金櫻子對大鼠糖尿病性白內(nèi)障細胞凋亡和氧化應激的影響周俊;何湘珍;肖啟國;彭輝燦;王俞方;李潔【摘要】目的探討金櫻子對糖尿病大鼠晶狀體上皮細胞凋亡的作用及氧化應激機Strepto-zotocinSTZSDSprague-Dawley)大鼠糖尿病模型，然后將其隨機分為糖尿病模型組及金櫻子干預組，另設(shè)正常對照組。12TACSODMDA)含量。采用流式細胞術(shù)檢測大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率。結(jié)果金櫻子能顯著降低糖尿病大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率(P<0.05)。金櫻子能顯著降低糖尿MDATACSOD(P<0.05)。結(jié)論金櫻子能抑制晶狀體上皮細胞凋亡和氧化應激，延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)展。%ObjectiveToinvestigatethemechanismofthestressofRosalaevigataonapoptosisindiabeticratslensepithelialcellsandtheroleofoxidation.MethodsSD(Sprague-Dawley)modelofdiabeticratswasestablishedusingStreptozotocin(STZ)intraperitonealinjection,andthenrandomlydividedintointodiabeticmodelgroupandinterventiongroupofRosalaevigata.Atthesametime,theexperimentalcontrolgroupwasset.After12weeks,theratsweresacrificed,andtheirtotalantioxidantcapacityassaylenstissues(TAC),superoxidedismutase(SOD)activityandmalondialdehyde(MDA)contentweremeasured.Lensepithelialcellapoptosiswasdetectedbyflowcytometry.ResultsRosalaevigatacouldsignificantlydecreasetheapoptosisoflensepithelialcellsofdiabeticratrate(P<0.05).Rosalaevigatasignificantlydecreasedthebloodglucose,bloodlipidandMDAindiabeticrats,andimprovedTACandSODactivity(P<0.05).【期刊名稱】《中南醫(yī)學科學雜志》【年(卷),期】2014(000)003【總頁數(shù)】5頁(P241-245)【關(guān)鍵詞】金櫻子;糖尿病性白內(nèi)障;氧化應激;凋亡【作者】周俊;何湘珍;肖啟國;彭輝燦;王俞方;李潔【作者單位】421001;南華大學附屬第二421001421001;南421001;南華大學附屬第二醫(yī)院眼科，湖南421001421001【正文語種】中文【中圖分類】R776.1目前,糖尿病已成為嚴重影響人類健康的常見疾病之一,全球糖尿病患者約為3.70億,1β2降低肝臟,心臟脂肪沉積,調(diào)節(jié)血糖,具有顯著的抗氧化和抗炎作用[3],可以在一定程度上延緩大鼠糖尿病腎臟功能的損害[4]。該課題通過研究金櫻子對大鼠糖尿病性白內(nèi)障細胞凋亡和氧化應激的影響,探討糖尿病性白內(nèi)障的防治新途徑。材料與方法試劑與大鼠金櫻子從衡陽中藥材公司購買;STZ、碘化丙啶從美國Sigma公司購買;膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑盒從美國BD公司購買;丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒和總抗氧化能力檢測試劑盒(TAC)從南京建成生物工程研究所購買;其余試劑均從上海生物工程有限公司購買。SpragueDawley(SD)大鼠從南華大學實驗動物部購買,大鼠重量為250±5g,經(jīng)散瞳實驗檢查顯示晶狀體均正常透明。方法60SDmg/kg),72h14mmoL/L模型建立成功,然后將成模的大鼠再隨機分為糖尿病模型組和金櫻子干預組,每組各30SD30400mg/kg812100.01g/L)10h1h,麻醉大鼠,取腹主動脈血,離心分離血清,檢測血糖、血脂水平用半自動生化分析儀。115min4TOPCONSL-2G[5]5明;Ⅱ級:輕度混濁,周邊部分晶體皮質(zhì)開始出現(xiàn)空泡樣改變;Ⅲ級:中度混濁,周邊部的空泡樣改變開始向中央發(fā)展,晶體核開始出現(xiàn)少量的霧樣混濁;Ⅳ級:重度混濁,晶體的空泡樣改變范圍繼續(xù)擴大并向晶體核區(qū)蔓延,出現(xiàn)嚴重的霧狀混濁;Ⅴ級:晶體皮質(zhì)及核全部混濁。,0.9%氯化鈉注射液沖洗后稱重,然后將晶狀體組織勻漿,低溫離心,取上清液,參照試劑盒說明書,分光光TAC、MDASOD3001000r/min5min,PBS21×109/L1×結(jié)合緩沖液、AnnexinV-FITC5μLPI10μL,15min,PBSnm)檢測細胞凋亡率。