遺傳學診斷在遺傳性耳聾中的應用,醫(yī)學遺傳學論文內容摘要：1990年運用胚胎移植前遺傳學診斷技術(Pre-implantationGeneticDiagnosis,PGD)的首例女嬰的成功誕生[1],標志著PGD正式從實驗室轉化到臨床應用。PGD是采用輔助生殖醫(yī)學方式方法,通過遺傳學的診斷技術,挑選健康的胚胎進行子宮移植,它能夠對攜帶遺傳性致病基因的夫婦或者患者夫婦進行孕前診斷,進而獲得表型正常的后代,且避免因產前診斷為致病胚胎而帶來的能否選擇終止妊娠的痛苦及反復流產對孕婦的心身傷害。當前PGD已廣泛運用于單基因遺傳性疾病和染色體異常性疾病。近20多年來,隨著輔助生殖技術和胚胎檢測技術的飛躍發(fā)展,PGD已應用于近200種單基因遺傳性病,包括一些特殊單基因遺傳性疾病的人類白細胞抗原配型,遺傳性癌癥和線粒體疾病等。遺傳性耳聾絕大部分為單基因變異,具有PGD適應癥。隨著新一代測序技術廣泛應用,胚胎診斷技術準確性及效率均有很大提高。本文通過文獻溫習,綜述PGD的新進展以及其在遺傳性耳聾疾病的應用。本文關鍵詞語：胚胎移植,遺傳學應用,遺傳性耳聾,應用1PGD應用范疇1.1單基因遺傳性疾病單基因遺傳性疾病即孟德爾遺傳病,是根據孟德爾方式傳遞的疾病,一般由一對等位基因控制單個基因突變引起,牽涉單個核苷酸改變到整個基因改變。單基因遺傳性疾病致病單基因及致病突變點確實定,是PGD的基礎。根據歐洲人類生殖和胚胎學協會(theEuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology,ESHRE)-PGD協作組2020年[2]發(fā)表的運用于PGD的單基因遺傳性疾病譜:當前有近200種單基因遺傳性疾病已采用PGD的方式方法來避免垂直傳遞,華而不實-地中海貧血(beta-thalassemia)、囊性纖維化(cysticfibrosis)、亨廷頓舞蹈病(Huntingtondis-ease)、強直性肌營養(yǎng)不良癥(myotonicdystrophy)、脆性X染色體綜合征(fragileXsyndrome)在臨床周期中排前5名;有耳聾表型的疾病中包括常染色體顯性遺傳的綜合征(Waardenburgsyndrome,Neurofibromatosistype2,TreacherCollinssyndrome,Branchio-oto-renalsyn-drome),常染色體隱性遺傳的綜合征(Ushersyndrome)以及非綜合征遺傳性耳聾(詳細基因型不詳)。由上可見,盡管遺傳性耳聾十分是非綜合征遺傳性耳聾的致畸性在全世界的某些地區(qū)和某些社團有爭議[3,4],但絕大部分人群希望在明確致病基因的基礎上,通過孕期或者產前的方式避免遺傳性耳聾疾病的垂直傳遞,孕育正常聽力后代[5,6,7,8]。1.2染色體異常和胚胎植入前遺傳學篩查(preimplanta-tiongeneticscreening,PGS)在ESHRE歷年頒布的數據中,因染色體構造異常而行PGD的病例數幾乎與單基因遺傳性疾病并重。染色體異?，F象在人類普遍存在,在新生兒中約占0.9%,在孕早期自然流產的人群中,染色體異常因素占50-60%[9]。攜帶平衡的染色體構造重排的人群,如倒位和羅伯遜易位,這些平衡易位者表型正常,但她們可能面臨反復流產、不孕或者后代有先天性畸形和智力減退的高風險。這些問題都可能歸結于在減數分裂經過中染色體分離方式,最終導致配子染色體不平衡。