免疫學及免疫學檢驗REVIEWQUESTION

Thespecificityofthereactionofantigenwithantibodyisusuallyhighlydependentupon

1)molecularweightoftheantigen2)chargeoftheantibody3)immunoglobulinisotype4)conformationofthereactants免疫學及免疫學檢驗沉淀反應（precipitationreaction)毛旭虎醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室二OO六年二月免疫學及免疫學檢驗可溶性抗原+相應抗體

肉眼可見的沉淀免疫學及免疫學檢驗1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)液（毒素）與相應抗血清混合出現(xiàn)沉淀1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其中，發(fā)現(xiàn)沉淀反應可在凝膠中進行1946年Oudin報告了試管免疫擴散技術1965年Mancini提出單向免疫擴散技術，使定性免疫試驗向定量化發(fā)展免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉淀反應達到快速、微量、自動化的新階段。免疫學及免疫學檢驗根據沉淀反應的介質和檢測方法的不同,沉淀反應可分為:液相內的沉淀反應凝膠內的沉淀反應免疫學及免疫學檢驗第一節(jié)液體內沉淀試驗根據沉淀現(xiàn)象的不同，液體內沉淀又可分為三類：絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀免疫學及免疫學檢驗一、絮狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗是一項經典實驗技術。曾用于測定梅毒抗體的Kahn試驗是絮狀沉淀的代表試驗，現(xiàn)今已被更簡便而敏感的USR或RPR方法替代。免疫學及免疫學檢驗(一)原理抗原溶液與相應抗體溶液混合，在電解質存在的條件下，抗原與抗體結合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。絮狀沉淀易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測定的基本方法。免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。免疫學及免疫學檢驗免疫學及免疫學檢驗2.抗體稀釋法

本法采用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應，出現(xiàn)沉淀物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結合，可一次完成抗原和抗體的滴定并找出抗原、抗體的最適比。免疫學及免疫學檢驗(三)方法評價

絮狀沉淀試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測定抗原抗體反應的最適比。免疫學及免疫學檢驗二、環(huán)狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀(ringprecipitation)試驗是由Ascoli于1902年建立的一種經典的血清學定性試驗。用非常簡便的技術了解待測血清內是否存在某種抗原或抗體。免疫學及免疫學檢驗(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗體溶液的細試管液面上。當對應的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環(huán)。免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管(內徑約1.5~2mm)底部，避免產生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。3.置沉淀管于室溫下使其反應，1~5min內在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。

免疫學及免疫學檢驗(三)方法評價

該試驗是經典的血清學反應之一，簡便、快速、實用。故用于鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗)。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對含有多個抗原抗體對的反應系統(tǒng)缺乏分辨力。方法難以推廣。

免疫學及免疫學檢驗三、免疫濁度試驗經典的免疫沉淀試驗是抗原和相應抗體在反應終點時判定結果，方法存在耗時、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動化等缺點。70年代以來，根據抗原和抗體所在液相內快速結合并產生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動化分析儀器來完成。免疫學及免疫學檢驗(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復合物(IC)，當光線透過反應溶液時，由于溶液內復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線，可測出待檢抗原含量。免疫學及免疫學檢驗2.操作步驟(1)用稀釋緩沖液將待檢樣品和標準品按規(guī)定稀釋，取一定量加至測定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預先滴定)的抗體，孵育一定時間，測定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標準曲線。從標準曲線可得待檢抗原量。免疫學及免疫學檢驗3.方法評價

敏感度高于單相瓊脂擴散試驗5~10倍，批內、批間重復性較好，變異系數<10%，操作簡便快速，1h可報告結果。免疫學及免疫學檢驗(二)散射比濁法散射光系指一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復合物，光線被折射，發(fā)生偏轉，這種偏轉的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強度與復合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成復合物越多，散射光強度越強。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點散射比濁法(endpointnephelometry)。免疫學及免疫學檢驗1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結合動態(tài)測定法。所謂速率是抗原抗體結合反應過程中，在單位時間內兩者結合的速度。速率法是測定最大反應速率，即在抗原抗體反應達最高峰時，通常為數十秒鐘，測定其復合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。免疫學及免疫學檢驗(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標準品加至試管內，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標準品含量為橫坐標，RU值為縱坐標，于普通坐標紙上繪制標準曲線。根據待測抗原RU值，查出相應抗原含量。免疫學及免疫學檢驗(3)方法評價：

檢測不必等到抗原抗體反應達到平衡，大大節(jié)約反應時間，每小時可檢測數十份標本；敏感度高，最小檢出量達μg/L水平。免疫學及免疫學檢驗2.終點散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時間，使其反應達到平衡后，測定其復合物的量。復合物的濁度不再受時間的影響，但反應復合物聚合產生絮狀沉淀之前(大約反應數十分鐘)進行濁度測定。免疫學及免疫學檢驗(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標準品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標準品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時間，比濁。3)以抗原標準品量為橫坐標，濁度值為縱坐標，繪制標準曲線。根據待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。免疫學及免疫學檢驗(3)方法評價：

