Introductionto

DynamicLightScatteringand

PhaseAnalysisLightScatteringLightScatteringUniversityWyattTechnologyCorporationCHINA靜態(tài)光散射(SLS):MolarMass,MRmsradius,RgSecondvirialcoefficient,A2動(dòng)態(tài)光散射(DLS)Translationaldiffusioncoefficient,DtHydrodynamicRadius,Rh相分析光散射(PALS)ElectrophoreticMobilityZetaPotential,EffectiveMolecularCharge,QeffIsoelectricPoint,IE光散射可以測(cè)定哪些物理量?分子尺寸:光散射靜態(tài)光散射

(SLS):

RMSRadi均方根半徑

Rg

分子中每一質(zhì)點(diǎn)到質(zhì)心的平均距離檢測(cè)下限10nm動(dòng)態(tài)光散射(DLS)

流體力學(xué)半徑Rh

與樣品分子具有相同擴(kuò)散系數(shù)的等效球體半徑.檢測(cè)下限~0.5nmRh范例:溶菌酶（Lysozyme）LysozymeMw=14,300DaDLS測(cè)定：Rh19?構(gòu)象信息:Rhvs.Rg實(shí)心球3-臂星形高分子

動(dòng)態(tài)光散射儀工作原理示意圖DynaproPlateReaderDynamicLS:

研究散射光強(qiáng)度波動(dòng)StaticLS:

研究分子量與平均

散射光光強(qiáng)度之間關(guān)系DynaproNanoStar,TREOSLasersampleAvalanchePhotodiodeCorrelatorBoardOpticalFiber動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定原理:光的干涉分子布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致光強(qiáng)度波動(dòng)干涉加強(qiáng)干涉減弱光強(qiáng)度波動(dòng)粒子擴(kuò)散速率與其粒子尺寸密切相關(guān)光強(qiáng)度波動(dòng)分析自相關(guān)函數(shù)

（AutocorrelationFunction）光強(qiáng)度波動(dòng)光強(qiáng)度波動(dòng)分析自相關(guān)函數(shù)

（AutocorrelationFunction）光強(qiáng)度波動(dòng)自相關(guān)函數(shù)Rh=9nmlatexspheresqLaserSample自相關(guān)函數(shù):I0IS散射矢量:Dt:擴(kuò)散系數(shù)DtT高溫加速粒子運(yùn)動(dòng)Dt1/R粒子小運(yùn)動(dòng)快Dt1/fs非球面性降低移動(dòng)性影響平易擴(kuò)散因素Dt1/fh溶劑與粒子相互作用以及粒子間相互作用增加粘滯力Dt1/粘度效應(yīng)：高粘度溶劑或高濃度樣品內(nèi)在因素分子運(yùn)動(dòng)的時(shí)間尺度如何由擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算Rh?kB–Boltzmann’sconstantT–temperature(Kelvin)

η–viscosityofsolventRh–hydrodynamicradiusStokes-EinsteinRelation粒子尺寸分布擴(kuò)散時(shí)間的分布性導(dǎo)致指數(shù)時(shí)間常數(shù)具有分布性單指數(shù)擬合結(jié)果：Rh=20nm!9nm+50nmradiusparticles粒子尺寸分布分析Cumulants:假設(shè)擴(kuò)散系數(shù)符合高斯分布。采用該擬合法計(jì)算其平均值和擴(kuò)散系數(shù)分布(Rh)Regularization:以指數(shù)的分布擬合數(shù)據(jù)，更真實(shí)的表征Rh（單模態(tài)）MonomodalPolydisperseMonodisperse多模態(tài)（Multimodal）PolydisperseMonodisperse范例：Regularization擬合結(jié)果:Peak1:Rh=7nm,width=1nmPeak2:Rh=43nm,width=10nmRh=9nm+50nm

PS乳液粒子受峰寬度影響，regularization擬合法能識(shí)別半徑差別~5倍以上不同尺寸粒子。范例:Lysozyme熱穩(wěn)定性-DLS轉(zhuǎn)變溫度75.2°C與Calorimetry(75°C)及CircularDichroism(76°C)一致；整個(gè)溫度條件下，恒定的摩爾質(zhì)量表明(SLS測(cè)定)Lysozyme發(fā)生去折疊（unfolding）變化而非寡聚。DLS預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)晶單分散性、高純度兩因素與樣品結(jié)晶能力密切相關(guān)。通過(guò)改變buffer條件和去除蛋白中大的聚集體，增加結(jié)晶試驗(yàn)成功可能性。單機(jī)