一般來講,易位攜帶者精子多數為不平衡的,少數為正常的[10]。研究倒位攜帶者PGD的胚胎中,其染色體分離時,發(fā)現不同的分離方式胚胎有很高頻率的染色體不平衡,80%的胚胎染色體異常[11]。羅伯遜易位攜帶者(無論男性或者女性)2/3的胚胎染色體不平衡[12]。固然胚胎有如此高的染色體異常,但是研究發(fā)現PGD能夠改善攜帶平衡染色體重排人群的妊娠結果,尤其是反復流產的人[13,14]。1995年,VerlinskyY發(fā)表文章[15],以為在輔助生殖經過中,檢測胚胎的非整倍性,能夠提高妊娠率,從此引入一個新的概念-胚胎植入前遺傳學篩查(preimplantationgeneticscreeningPGS)。PGS所采用的技術和PGD大致一樣,但其定位是篩查,相對PGD來講,是屬于低危,由于不牽涉某一遺傳性疾病在一個家庭中的傳遞。PGS作為輔助生殖醫(yī)學領域的一項技術,主要目的是提高妊娠率,適用于高齡,反復輔助生殖經過中移植失敗和反復流產。PGS當前仍有爭議,之前的報道多為非隨機的低水平的研究,當前的隨機對照研究顯示并不能提高分娩率[16]。原因可能為:1)檢測標本的不具有代表性,分裂體有較高嵌合體;2)FISH檢測技術的局限性。不同時期的胚胎活檢和arrayCGH技術檢測23對染色體的非整倍性的策略施行后,可通過輔助生殖分娩率的高低來證明PGS的有效性。1.3人類白細胞抗原配型PGD聯合人類白細胞抗原配型是PGD運用于臨床的新領域。在一些家庭中,比方淋巴瘤或者-地中海貧血兒童患者后期,需要造血干細胞移植。這些患者在疾病晚期,最好的治療是進行人類白細胞抗原配型成功的造血干細胞移植,但是臨床經過中,供體非常有限。有的父母為給患病晚期的孩子提供適宜的供體,他們會選擇再次懷孕,但是這種自然懷孕只要1/4的時機與患兒的白細胞抗原配型成功,這就意味著為拯救疾病晚期的孩子需獲得完全配型的造血干細胞,父母親不得不反復懷孕,通常因胚胎與先證者不配型而終止妊娠。通過PGD-HLA配型后,挑選HLA配型的胚胎進行移植,就能夠解決這個問題。當然,PGD-HLA配型本身也有局限性,經白細胞抗原附件的標記連鎖分析后與先證者完全配型的胚胎數目會比擬少。在概率上講,單基因隱性遺傳疾病在PGD中得到可移植胚胎(正常和攜帶)的幾率為75%(這是PGD的首要目的),得到與病兒HLA相配胚胎的幾率是25%,得到可送并與病兒HLA相配胚胎的幾率為75%25%=19%。自2001年YuryVerlinsky[17]報道首例范可尼貧血癥PGD-HLA配型成功,PGD已發(fā)展到可在一次PGD經過中完成HLA配型鑒定,不但能夠得到無此遺傳性疾病的胎兒,還能夠得到與有此病的兄姐的HLA相配的無病嬰兒,在其出生時保存其臍帶血(干細胞)用來患病兄姐的治療。當前PGD-HLA配型已經在-地中海貧血,鐮狀細胞性貧血,急性淋巴細胞性白血病,骨髓異常增生癥,Wiskott-Aldrich綜合征(濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征),骨硬化癥,X連鎖的慢性肉芽腫疾病等疾病中應用。隨著遺傳性耳聾干細胞治療研究的深切進入,希望在不久的將來,能通過PGD-HLA應用于遺傳性耳聾疾病,不僅能治療先證者,而且讓父母同時擁有一個正常聽力兒。