敏感度達mg/L水平，可自動化，但反應時間較長免疫學及免疫學檢驗(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應抗原時，則發(fā)生凝集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。免疫學及免疫學檢驗2.操作步驟1)用稀釋液將待測抗原和抗原標準品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測抗原、不同濃度的抗原標準品反應一段時間，測吸光度值。3)以抗原標準品量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，查出待測抗原量。免疫學及免疫學檢驗3.方法評價

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應液中無PEG沉淀劑的影響，個體IC對結果影響也小，所以結果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

免疫學及免疫學檢驗第二節(jié)凝膠內沉淀試驗凝膠內沉淀試驗(gelphaseprecipitation)主要是指瓊脂糖擴散或稱凝膠擴散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。根據實驗目的與方法不同，可將固相內沉淀驗分為3類：①雙相瓊脂擴散試驗(doublegeldiffusiontest)，②單相瓊脂擴散試驗(singlegeldiffusiontest)，③凝膠免疫電泳(gelimmuno-electrophoresis)。這是一項凝膠內電泳加擴散技術，專門一章介紹。免疫學及免疫學檢驗一、單相瓊脂擴散試驗(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質在凝膠中自由擴散，與抗體結合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關。免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.將抗體和0.9%瓊脂糖50~56℃混合，即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔，孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標準品溶液。3.置37℃，讓其向四周自由擴散，24~48h后可見其孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。免疫學及免疫學檢驗單向免疫擴散試驗示意圖

免疫學及免疫學檢驗

免疫學及免疫學檢驗沉淀環(huán)的直徑與待檢標本內含量不是直線關系，有兩種計算方法：(1)Mancini曲線：適用于大分子抗原，擴散時間>48h，使用普通坐標紙作圖，擴散環(huán)直徑平方和濃度呈線性關系。(2)Fehcy曲線：適用于較小分子抗原，擴散時間較短，使用半對數坐標紙作圖，抗原量的對數和擴散圈直徑之間呈線性關系。免疫學及免疫學檢驗

(三)方法評價

單向瓊脂擴散試驗是一種穩(wěn)定、簡便、毋需特殊設備，一般實驗室均可使用的常規(guī)方法，試驗的重復性和線性均好。敏感度為1.25mg/L。

免疫學及免疫學檢驗(四)影響因素1.抗原分子量抗原分子量大，擴散慢，沉淀環(huán)較??；抗原分子量小，擴散快，沉淀環(huán)相對較大。要求待檢血清和抗原標準品在血清學上具有均一性，否則可能出現(xiàn)結果偏高或偏低。

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2.抗體種類

實驗證明兔抗血清優(yōu)于馬、羊抗血清，兔抗血清可測抗原0.1~1IU/ml，馬抗血清為1~10IU/ml，羊為0.4~4IU/ml，為提高實驗敏感度，應首選敏感度高的抗血清。免疫學及免疫學檢驗

3.抗體稀釋度

抗體濃度大，沉淀環(huán)小，則敏感度低；抗體濃度小，沉淀環(huán)增大，不同濃度抗原間的差別較顯著，敏感度高。但沉淀環(huán)過大，常造成邊緣糊不清，致使測量誤差也增大。因此要求在沉淀環(huán)清晰的基礎上加大稀釋度以提高敏感度。下圖為抗體分別以1:25、1:50、1:75、1:100稀釋，所形成的4條標準曲線。

免疫學及免疫學檢驗

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4.擴散時間

抗原達到擴散終點后，其沉淀環(huán)直徑才與抗原含量呈一定關系?？乖吭礁?，達到一定關系所用擴散時間越長。免疫學及免疫學檢驗5.擴散溫度

在4~37℃范圍內，提高溫度加快擴散速度，縮短反應時間。但有的沉淀環(huán)僅在低溫下形成，溫度高反而消失。在同一次試驗的孵育過程中，要防止溫度急劇變化，以免出現(xiàn)雙圈。6.瓊脂板厚度

瓊脂板厚度增加，沉淀環(huán)面積相應縮小。

免疫學及免疫學檢驗二、雙相瓊脂擴散試驗(一)原理將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成可見的白色沉淀線。沉淀線的特征與抗原抗體的濃度、純度和擴散速率等有關。免疫學及免疫學檢驗

(二)操作步驟1.融化瓊脂，澆板每張載玻片約4ml。2.凝固，打孔孔徑3mm，孔間距3~5mm，孔型有雙孔型、三角孔型、雙排孔型和梅花孔型。3.加樣在相對孔內加抗原或抗體。4.孵育使抗原抗體自由擴散，在兩孔之間抗原抗體相遇，在比例適時形成可見的沉淀線。沉淀線的數目、形態(tài)和位置與抗原和抗體的純度、濃度和擴散速度有關。免疫學及免疫學檢驗(三)雙相瓊脂擴散試驗的應用1.檢測未知抗原或抗體