第四章色譜法Chromatography《現(xiàn)代表征技術(shù)》第四章色譜法4.1色譜分析法簡介4.2色譜圖及色譜常用術(shù)語4.3色譜法的基本理論4.4色譜定性和定量分析4.5氣相色譜法（了解）4.6高效液相色譜法（了解）4.1.1色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展4.1.2

什么是色譜法4.1.3

色譜法分類4.1色譜分析法簡介1.色譜法的產(chǎn)生色譜法是一種分離技術(shù)俄國植物學(xué)家茨維特1906年創(chuàng)立4.1.1色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展分離植物葉子中的色素時，將葉片的石油醚（飽和烴混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（有吸附能力)，用純石油醚洗脫（淋洗）。色素受兩種作用力影響一種是CaCO3吸附，使色素在柱中停滯下來一種是被石油醚溶解，使色素向下移動各種色素結(jié)構(gòu)不同，受兩種作用力大小不同，經(jīng)一段時間洗脫后，色素在柱子上分開，形成了各種顏色的譜帶，這種分離方法稱為色譜法。Tsweet的實驗2.色譜法的發(fā)展1930年代初：R.Kuhn把M.Tswett的方法用于類胡蘿卜素的分離，從此色譜法得以廣泛應(yīng)用。1935年：Adams和Holmes第一次用苯酚和甲醛合成了人工有機離子交換劑，能交換陽離子和有機氫離子。后來又合成了陰離子交換劑，既可用于離子交換，又用于色譜分離——即現(xiàn)時流行的離子交換色譜法。至1950年此方法已成型。4.1.1色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展1938年：Izmailov等人將糊狀A(yù)l2O3漿液在玻璃板上鋪成均勻薄層，用于分離植物中的藥用成分，即今日用的薄層色譜。（用于薄層的材料已發(fā)展至多種：如硅酸、聚酰胺等）。1941年：Martin和Synge設(shè)計了兩套萃取儀器，將蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的乙?；被嵊伤芤褐刑崛〉接袡C相而進行色譜分離。不久又研究了顆粒硅膠柱中三種衍生化氨基酸混合物在水相和有機相(氯仿)之間的不等分配，獲得成功，使三個組分得到良好的分離,為液－液分配色譜奠定了基礎(chǔ)。1944年：Consden，Gordon和Martin將纖維（濾紙）作固定載體，以水吸附在濾紙上作溶劑，根據(jù)組分在兩相中溶解度不同，即滲透率（速率）不同而使各組分彼此分離，稱之為紙色譜法。1952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性載體表面涂漬一層均勻的有機化合物膜作為固定相，并以氣體為流動相，用來分離脂肪酸混合物——即今日的氣－液色譜。1954年：Ray提出以熱導(dǎo)池作為氣相色譜的檢測器，使氣相色譜應(yīng)用更加廣泛。1957年：Golay首先應(yīng)用小口徑毛細管柱進行色譜分離實驗，結(jié)果證明了它具有高分辨率和高效能——即為今日的高效氣相色譜法。1959年：Porath和Flodin提出了使用具有化學(xué)惰性的多孔凝膠作固定相的空間排阻色譜法，根據(jù)固定相孔隙尺寸不同而具有不同的選擇性滲透能力，從而對分子量分布不同的樣品實現(xiàn)了分離?？捎糜跍y定聚合物的相對分子質(zhì)量的的分布。我國情況我國在色譜分析領(lǐng)域的研究起于1954年中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所首先開發(fā)經(jīng)過幾十年的努力，我國色譜基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用技術(shù)研究方面具有特色，居世界領(lǐng)先行列。隨著被分離樣品種類的增多，該方法廣泛地用于無色物質(zhì)的分離，“色譜”名稱中的“色”失去了原有的意義，但“色譜”這一名稱沿用至今。1.色譜法混合物在流動相的攜帶下通過色譜柱分離出幾種組分的方法。4.1.2什么是色譜法2.色譜法中共使用兩相固定相—固定不動的相（如：CaCO3）固體吸附劑：CaCO3、Al2O3等液體固定相（載體+固定液——高沸點有機化合物，涂在載體上）流動相—推動混合物流動的相（如：石油醚）氣體1952年產(chǎn)生GC，是色譜法一項革命性進展液體流的速度慢，加壓，使其流快，1969年HPLC4.1.2什么是色譜法3.色譜分離法特征一定是先分離、后分析一定具有兩相：固定相和流動相分離：利用組分在兩相中分配系數(shù)或吸附能力的差異進行分離4.1.2什么是色譜法4.色譜法特點：（1）分離效能高（2）靈敏度高（3）分析速度快（4）應(yīng)用范圍廣4.1.2什么是色譜法1、按兩相狀態(tài)分類2、按操作形式分類3、按分離原理分類4.1.3色譜法分類（1）氣相色譜（2）液相色譜（3）超臨界液體色譜（1）柱色（2）紙色譜（3）薄層色譜（1）吸附色譜（2）分配色譜（3）離子交換色譜（4）凝膠色譜第四章色譜法4.1色譜分析法簡介4.2色譜圖及色譜常用術(shù)語4.3色譜法的基本理論4.4色譜定性和定量分析4.5氣相色譜法4.6高效液相色譜法4.2.1

