已有人將反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)應(yīng)用于檢測口蹄疫病毒RNA在體外條件下在牛皮膚郎罕氏細(xì)胞上的增殖，用該方法將有助于進一步了解口蹄疫病毒在組織培養(yǎng)細(xì)胞上的增殖?？傊《镜膹?fù)制與擴增取決于某個型的口蹄疫病毒在組織培養(yǎng)細(xì)胞上的適應(yīng)狀態(tài)，若病毒能很好地適應(yīng)該細(xì)胞就能很好地復(fù)制，反之則否。若病毒能很好地適應(yīng)細(xì)胞并大量擴增，用此病毒制造疫苗，就能獲得免疫原性好的保護性抗原，疫苗的免疫效果就會提高。血清學(xué)特性

應(yīng)用補體結(jié)合試驗、瓊脂擴散試驗、交叉保護試驗和ELISA可進行口蹄疫病毒型的鑒定；亞型的鑒定主要是根據(jù)各毒株間的血清學(xué)關(guān)系，按測出的關(guān)系值(r)或親緣值(R)區(qū)分型或亞型。鑒定亞型的目的主要是用于流行病學(xué)研究和尋找適合的疫苗毒株。一般認(rèn)為，區(qū)分亞型時主要應(yīng)考慮r值，且應(yīng)該與特定的參考毒株進行系統(tǒng)的比較。在無口蹄疫地區(qū)暴發(fā)口蹄疫或出現(xiàn)免疫預(yù)防失敗時，亞型的鑒定是確定該暴發(fā)是否是因為流行毒株出現(xiàn)新的抗原特性的依據(jù)。目前，雖然血清學(xué)分析測定R值比較繁鎖，而且花費時間長，但仍不失為一種經(jīng)典的方法。通過抗原捕獲RT-PCR鑒定口蹄疫病毒血清型，特異性好、靈敏度高、簡便快速。利用裝有型特異性抗體的微量離心管，從臨床材料中捕獲口蹄疫病毒，通過RT-PCR擴增病毒序列大大提高了口蹄疫病毒血清型鑒定及檢測的敏感性和特異性。隨著現(xiàn)代診斷技術(shù)的發(fā)展，將RT-PCR與核酸序列分析相結(jié)合的核酸序列分析方法在口蹄疫病毒研究中得到日益廣泛的應(yīng)用。從以上分析可以看出，欲成功地控制或撲滅某次疫情，必須了解其疫源，而僅僅在型或亞型水平上的判斷是不夠的。核苷酸序列分析可發(fā)現(xiàn)存在于基因水平而不引起氨基酸改變的微小差異，從而更清楚地揭示流行的起源和過程，防止疫情再次暴發(fā)。分子生物學(xué)特性*毒株的抗原結(jié)構(gòu)：口蹄疫病毒由1分子的單股正鏈RNA和60個亞單位的4種蛋白質(zhì)VP1－VP4組成，VP1具有免疫活性，與146S完整病毒顆粒相比，大多數(shù)VP1制劑的免疫活性都較低。對口蹄疫病毒免疫原性肽抗原位點的預(yù)測揭示，136一160位氨基酸的肽段具有抗原活性，141－160肽段的免疫活性最強，其它肽段的活性僅有該肽的1％左右。VP1蛋白的2個序列，141－l60和200－213能激發(fā)中和抗體應(yīng)答，雖然2種抗肽血清對146S完整病毒粒子有相似的ELlSA效價，但抗141－160血清的中和活性比抗200－213血清的高100倍。*口蹄疫病毒的變異：口蹄疫病毒的變異是由于VP1蛋白上主要免疫原性的氨基酸被替代，分析該高變區(qū)不僅對口蹄疫病毒遺傳變異的研究有指導(dǎo)意義，而且對口蹄疫的流行病學(xué)研究以及新型疫苗的研制也很重要。口蹄疫病毒A22亞型是定期用作疫苗毒株的4種流行毒株之一，有特殊的抗原結(jié)構(gòu)，其抗原性與其他疫苗毒株及其它A型毒株相差很大。體內(nèi)和體外試驗研究了A22亞型VP1蛋白的多肽結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Pa1m-135-158-GAA-170-198(ACM)多肽能誘發(fā)有效的抗病毒保護。該多肽也包括了B細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原表位。此外，該多肽結(jié)構(gòu)不僅包括口蹄疫病毒的VP1蛋白135－138的主要抗原位點，而且也包括在VP1序列170－180之間的病毒特異的T細(xì)胞輔助表位，該結(jié)構(gòu)比以前描述過的Palm(2)135－159短肽具有更好的抗病毒保護性、免疫原性和T細(xì)胞增殖反應(yīng)性。170一180位作為病毒特異的T細(xì)胞表位，負(fù)責(zé)增強該多肽的免疫原性。目前，抗原位點研究較多的是O、C和A型，其中研究最深入的是O型抗原位點，其它各型口蹄疫病毒抗原位點的報道較少。O型口蹄疫病毒至少有5個中和性抗原位點，其中有3個位于VP1上。特別是抗原位點1，它由VP1的G-H環(huán)(141－l60位殘基)和C端200-213位殘基組成。VP1的這2個區(qū)域在決定病毒的抗原性和免疫原性方面起主要作用，故抗原位點1是口蹄疫病毒最重要的抗原位點。另外VP1作為主要的免疫原性蛋白，集中了大多數(shù)的病毒中和抗原位點。還有一些形態(tài)表位位于結(jié)構(gòu)蛋白VP2和VP3上。

