微核檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃書(shū)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馕⒑藴y(cè)試原理和毒理遺傳學(xué)意義。學(xué)習(xí)蠶豆根尖的微核測(cè)試技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理微核（micronucleus,簡(jiǎn)稱MCN）,也叫衛(wèi)星核，是真核類(lèi)生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。微核往往是各種理化因子，如輻射、化學(xué)藥劑對(duì)分裂細(xì)胞作用而產(chǎn)生的。在細(xì)胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應(yīng)在主核1/3以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成DNA的能力。一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產(chǎn)生的。有實(shí)驗(yàn)證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在分裂過(guò)程中行動(dòng)滯后，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的核塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。已經(jīng)證實(shí)，微核率的大小是和作用因子的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點(diǎn)與染色體畸變的情況一樣。所以許多人認(rèn)為可用簡(jiǎn)易的周期微核計(jì)數(shù)來(lái)代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計(jì)數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能的應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出等都存在污染環(huán)境的可能性，欲了解這些因素對(duì)機(jī)體潛在的遺傳危害，需要有一套高度靈敏，技術(shù)簡(jiǎn)單易行的測(cè)試系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境的變化。只有真核類(lèi)的測(cè)試系統(tǒng)更能直接推測(cè)誘變物質(zhì)對(duì)人類(lèi)或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測(cè)試是一種比較理想的方法。目前國(guó)內(nèi)外不少部門(mén)已把微核測(cè)試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、食品添加劑的安全評(píng)價(jià),以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷等各個(gè)方面。三、材料、儀器與試劑1、材料：蠶豆根尖2、儀器：10W紫外燈、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、濾紙3、試劑：卡諾固定液（95%酒精：冰醋酸=3:1）、70%乙醇、卡包品紅染色劑、1.0mol/LCr0、0.5mol/LNaN、150mol/LEMS溶33液、6mol/L鹽酸。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、浸種催芽（按講義上的步驟）2、根尖染毒處理2.1紫外光處理：取出五組蠶豆根尖，分別用10W紫外燈等距離照射，分別照射0min、15min、25min、35min、45min，制片觀察微核數(shù)目。2.2誘變物處理：取出三組蠶豆根尖，分別放入盛有l(wèi).Omol/LCrO、0.5mol/LNaN、150mol/LEMS溶液的培養(yǎng)皿中，33皿中溶液浸沒(méi)根尖即可。分別處理根尖24h。誘變處理后，用蒸餾水沖洗根尖表面的溶液。3、根尖細(xì)胞的恢復(fù)培養(yǎng)洗凈后置于鋪有浸潤(rùn)濾紙的瓷盤(pán)中，25°C下再恢復(fù)培養(yǎng)22h。4、根尖細(xì)胞的固定將恢復(fù)后的種子，從根尖頂端切下1cm長(zhǎng)的幼根，用（甲醇：冰醋酸=3:1）液固定24h。固定后的根如不及時(shí)制片，可換入70%的乙醇溶液中置4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、酸解用蒸餾水浸洗固定好的幼根2次，每次5min，吸凈蒸餾水，加入6mol/L鹽酸將幼根浸沒(méi)，室溫下酸解10min，幼根軟化即可。6、染色吸去鹽酸，用蒸餾水浸沒(méi)幼根3次，每次2min，最后浸于水中。制片前置于載玻片上，截取前端1~2mm左右長(zhǎng)的淡黃色部分（生長(zhǎng)點(diǎn)），用另一塊載玻片與前者交叉成十字形壓片，將材料壓成薄層。揭片后，兩塊載玻片的中間部分都占有相似的薄層，將其中一塊用少量蒸餾水沖到另一塊上，滴1~2滴卡包品紅染色劑，用鑷子將生長(zhǎng)點(diǎn)搗碎，染色10min，將染液吸凈后，滴加蒸餾水，小心加上蓋玻片，注意防止氣泡產(chǎn)生。然后覆蓋吸水紙，用大拇指按壓，使染色區(qū)呈云霧狀。7、鏡檢每個(gè)根尖數(shù)1000個(gè)左右細(xì)胞，觀察并統(tǒng)計(jì)其中含微核的細(xì)胞數(shù)。五、數(shù)據(jù)分析計(jì)算各測(cè)試樣品的微核千分率（MCN%。）MCN%o=（某測(cè)試樣品觀察到的微核數(shù)/某測(cè)試樣品中觀察到的細(xì)胞數(shù)）x1000%。備注：卡寶品紅染色劑就是石炭酸品紅，配制方法：先配成三種原液,再配成染色液原液A：3g堿性品紅溶于100ml70%酒精中.原液B：取原液A10ml加入到90ml5%石炭酸水溶液中.原液C：.取原液B55ml,加入6ml冰醋酸和6ml福爾馬林（38%的甲醛）.（原液A和原液C可長(zhǎng)期保存，原液B限兩周內(nèi)使用）.染色液:取C液10—20ml,加45%冰醋酸80?90ml,再加山梨醇1.8g,配成10%?20%濃度的石炭酸品紅液，放置兩周后使用，效果顯著（若