1.4有遺傳性傾向癌癥盡管當前PGD應用于成人遲發(fā)性疾病倫理學有爭議,但是臨床方面一直在探尋求索,自YuryVerlin-sky2001年[18]首例Li-FranmenisyndromePGD成功后,乳腺癌,遺傳性乳頭狀腎癌,視網膜母細胞瘤,家族性腺瘤性息肉病等有遺傳傾向的腫瘤疾病已經采用PGD的方式方法來避免在家庭中的垂直傳遞。1.5線粒體疾病PGD是某些線粒體疾病避免在家庭中傳遞最好的選擇,由于mtDNA遵循嚴密的母系遺傳方式,決定突變垂直傳代的類型,即由母親傳給男女后代,而且女兒會繼續(xù)傳給下代,類似于孟德爾的常顯及伴性(X)連鎖類型。華而不實比擬典型的是線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(MitochondrialEncephalomyopa-thy,LacticAcidosisandStroke-likeEpisodes,MELAS):近80%病例為A3243G(線粒體編碼亮氨酸t(yī)RNA)突變,在ESHRE2020年頒布的數據中,曾在2018年做2個周期的此病[2]。線粒體遺傳性耳聾中,m1555AG和m1494CT突變可因氨基糖甙類藥物誘導感音神經性耳聾。一旦發(fā)病當前尚無有效藥物治療,發(fā)現有此基因突變的患者終身禁用氨基糖甙類藥物。高危家庭中為避免患有線粒體疾病的嬰兒出生最佳途徑是檢查囊胚細胞,評估線粒體突變的幾率,將患病幾率最小的胚胎進行移植,這是傳統(tǒng)的PGD途徑。英國議會下院于2021年2月5日投票通過一項歷史性的法案,同意英國研究人員繼續(xù)開展通過醫(yī)學方式方法防止線粒體遺傳性疾病垂直傳遞的研究。亦稱為線粒體DNA替代療法。即采用輔助生殖的方式方法,將來自攜帶缺陷線粒體卵細胞的細胞核轉移到健康線粒體的捐獻者卵子內,由此構成的胚胎將擁有父母親的細胞核的DNA和卵子捐獻者的線粒體DNA。由于引入的線粒體基因只占嬰兒總基因的0.1%,可能不會影響嬰兒的相貌等其他特征。這是PGD技術新的延伸。當前該技術還需上議院獲批。固然英國的倫理及科學審查及民意征詢均支持該技術在人類開展實驗性應用,但美國相關部門還在考慮能否使用該技術。2活檢材料2.1傳統(tǒng)活檢材料PGD經過需要DNA進行遺傳學檢測,當前主要有3種途徑獲得DNA:1)卵子第一極體和第二極體活檢,獲取第一極體或者第二極體;2)培養(yǎng)至第3天胚胎卵裂期對卵裂球活檢,一般取1-2個卵裂球細胞;3)培養(yǎng)第5天囊胚期對外胚層滋養(yǎng)細胞活檢,一般取5-15個外胚層滋養(yǎng)細胞。以上3種方式都有各自的優(yōu)缺點。2.1.1極體活檢女性性成熟后每個月經周期有部分卵母細胞進行減數分裂,排出第一極體后完成第一次減數分裂;排卵后,卵母細胞休止于第二次減數分裂中期,此時的卵母細胞一旦與精子相遇,就排出第二極體,完成第二次減數分裂。極體是單倍體細胞,與卵細胞的染色體核型互相對應。極體的活檢已經成功應用于母源性單基因遺傳性疾病和染色體疾病,極體是減數分裂的排泄物,能保存胚胎的完好性。有些國家禁止對合子進行活檢取材,極體恰好能避免此類倫理沖突。但是極體不能對父源性,卵裂后的異常進行檢測,且固定極體需要較高的技術性。2.1.2分裂體期活檢分裂體期對分裂球活檢,即受精后第3天6-8細胞期吸出1個或者2個細胞。分裂球的DNA來自父母雙方。而且在活檢后即便在不冷凍的情況下能夠繼續(xù)培養(yǎng)第2天至第5天的囊胚期,這為遺傳學檢測留有48小時時間。