Sanyal等應(yīng)用單克隆抗體中和逃逸突變株，確定口蹄疫病毒AsiaIInd63/72株病毒表面至少有4個獨立的胰酶敏感中和抗原位點，第1位點由4個不同的抗原表位組成，另外還發(fā)現(xiàn)有構(gòu)象依賴性中和抗原位點的存在。*抗原變異：口蹄疫病毒在復(fù)制過程中，可以導(dǎo)致主要表面抗原的變異，而且在地方性流行時，病毒主要表面抗原的變異是最重要因素之一?？谔阋卟《竞怂嶙儺惖念l率相當(dāng)高，流行前期的毒株與流行后期甚至中期的毒株可能就有差別。實際上口蹄疫病毒的血清型就是一個連續(xù)的抗原變異譜?，F(xiàn)已證實，口蹄疫病毒抗原表位的氨基酸差異是造成抗原性改變的原因。Reddy等測定了口蹄疫病毒AsiaIInd63/72亞型編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列，比較了AsiaI印度毒株與AsiaI以色列毒株的核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)核苷酸變異程度(14%)明顯大于氨基酸變異(10%)的程度。核苷酸變異主要在三聯(lián)體密碼子的第3位堿基上，而且基本上都是同義突變；氨基酸的變異最明顯的是發(fā)生在構(gòu)成抗原位點1的G-H環(huán)內(nèi)，其中結(jié)構(gòu)蛋白VP1氨基酸變異程度最高，其次是VP2，VP3、VP4變異程度最小。Martenez等對許多流行毒株進行分析，認(rèn)為VP1138一140和148一150兩段氨基酸變化對抗原有漸變性影響，而某些位置上氨基酸的變異造成抗原性的突變，完全改變毒株的生物學(xué)特性。已發(fā)現(xiàn)感染期間的抗原變異是持續(xù)性感染病毒逃逸宿主反應(yīng)的機制之一。Parry等報道，O型口蹄疫病毒VP1第148位氨基酸由亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸(L→S)，其合成肽(VP1141一l60)免疫的豚鼠能同時抵抗A型、O型口蹄疫病毒的攻擊，C1型口蹄疫病毒VP1第139位氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)為異亮氨酸，使病毒轉(zhuǎn)變?yōu)镃3型特異性。Carillo等，Rieder等將口蹄疫病毒A24Cruzeiro、Ol

Casoros的克隆株與亞中和劑量的抗病毒多克隆血清在繼代單層牛胎腎細(xì)胞上傳至一定代數(shù)后，發(fā)現(xiàn)該克隆株的結(jié)構(gòu)蛋白VP1電泳遷移率改變，對小鼠的致病性降低。口蹄疫病毒毒株在體外抗體壓力下，獲得了與弱毒突變株相同的表型標(biāo)志。此外，研究發(fā)現(xiàn)，如無抗病毒多克隆血清的壓力選擇，變異將不發(fā)生，即使經(jīng)過29代增殖，編碼VP1的RNA序列仍保持遺傳穩(wěn)定性。Holguin等的研究表明，在缺乏免疫壓力的情況下，口蹄疫病毒和其它病毒的抗原變異仍發(fā)生，不論免疫壓力是否存在，氨基酸代換都會在VP1的2個高變區(qū)發(fā)生。故宿主的抗體壓力選擇在口蹄疫病毒的高度變異中的作用仍有待于進一步研究。＊遺傳系譜樹