統(tǒng)計學分析3SPSS13.0HqP＜0.05結(jié)果糖尿病大鼠的一般情況STZ11,P＜0.05),一般情況明顯好于糖尿病模型組。12常對照組和金櫻子干預組(P＜0.05)。表1不同時間各組大鼠的體重變化(g,n=10)與正常對照組比較,a:P＜0.05;與糖尿病模型組比較,b:P＜0.05正常對照組323.11±2.82390.83±2.18464.01±2.47糖尿病模型組223.81±2.31a190.02±2.39a151.90±2.38a金櫻子干預組304.00±2.57b370.49±2.32b412.99±2.17b血糖與血脂正常對照組大鼠血糖值一直正常。用STZ誘發(fā)后3天,60只大鼠血糖均＞14mmol/L,與注射前相比血糖明顯升高(P＜0.05)。誘發(fā)4周后,金櫻子干預組大鼠血糖與血脂明顯下降,而糖尿病模型組血糖與血脂繼續(xù)上升(P＜0.05);至12周時,金櫻子干預組大鼠血糖與血脂較糖尿病模型組大鼠明顯降低(表2,P＜0.05)。表2各組大鼠FBG、TC、TG的變化(mmol/L,n=10)與正常對照組比較,a:P＜0.05;與糖尿病模型組比較,b:P＜0.05正常對照組4.12±1.091.68±0.531.12±0.43糖尿病模型組25.02±2.27a5.10±0.45a3.67±0.32a金櫻子干預組5.62±1.25b3.25±0.36b2.36±0.50b晶狀體混濁程度4～12STZ4121,P＜0.05)。圖1晶體混濁程度分級(Ⅰ～Ⅴ級)A:Ⅰ級;B:Ⅱ級;C:Ⅲ級;D:Ⅳ級;E:Ⅴ級TAC、SODMDA與正常對照組比較,糖尿病模型組大鼠晶狀體組織MDA含量顯著增加,TAC和SOD活性則顯著降低(表3,P＜0.05);經(jīng)金櫻子處理后,不但顯著降低了晶狀體組織的MDA含量,而且明顯增強了TAC和SOD的活性(見表3,P＜0.05)。說明金櫻子能夠降低脂質(zhì)過氧化物,提高晶狀體組織抗氧化酶活性,提高總抗氧化力,從而降低晶狀體的氧化應激反應的影響,延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。表3第12周時各組晶狀體組織中TAC、SOD活性和MDA含量(n=20)與正常對照組比較,a:P＜0.05;與糖尿病模型組比較,b:P＜0.05正常對照組1.12±0.21197.23±3.264.19±0.12糖尿病模型組4.22±0.56a125.15±1.54a1.34±0.16a金櫻子干預組2.53±0.24b168.45±2.15b3.18±0.06b細胞凋亡率4周、8周和12周時糖尿病模型組細胞凋亡率均顯著高于正常對照組(見表4,P＜0.05);金櫻子干預組細胞凋亡率較糖尿病模型組顯著降低(見表4,P＜0.05)。4LECs(%,n=20)與正常對照組比較,a:P＜0.05;與糖尿病模型組比較,b:P＜0.052.56±0.362.84±0.343.12±0.4516.10±0.84a23.45±1.08a5.21±0.65b7.56±1.12b9.76±1.52b3討論糖尿病性白內(nèi)障是多種因素綜合作用的結(jié)果,其經(jīng)典發(fā)病機制包括氧化應激學說、滲透壓學說以及晶體蛋白的非酶糖基化學說,在各種導致白內(nèi)障的病因中都有一個相同的途徑即由自由基介導的氧化應激[6]。生理條件下,晶狀體有兩類自由基防御系統(tǒng):酶防御系統(tǒng)(超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及其同工酶CuZnSOD等);另一個是非酶防御系統(tǒng)(維生素C、E和巰基化合物等,它的主要功能是保護晶狀體蛋白巰基功能、減少H2O2和其他氧化物生成[7])。主要用于清除自由基、維持細胞和機體的正常生理功能?？寡趸烙琳鲜芎芏嘁蛩氐挠绊?一旦受損可以導致谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸,維生素C和E等的含量減少,抗氧化酶(GSH-PX、CAT、SOD)活力降低,使晶體O2-、OH-、H2O2等自由基清除率降低或生成量增加,使晶狀體的上皮細胞和纖維細胞發(fā)生凋亡,蛋白質(zhì)和脂質(zhì)發(fā)生過氧化最終導致白內(nèi)障的形成[8]。超氧化物歧化酶是晶狀體內(nèi)抗氧化的關(guān)鍵物質(zhì),現(xiàn)已證實:糖尿病發(fā)生時,當SOD、CAT、GSH-PX活力明顯降低時有大量OH-、O2-和H2O2等活性氧自由基產(chǎn)生,其源自葡萄糖與蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化作用后葡萄糖的自氧化過程,因此,有學者認為自由基引起的過度的氧化應激反應是引發(fā)糖尿病性白內(nèi)障的主要原因[9]。TAC1000產(chǎn)生氧化應激反應所生成的產(chǎn)物,且具有細胞毒性,通常用來評價機體氧化應激水平,因此,MDA晶狀體上皮細胞在晶狀體透明性的保護方面有著非比尋常的意義,當晶狀體上皮細胞凋亡達到一定的數(shù)量,細胞增生和凋亡失衡導致晶狀體混濁的發(fā)生,國內(nèi)外學者較為一致的觀點是晶狀體上皮細胞的凋亡是年齡相關(guān)性白內(nèi)障、代謝性白內(nèi)障以及外傷性白內(nèi)障等形成的細胞學基礎(chǔ)[10]。已有研究顯示,在高血糖的環(huán)境下,晶狀體內(nèi)環(huán)境代謝失衡,高糖產(chǎn)生的氧化應激、高滲透壓等損害因子會增加更快,破壞晶狀體的穩(wěn)定,攻擊晶狀體上皮細胞,破壞晶狀體上皮細胞增生和凋亡的平衡,使晶狀體上皮細胞加速凋亡,最終導致白內(nèi)障[11]。