分裂體期活檢當前仍在被廣泛應用。但是取1個細胞因單一DNA量可能會對診斷造成困擾,十分是嵌合體的存在。而當前有研究以為取2個細胞又會造成活胎率的降低[19]。隨著新型配方簡化的胚胎培養(yǎng)基的引入,體外培養(yǎng)胚胎的發(fā)育率得到極大的提高,胚胎體外培養(yǎng)的時間可延長至體外受精后第5天的囊胚期。囊胚培養(yǎng)技術的出現提供了新的獲取DNA樣本的途徑。囊胚外胚層滋養(yǎng)層細胞最終發(fā)育成胚外組織如胎盤等,同時能夠代表整個胚胎的遺傳學狀況,新方式方法利用激光切開囊胚的透明帶,獲取5-15個左右的外胚層滋養(yǎng)細胞用于遺傳學檢測。采用外胚層滋養(yǎng)細胞進行PGD的優(yōu)勢總結如下:1)細胞數量優(yōu)勢即DNA優(yōu)勢提高診斷的準確性,因囊胚活檢可得到5-15個細胞,與一般只能獲取單細胞或者2個細胞的分裂體期活檢相比,等位基因的脫扣(alleledropout,ADO)更少,嵌合體導致的誤診率更低。2)提高臨床的單胎妊娠率和出生率。某些原因可能會導致從D3培養(yǎng)至D5的一部分可能有缺陷的分裂體的淘汰(盡管此觀點當前尚有爭議)。而囊胚活檢經過中的透明帶打孔和人工皺縮囊胚腔等操作對胚胎的發(fā)育有利[20]。另外隨著玻璃化凍存技術推廣,為囊胚活檢后遺傳性檢測提供大量時間,臨床醫(yī)生能夠選擇在下一自然月經周期排卵后子宮內膜同步化增厚,更合適囊胚的著床。而且囊胚經玻璃化凍存后,不影響移植的妊娠率和出生率,甚至比鮮胚移植結果更好。綜上所述,通過囊胚活檢,同時選擇優(yōu)勢囊胚進行移植,可提高單胎的妊娠率和出生率。盡管囊胚的活檢比分裂體更復雜,隨著此項技術的普及,已經成為各生殖中心的常規(guī)操作。2.2囊胚胚液診斷SPalini2020[21]報道初次通過實時PCR方式方法,發(fā)如今玻璃化冷凍經過中收集的囊胚胚液中90%存在基因組DNA。并且通過擴增Y染色體上的TSPY1基因鑒定囊胚的性別,這為攜帶X-連鎖疾病的夫婦鑒定男性胚胎提供可能,而對胚液進行全基因組擴增為更進一步基因檢測奠定基礎。此途徑最大的優(yōu)勢是胚液不牽涉到細胞的丟失,相對分裂體和囊胚活檢來講,是一種無創(chuàng)的活檢方式方法。J.Cohen[22]在SPalini同年發(fā)表的文章稱贊其為無侵襲性活檢PGD的開場。盡管如此,當前的研究還需確定下面問題:1)囊胚胚液的DNA能否完全能代表囊胚的DNA;2)胚液DNA能否含有來自從胚胎排出的不正?；蛘呓到饧毎腄NA;3)此方式方法能否真的是無創(chuàng),固然提取胚液的經過無細胞的吸出,但是在操作經過中能否會影響囊胚的發(fā)育。等待囊胚胚液的深切進入研究,為需行PGD/PGS家庭帶來更安全有效的活檢方式。3診斷技術3.1FISHFISH應用于臨床約20年,主要檢測染色體異常和性別選擇。根據不同的情況,選擇特定帶有熒光標記的探針與相應需檢測的染色體結合后在顯微鏡下觀察熒光的信號做出結果的判定。但是FISH技術的局限性,如信號不清楚明晰,分析染色體數目限制等,導致其在PGD/PGS中應用有所限制。3.2單細胞PCR單細胞PCR當前主要用于單基因遺傳性疾病診斷。單細胞PCR與普通PCR相比因模板量少,可能面臨擴增失敗、污染、等位基因脫扣等問題。