色譜圖4.2.2

色譜常用術(shù)語4.2.3

根據(jù)色譜圖可得到的重要信息4.2色譜圖及色譜常用術(shù)語4.2.1

色譜圖混合物樣品（A+B）→色譜柱中分離→檢測器→記錄下來。組分從色譜柱流出時，各個組分在檢測器上所產(chǎn)生的信號隨時間變化，所形成的曲線叫色譜圖。記錄了各個組分流出色譜柱的情況，又叫色譜流出曲線1.基線在實驗操作條件下，色譜柱后沒有組分流出的曲線叫基線。穩(wěn)定情況下是一條直線基線上下波動稱為噪音4.2.1

色譜常用術(shù)語2.色譜峰的高度（峰高，h

）色譜峰最高點與基線之間的距離可用mm、mV、mA表示峰高低與組分濃度有關(guān)，峰越高越窄越好

h3.色譜峰的寬度(區(qū)域?qū)挾?標準偏差—σ峰高0.607倍處的色譜峰寬的一半。峰底寬Wb—色譜峰兩側(cè)拐點所作切線在基線上的距離Wb

=4σ半峰寬W1/2—峰高一半處色譜峰的寬度

W1/2

=2.354σWb=4σW1/2

=0.589Wb

WbσW1/2

4.色譜峰面積（A）色譜峰與峰底所圍的面積。對于對稱的色譜峰A=1.065hW1/2對于非對稱的色譜峰A=1.065h(W0.15+W0.85)/2

5.死時間t0不被固定相吸附或溶解的組分流經(jīng)色譜柱所需時間從進樣開始到柱后出現(xiàn)峰最大值所需時間氣相色譜—惰性氣體（空氣、甲烷等）流出色譜柱所需時間t06.保留時間tR

組分流經(jīng)色譜柱時所需時間。進樣開始到柱后出現(xiàn)最大值時所需的時間操作條件不變時，一種組分有一個tR定值定性參數(shù)7.調(diào)整保留時間t’R扣除了死時間的保留時間，又稱校正保留時間，實際保留時間。t’R=tR-t0體現(xiàn)的是組分在柱中被吸附或溶解的時間。t’R8.死體積V0不被固定相滯留的組分流經(jīng)色譜柱所消耗的流動相體積稱死體積，色譜柱中載氣所占的體積。V0=t0F0F0---柱后出口處流動相的體積流速mL/min9.保留體積VR

組分從進樣開始到色譜柱后出現(xiàn)最大值時所需流動相體積，組分通過色譜柱時所需流動相體積VR=tRF010.調(diào)整保留體積V’R扣除了死體積的保留體積，真實的將待測組分從固定相中攜帶出柱子所需的流動相體積。V’R=t’RF

011.相對保留值γi,s

在相同操作條件下，組分i對參比組分s調(diào)整保留值之比色譜保留值——定性的依據(jù)6.保留時間tR7.調(diào)整保留時間t’R

9.保留體積VR10.調(diào)整保留體積V’R

11.相對保留值γi

,s組分在色譜柱中停留的數(shù)值，可用時間t和所消耗流動相的體積來表示。組分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越強，在柱中滯留的時間越長，消耗的流動相體積越大固定相、流動相固定，條件一定時，組分的保留值是個定值。V0、t0與被測組分無關(guān)，因而V’R.t’R更合理地反映了物質(zhì)在柱中的保留情況。4.2.3根據(jù)色譜圖可得到的重要信息（1）色譜峰個數(shù)—判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)（2）色譜峰的位置即保留值—進行定性分析（3）色譜峰的h、A