中草藥金櫻子(RosaLaevigataMickx)屬薔薇科薔薇屬的常綠蔓性灌木,其果實中富含幾十種生理活性物質(zhì)[12],如維生素、氨基酸、多糖、黃酮類、三萜類等。已有研究發(fā)現(xiàn)金櫻子除了可以大幅降低血清膽固醇、甘油三脂和β脂蛋白,還能消炎,保肝護腎,固本培元,止尿及抗衰老,金櫻子中的多糖類和黃酮類化合物能明顯清除肝腎等組織中OH-、O2-等超氧自由基,有明顯的抗氧化和抑制細胞凋亡的作用[13-14]。目前,金櫻子對糖尿病性白內(nèi)障是否具有防治作用尚無研究報告。12凋亡水平明顯低于糖尿病模型組,說明金櫻子能在一定程度上抑制或延緩了凋亡的發(fā)生。MDASOD、TACMDA,SOD、TAC4P＜0.05),經(jīng)金櫻子處理后的大鼠晶狀體混濁度發(fā)展速度則顯著低于糖尿病模型組(P＜0.05)。綜上所述,本研究從晶狀體的形態(tài)學、生物酶學及細胞學三個方面初步研究了金櫻子對糖尿病大鼠晶狀體的保護作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)金櫻子對糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細胞凋亡具有一定的抑制功能,并可能與其具有較強的抗氧化能力,最終通過抑制晶狀體組織的氧化應激而實現(xiàn)治療糖尿病性白內(nèi)障的作用。因此,金櫻子有望成為糖尿病性白內(nèi)障治療的一種潛在藥物,但其具體的調(diào)控機制還有待進一步研究,同時,對于金櫻子中最有效的抗氧化成分的研究還有待深入研究。參考文獻:BalakumarM,SaravananN,PrabhuD,etal.Benefitsofearlyglycemiccontrolbyinsulinonsensoryneuropathyandcataractindiabeticrats[J].IndianJExpBiol,2013,51(1):56-64.KimB,KimSY,ChungSK.Changesinapoptosisfactorsinlensepithelialcellsofcataractpatientswithdiabetesmellitus[J].JCataractRefractSurg,2012,38(8):1376-1381.ZhangS,ZhengL,DongD,etal.EffectsofflavonoidsfromRosalaevigataMichxfruitagainsthigh-fatdiet-inducednon-alcoholicfattyliverdiseaseinrats[J].FoodChemistry,2013,141(3):2108-2116.MCP-1[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2009,9(23):4425-4427.BahmaniF,BathaieSZ,AldavoodSJ,etal.Glycinetherapyinhibitstheprogressionofcataractinstreptozotocin-induceddiabeticrats[J].MolVis,2012,18:439-448.BalakumarM,SaravananN,PrabhuD,etal.Benefitsofearlyglycemiccontrolbyinsulinonsensoryneuropathyandcataractindiabeticrats[J].IndianJExpBiol,2013,51(1):56-64.KattaAV,KatkamRV,GeethaH.Lipidperoxidationandthetotalantioxidantstatusinthepathogenesisofagerelatedanddiabeticcataracts:astudyonthelensandblood[J].JClinDiagnRes,2013,7(6):978-981.LiY,JiaY,ZhouJ,etal.EffectofmethioninesulfoxidereductaseB1silencingonhigh-glucose-inducedapoptosisofhumanlensepithelialcells[J].LifeSci,2013,92(3):193-201.LiY,JiaY,ZhouJ,etal.EffectofmethioninesulfoxidereductaseB1silencingonhigh-glucose-inducedapoptosisofhumanlensepithelialcells[J].LifeSci,2013,92(3):193-201.KimJ,KimOS,KimCS,etal.Accumulationofargpyrimidine,amethylglyoxal-derivedadvancedglycationendproduct,increasesapoptosisoflensepithelialcellsbothinvitroandinvivo[J].ExpMolMed,2012,44(2):167-175.KumariSS,EswaramoorthyS,MathiasRT,etal.Uniqueandanalogousfunctionsofaquaporin0forfiberce