臨床檢測中多采用多重巢式熒光PCR的策略:多重是同時使用多個(一般為3個以上)目的基因附近的短串聯重復序列(shorttandemrepeat,STR)進行連鎖分析以防止等位基因脫扣;采用巢式PCR能夠擴增出更多目的產物;第二輪一端引物帶熒光,擴增的帶熒光的產物可用毛細管電泳分析產物片段大小。此方式方法固然需要大量時間來優(yōu)化PCR條件,但是由于檢測周期短,花費較低,準確性較高,仍在單基因遺傳性疾病PGD中廣泛使用。3.3新技術應用3.3.1單細胞全基因組擴增(wholegenomeamplifica-tion,WGA)技術因單細胞直接進行PCR只要一次擴增時機,DNA產物量有限,進行檢測的位點遭到限制。近年來,WGA技術得到發(fā)展,能將單拷貝DNA進行全基因組擴增,為后續(xù)的遺傳學檢測提供足量的DNA。當前常用技術有依靠PCR原理的簡并寡核苷酸引物PCR(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR),擴增前引物延伸反響(primerextensionpreamplifica-tion,PEP);亦有不依靠PCR原理的基于酶促反響的多重替代擴增(multipledisplacementamplification,MDA)。謝曉亮院士課題組于2020年在(Science〕[23]發(fā)表了一種全新的單細胞WGA的方式方法屢次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(multipleannealingandloopingbasedamplificationcycles,MALBAC),該技術起始模板量降到皮克級,具有基因覆蓋度更廣,擴增的均勻性提高,等位基因脫扣率大大降低等特點,而且可成功應用于單精子細胞[24],分裂球的非整倍性檢測[25]。等待此方式方法在臨床進行擴大范圍的驗證,為單基因遺傳性疾病診斷提供更準確的診斷。3.3.2新一代測序技術基因單細胞全基因組擴增技術的進步,使得擁有足夠的DNA用于下游的遺傳學檢測。2005年Roche公司454測序儀的出現,標志著新一代測序技術(nextgenerationsequencingtechnology,NGS)問世。目的區(qū)域捕獲聯合NGS是利用定制的探針與基因組DNA進行雜交或者PCR捕獲目的基因組區(qū)域,隨后采用高通量測序技術進行測序的方式方法。對于明確致病基因的家庭,使用PGD方式方法避免致病基因垂直傳遞經過中必然要挑選健康胚胎進行移植。傳統(tǒng)的PCR需聯合STR位點監(jiān)測等位基因的脫扣,但是對于某些基因假如其上下游沒有足夠的STR位點或者一些由于種族關系等原因STR位點不是雜合造成此檢測方式方法的局限性。然而目的區(qū)域捕獲能包含目的基因區(qū)域和及其上下游高度嚴密連鎖的SNP,即采用SNP第3代遺傳標記進行監(jiān)測,然后進行高通量測序,通過家族的單體型連鎖分析,確定胎兒基因型的方式方法來進行健康胚胎的挑選。G.Altarescu等在患CharcotMarieTooth1A(CMT1A)疾病的夫婦挑選胚胎經過中[26],同時采用傳統(tǒng)的多重巢式PCR方式方法和SNP微陣列分析,結果提示SNP微陣列分析的結果具有準確、可行、耗時短特點。4PGD在遺傳性耳聾中應用4.1遺傳性耳聾大概情況及PGD應用耳聾是人類最常見的感覺系統(tǒng)疾病,可分為綜合征和非綜合征性耳聾,世界上大約有3.6億患病。