—進行定量分析（4）色譜峰的位置及峰的寬度—可評價色譜柱效（分離效能）（5）色譜峰兩峰間的距離—可評價固定相或流動相選擇是否合適第四章色譜法4.1色譜分析法簡介4.2色譜圖及色譜常用術(shù)語4.3色譜法的基本理論4.4色譜定性和定量分析4.5氣相色譜法4.6高效液相色譜法色譜分析目的是將樣品中各組分彼此分離對樣品中的組分進行定性、定量分析組分達到完全分離，兩峰間的距離須足夠遠兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)K決定，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。兩峰間雖有一定距離，但若每個峰都很寬，彼此重疊，則峰不能分開峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴散行為決定，即與色譜過程的動力學(xué)性質(zhì)有關(guān)4.3色譜法的基本理論4.3.1

分配系數(shù)和分配比4.3.2

塔板理論4.3.3

速率理論—范第姆特方程4.3.4

分離度4.3.5

基本色譜分離方程4.3色譜法的基本理論在一定溫度下，組分在流動相和固定相之間所達到的平衡叫分配平衡，組分在兩相中的分配行為常采用分配系數(shù)K和分配比k來表示。

4.3.1分配系數(shù)和分配比K僅與兩個變量相關(guān)：固定相、溫度TK與兩相體積、管柱特性、使用儀器無關(guān)=cs/cm組分在固定相中的濃度組分在流動相中的濃度K=1.分配系數(shù)K(濃度分配系數(shù))4.3.1分配系數(shù)和分配比Cs和cm----組分在固定相和流動相中的濃度2.分配比k(容量因子，容量比)組分在固定相中的質(zhì)量組分在流動相中的質(zhì)量=KVs/Vm

k=

=ms/mm

k隨T、固定相、流動相的體積變化而變化k越大，組分在固定相中質(zhì)量越多，tR越長K、k越大，組分在固定相中tR就越長4.3.1分配系數(shù)和分配比ms和mm----組分在固定相和流動相中的質(zhì)量Vs和Vm----柱中固定相和流動相中的體積3.k與tR之間的關(guān)系k=t’R/t0=(tR-t0)/t0

k=V’R/V0=(VR-V0)/V04.3.1分配系數(shù)和分配比4.K及k與選擇因子α之間的關(guān)系4.3.1分配系數(shù)和分配比實際意義：α=1→K（B）=K（A）,t’R(B)=t’R(A)→A、B兩組分色譜峰重合→K或k相差越大，分離越好，→色譜分離先決條件：兩組分具有不同的K或k

α≠1（α>>1或α<<1）在50年代，色譜技術(shù)發(fā)展的初期，Martin等人把色譜分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經(jīng)驗理論－塔板理論用于色譜分析法用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標4.3.2塔板理論（1）在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可在兩相間迅速達到平衡，H稱為理論塔板高度，n=L/H

（2）以GC為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積△V。（3）所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。（4）K在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。1.基本假設(shè)4.3.2塔板理論（1）流出曲線及其方程設(shè)n=5,k=1,m=1（=ms+mm）2.塔板理論方程式4.3.2塔板理論（2）柱效評價（H,n）n與Wb

，W1/2

的關(guān)系n=L/H或H=L/n

L---色譜柱長度H---塔板高度n---塔板數(shù)目

H有效＝Ｌ／n有效

H理＝Ｌ／n理L固定，H越小，n越大，分離效果越好

H、n評價柱效

2.塔板理論方程式4.3.2塔板理論n有效=5.54(t’R/W1/2)2=16(t’R/Wb)2

n理=5.54(tR/W1/2)2

=16(tR/Wb)2

塔板理論的優(yōu)勢用熱力學(xué)觀點形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，并成功解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置提出了計算理論塔板高度、塔板數(shù)的公式及評價柱效的方法，具有開創(chuàng)性塔板理論的缺點基本假設(shè)不完全符合柱內(nèi)實際發(fā)生的分離過程，未考慮各種動力學(xué)因素對色譜柱內(nèi)傳質(zhì)過程的影響同一試樣進入同一色譜柱，當流動相速度變化時，得到不同色譜圖；測得的n和H也不同。1956年，荷蘭學(xué)者范第姆特(VanDeomter)提出吸收了塔板理論中的H概念。并充分考慮了組分在兩相同的擴散和傳質(zhì)過程，從而在動力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響H的各種因素方程:u為流動相線速度cm.s-1，線速度=L(柱長)/t01.理論模型---范第姆特方程