許多研究者試圖應(yīng)用RT-PCR與核酸序列測定技術(shù)進行口蹄疫病毒的VP1基因核酸序列的同源性比較。通過同源性比較分析某一地區(qū)流行毒株與疫苗毒株的親緣關(guān)系，建立該地區(qū)具有代表性毒株的系統(tǒng)發(fā)生樹，從樹狀圖中可以直觀地了解該地區(qū)口蹄疫流行的毒株譜系、分子流行病學(xué)及病毒演化的規(guī)律。

Juan等從24株病毒VP1的核酸序列推導(dǎo)出O型口蹄疫病毒的遺傳系譜樹，樹中包括4個譜系，其中3個與地理位置有關(guān)。從樹狀圖中可以看出，大范圍的疫苗接種可能改變了口蹄疫病毒的進化方式。Samuel等應(yīng)用VP1基因核酸序列分析方法對1983一1995年沙特阿拉伯分離的68株口蹄疫病毒O型毒株進行了分子水平檢測。還比較了14株中東流行毒株(1987一1991)、4株疫苗毒株，其中3株是中東疫苗毒株，1株是歐洲分離株。結(jié)果在每一亞譜系中都能看出疫苗毒株與流行毒株的親緣關(guān)系。這為疫苗毒株可能引起疫病流行提供了又一證據(jù)。

最近，Pattnaik等應(yīng)用VP1基因3'端165個核苷酸序列分析方法，從1987一1995年印度分離的25個流行毒株與印度當(dāng)前使用的疫苗毒株R2/72推導(dǎo)出O型口蹄疫病毒系統(tǒng)樹。該研究表明在印度散播并引起口蹄疫暴發(fā)的O型毒株遺傳變異，但在VP1多肽的主要免疫位點是相關(guān)的，表明該國每一個地區(qū)有一種以上遺傳性不同的毒株群存在。＊追蹤口蹄疫暴發(fā)的疫源

選擇口蹄疫疫苗毒株，不能僅僅由1次口蹄疫暴發(fā)而定，而是要進行大范圍流行病學(xué)和免疫學(xué)調(diào)查。要對大量的田間分離毒株進行研究，選擇抗原譜廣、免疫原性好的毒株用于制造疫苗。

盡管人們認(rèn)為AsiaI只在中東流行，但最近的研究表明，該型毒株還與O型口蹄疫病毒混合感染。woodbury等分析在沙特阿拉伯分離的口蹄疫病毒O型空斑純化物，證明該次口蹄疫的暴發(fā)是源于混合感染。用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)1985一1991年收集的31份樣品中有16份含AsiaI病毒，對AsiaI型病毒株核酸序列分析表明，它們與俄羅斯兔化弱毒疫苗株AsiaI/Tadzhi/Risran/84和土耳其株AsiaI/TUR/15/73有很近的親緣關(guān)系，故認(rèn)為當(dāng)?shù)乜谔阋叩牧餍锌赡苁菑膰鈧魅氲亩局昊旌细腥疽鸬摹?/p>

研究發(fā)現(xiàn)，口蹄疫病毒在傳代過程中具有高度易變的特性，同一分離株在不同的實驗室經(jīng)若干年傳代，其后代在系譜樹中屬不同的亞譜系，故極難分離到某一性狀長期保持不變的口蹄疫病毒。因此，口蹄疫病毒的研究還任重道遠。我們相信，通過口蹄疫病毒分子生物學(xué)的研究，將會有較大的進展和突破。消滅口蹄疫面臨的艱巨任務(wù)疫源難以根除FMDV感染的動物譜太廣，且長期帶毒排毒，病毒在體內(nèi)存活數(shù)月、數(shù)年或終生，并在群體中能世代傳遞。大量的隱性感染動物和廣泛的疫源地，大量的帶毒的、被保護的野生動物形成的自然疫源地等等。傳播媒介難以切斷。FMDV的復(fù)雜性FMDV有O、A、C、AsiaI、SAT1、SAT2、SAT3七個血清型和70多個亞型。各血清型具有不同的抗原性，且不能交叉免疫，在毒力和抗原性方面特別容易發(fā)生變異。檢測技術(shù)近年來，國外已應(yīng)用ELISA、PCR技術(shù)檢測FMDV。但現(xiàn)有的方法都不能滿足快速檢測及時調(diào)運的要求。也不能快速準(zhǔn)確地進行疫源追蹤、抗體檢測以及疫情預(yù)測預(yù)報。因此，需要研究建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的新的診斷、監(jiān)測方法?；疽蠡疽笫恰霸?、快、嚴(yán)、小”四個字。意指盡早發(fā)現(xiàn)疫情，快速采取措施，嚴(yán)格封鎖疫點，將損失降低到最小程度。這四點基本要求應(yīng)貫穿整個FMD預(yù)防、控制和消滅過程中?；敬胧?/p>