根據2006年第二次全國殘疾人抽樣調查報告,我們國家聽力殘疾人群有2780萬,華而不實0-6歲聽障兒童13.9萬,每年新生2-3萬。遺傳因素在神經性耳聾中超過50%。當前已經在非綜合征性耳聾中發(fā)現80多個相關基因)。GJB2是導致遺傳性非綜合征型耳聾最常見的基因。對于日益增大的耳聾人群,耳聾的早期診斷和干涉已成為防聾控聾的重中之中。在聾病的三級預防中,我們可通過高危家庭的有創(chuàng)產前診斷以及新生兒聽力與基因聯合篩查來減少聾兒的出生和早期診斷及干涉聽障兒童。但是對于有生育遺傳性耳聾的高危人群來講,假如經歷1次以上有創(chuàng)產前診斷后且沒有能順利生育聽力正常的后代,PGD是理想而又可行的方式方法。在國際上,歐洲[2](波蘭的病例在文獻發(fā)表時為妊娠狀態(tài)[27]),以色列[28],沙特阿拉伯[5],中國臺灣[29]都有PGD應用于遺傳性耳聾的成功案例。中國的科學家已經在耳聾基因研究和臨床基因診斷方面獲得豐富的成果,隨著我們國家輔助生殖技術已與國際接軌,我們有能力將PGD技術成功應用于遺傳性耳聾疾病,能使生育遺傳性耳聾患兒風險的高危家庭孕育聽力正常后代。4.2將PGD應用于中國遺傳性耳聾疾病的意義中國人口基數大,每年的都有3萬新增聾兒。因聾致啞導致的家庭和社會問題尤為突出,聾人家庭承受宏大痛苦及沉重的經濟負擔。而且因聾致啞會嚴重影響我們國家的人口素質,增加我們國家的財政負擔。當前通過遺傳咨詢,耳聾基因產前診斷和新生兒聽力聯合基因篩查策略來減少耳聾出生缺陷已經獲得很大的成效。但是對于明確已經知道致聾基因的家庭,渴望擁有正常聽力后代,然而通過傳統(tǒng)的產前診斷的方式方法只能判定胎兒的基因型。2018年,Klitzman在美國曾通過調查問卷的形式對220名內科醫(yī)生針對PGD應用進行了調查:僅7.1%內科醫(yī)生覺得自個有資質回答病人有關PGD的問題,華而不實僅4.9%的內科醫(yī)生將PGD技術介紹給病人選擇,而且也是針對最熟悉的囊性纖維變性[30]。上述調研結果講明PGD技術在全世界醫(yī)生中可能存在認識缺乏。隨著更多的遺傳性耳聾家族中致聾基因的發(fā)現,中國的耳鼻喉科醫(yī)生需深切進入了解此技術。在確定致病基因及致病突變點的遺傳性耳聾家族中,假如家屬迫切希望擁有一個健康的聽力正常的后代,一旦傳統(tǒng)的產前診斷技術(包括絨毛膜和羊水穿刺)不能被接受或者反復的產前診斷確定為致病胎兒已經深深地影響孕婦及家屬的心理及生理,PGD技術是理想而能接受的選擇。從衛(wèi)生經濟學角度出發(fā),PGD費用要低于人工耳蝸植入,十分是雙耳的人工耳蝸植入費,且無需終身維護和無身體終身殘疾。從孕婦角度考慮,因當前的輔助生殖技術和遺傳學分子診斷技術已特別成熟,挑選健康胚胎植入子宮已完全可能,避免反復流產造成心理,生理傷害和倫理沖突。如成功將PGD技術廣泛運用于遺傳性耳聾疾病,能阻斷大量耳聾基因的垂直傳遞,進而減少人群耳聾基因突變的攜帶率。結束語PGD是輔助生殖領域的新技術,通過它能夠在基因水平預防單基因遺傳性疾病的垂直傳遞。從心理和倫理上考慮,PGD比有創(chuàng)的絨毛或羊水活檢更易于被育齡婦女接受。綜述所述,PGD具有廣泛的應用前景。但是PGD費用較昂貴,而且花費時間比擬長。在應用于成人遲發(fā)性疾病方面當前仍有爭議。在PGD技