DLS–“現(xiàn)實(shí)考驗(yàn)”Rh檢測(cè)下限~0.5nm；上限

~500nm.單機(jī)DLS無(wú)法區(qū)分單體與較小的聚集體，如二聚體、三聚體等。DLS對(duì)含量少，但較大聚集體靈敏度極高，這些大顆粒包括灰塵等。首先確認(rèn)自相關(guān)函數(shù)擬合效果及形狀的合理性，然后再作進(jìn)一步尺寸分布數(shù)據(jù)分析。OnlineMALS+DLS(QELS)AvalanchePhotodiodeDigitalCorrelatorSEC-DLS模式測(cè)定

Rh

SEC-DLS模式測(cè)定:BSA4.3nm3.5nmmonomerdimerBatchDLSOnlineDLStrimer為什么Proteincomplex出峰時(shí)間更晚?Complex(Trap-IL4)275kDIL4trap240kD因?yàn)榫哂懈o湊的結(jié)構(gòu)Trap:Rh=7.2nmComplex(Trap-IL4):Rh=6.5nmEmptyliposome,Rg/Rh~1.0Filledliposome,Rg/Rh~0.77FFF技術(shù)表征

Rg/Rh

：了解Liposome結(jié)構(gòu)RgfromMALS

On-LineDLS應(yīng)用范圍最低檢測(cè)線(xiàn)：1~10nm能識(shí)別單體、二聚體、三聚體等。結(jié)合

Mw，Rg，洗脫體積Ve，判斷構(gòu)象與SEC分離情況。

On-LineDLS：局限性最大測(cè)量尺寸取決于流速、光束大小以及檢測(cè)角度。

色譜系統(tǒng)中檢測(cè)范圍:

1nm<Rh<30nm與靜態(tài)光散射相比，需要更高的濃度。溶劑不能具有較高的光散射能力。4.4nm3.5nmmonomertrimerdimer如何選擇?

SampleThroughputDynaProPlateReaderDynaProNanoStarDLS+MALS

withSeparation

Technique(SEC/FFF)

InformationDetail我們?nèi)绾晤A(yù)測(cè)配方溶液和

膠體溶液的穩(wěn)定性？通過(guò)DLS測(cè)定粒子尺寸與時(shí)間的相關(guān)性；測(cè)定電泳遷移率（electrophoreticmobility）預(yù)測(cè)溶液穩(wěn)定性；

電泳遷移率與以下因素相關(guān)：分子有效電荷；Zeta電位

；等電點(diǎn)（Isoelectricpoint）；溶液中的帶電粒子為什么關(guān)注溶液中粒子帶電性?因電荷而穩(wěn)定存在；預(yù)防配方溶液的聚集；帶電粒子穩(wěn)定性取決于:溶液的pH；溶液的離子強(qiáng)度；非離子添加劑；電泳遷移率帶點(diǎn)分子和粒子在外加電場(chǎng)E作用下運(yùn)動(dòng)；電泳遷移率E是單位電場(chǎng)強(qiáng)度下粒子遷移的速率；由E計(jì)算可計(jì)算粒子有效電荷Qeff與zeta電位

；++++++++++++++--------------+QvE我們?nèi)绾螠y(cè)定電泳遷移率?+V-VReferencebeam+-Q+QPhasemodulationScatteredLightDetectorDetectorArray動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(DLS)布朗運(yùn)動(dòng)對(duì)電泳遷移率不敏感激光多普勒測(cè)速法（LaserDopplerVelocimetry，LDV）電泳遷移率無(wú)法區(qū)分正負(fù)電荷相分析光散射技術(shù)(PALS)電泳遷移率+

電荷高電場(chǎng)強(qiáng)度+長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量可能破壞樣品大規(guī)模并行相分析光散射技術(shù)(MP-PALS)電泳遷移率+

電荷+并行檢測(cè)高靈敏度+低電場(chǎng)使測(cè)定敏感高分子成為可能：

Lysozyme：1mg/mL!M?biu等電點(diǎn)測(cè)定pI