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病畜及感染動物的撲殺撲殺病畜及感染動物的目的是消除傳染源。病畜是最重要的傳染源，其次是非持續(xù)性感染的隱性帶毒動物，最后是牛羊等持續(xù)性感染的帶毒動物。因此根據(jù)防疫的實際情況，撲殺動物的次序依次是:病畜、病畜的同群畜、疫區(qū)所有易感動物、其他地區(qū)的持續(xù)感染動物及其同群畜?？谔阋叩膿錅绮呗曰旧峡梢苑譃榉且邍?FMDfreecountry)爆發(fā)疫情時的緊急撲滅策略與口蹄疫常在國的長期撲滅策略兩種。非疫國爆發(fā)口蹄疫疫情：緊急撲滅策略又可分為包括撲殺清場、撲殺清場加環(huán)帶免疫及全面免疫三種策略，各國可依爆發(fā)疫情初期發(fā)病場數(shù)的多寡、疫情調(diào)查與通報系統(tǒng)的效率、動物種群密度分布、管制動物移動的能力、有無疫苗或抗原銀行(Antigenbank)的儲備、政府財政能力的強弱等因素來評估選擇最合適的撲滅策略?？谔阋叱Ｔ趪翰捎萌婷庖呋騽澐忠邊^(qū)的策略。全面免疫策略一般先在全國實行所有偶蹄類動物的強制免疫，在臨床病例消失后按世界動物衛(wèi)生組織的規(guī)范，逐步變?yōu)槭褂靡呙绲姆且邍安皇褂靡呙绲姆且邍?。劃分疫區(qū)的策略即在國內(nèi)進行疫區(qū)與非疫區(qū)的劃分，疫區(qū)采行全面免疫、非疫區(qū)則不使用疫苗，再循序漸進將疫區(qū)變?yōu)榉且邊^(qū)來執(zhí)行全國的撲滅計劃。非疫區(qū)的劃定主要取決于地理環(huán)境、行政區(qū)域與動物族群的分布等因素。

*免疫接種。疫苗接種是防治戰(zhàn)略的一個重要組成部分，通過提高國家整體畜群的免疫水平，可降低FMD暴發(fā)的影響和流行范圍。免疫接種的目的是保護易感動物。根據(jù)現(xiàn)行FMD疫苗的免疫效力，注射密度達到85%就能起到阻止流行的作用。疫苗接種分為常年計劃免疫和疫點周圍的環(huán)狀免疫。實施免疫接種應(yīng)根據(jù)疫情、疫苗種類和防治政策選擇免疫方式、接種劑量和次數(shù)。但單獨的疫苗接種不能最終消滅FMD。*控制動物、動物產(chǎn)品及其他染毒物移動。此項措施的目的是切斷傳播途徑。疫區(qū)帶毒動物及其產(chǎn)品向非疫區(qū)流動是FMD傳播的最主要途徑，是各種防治政策中不可缺少的措施。*強制提高動物衛(wèi)生措施，徹底清除疫源。動物衛(wèi)生措施主要是染毒區(qū)的清潔消毒，此外，還包括關(guān)閉限制區(qū)內(nèi)市場，關(guān)閉屠宰廠或改善其衛(wèi)生條件，強制提高奶罐、乳品廠、肉食廠和屠宰廠的消毒水平，以利于來自限制區(qū)的動物產(chǎn)品的衛(wèi)生控制。為預(yù)防畜群與毗鄰的潛在感染的