4.3.3速率理論提出了影響Ｈ的三項因素渦流擴散項A,分子擴散項B/u,傳質(zhì)阻力項Cu流動相流速一定，當Ａ、Ｂ、Ｃ最小時，Ｈ小，n最高，柱效高當Ａ、Ｂ、Ｃ最大時，Ｈ大，n最小，柱效低氣相色譜

uDskkdDdkkuDdHfgpgp])1(32)1(01.0[2222222+++++=gl液相色譜HuGC（a）LC（b）GC（a）——u有一最低點u最佳；u小或u大，H都大LC（b）——u沒有最低點；u大，H增大不多，因此可用較高的流速，提高分析速度（4）流動相線速度u對H的影響可測三種流速對應(yīng)的板高H，解三元一次方程，求出A、B、C即可求出u最佳和H最小。實際工作中，為縮小分析時間，可選略高u最佳的流速，常用２u最佳。BCACBCCBBACu最佳u最佳BAH2//+=++=++=最小CBu=最佳GC中最佳流速可通過實驗和計算方法求得1.為什么提出分離度概念？柱效能色譜柱在分離過程中的分離效能，常用n，Ｈ來描述,

對單個組分,n越大，Ｈ越小，柱效越高對多個組分，n大，Ｈ小，幾個峰未必分開選擇性描述兩個相鄰組分在同一固定相中熱力學(xué)分布行為用r2,1相對保留值表示.r2,1越大，保留時間相差大，分離越好（但未考慮峰寬因素）4.3.4分離度4.3.4分離度R1.為什么提出分離度概念？兩峰距離近，峰形寬，嚴重重疊表示選擇性和柱效都很差兩峰距離拉開，但峰形寬表示選擇性好，但柱效低兩峰距離拉開，且峰形窄而對稱表示選擇性好且柱效高單獨用選擇性或柱效不能真實反映組分在色譜柱中分離情況，需引入一個綜合性指標，其既能反映選擇性又能反映柱效4.3.4分離度R2.分離度（R）定義相鄰兩個峰的保留值之差與兩峰寬度平均值之比色譜柱的總分離效能指標分子反映溶質(zhì)在兩相中分配行為對分離的影響是色譜分離的熱力學(xué)因素。分母反映動態(tài)過程溶質(zhì)區(qū)帶的擴寬對分離的影響是色譜分離的動力學(xué)因素。兩溶質(zhì)保留時間相差越大，色譜峰越窄，分離越好Ｒ＜１.0兩峰有部分重疊Ｒ＝１.0分離程度達98%，能滿足分析要求Ｒ≥１.5兩個組分能完全分開1.基本色譜分離方程4.3.5基本色譜分離方程αα2.分離度與柱效能的關(guān)系4.3.5基本色譜分離方程柱效項塔板數(shù)決定，n越大，柱效越高分離越好２、分離度與選擇性的關(guān)系選擇性項r2,1越大，tR’２與t’R1

相差越大，分的越好4.3.5基本色譜分離方程3.分離度與柱容量的關(guān)系柱容量項k’大一些對分析有利太大，tR長柱容量合適，分的才好,一般1＜k’＜104.3.5基本色譜分離方程例題：在一定條件下，兩個組分的調(diào)整保留時間分別為85s和100s，要達到完全分離，即R=1.5。計算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長是多少？解：r2,1=100/85=1.18

n有效=16R2[r2,1/(r2,1—1)]2

=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（塊）

L有效=n有效·H有效=1547×0.1=155cm

即柱長為1.55米時，兩組分可以得到完全分離第四章色譜法4.1色譜分析法簡介4.2色譜圖及色譜常用術(shù)語4.3色譜法的基本理論4.4色譜定性和定量分析4.5氣相色譜法4.6高效液相色譜法4.4.1定性分析4.4.2定量分析4.4色譜定性和定量分析1.定性分析的任務(wù)

確定色譜圖上各個峰代表什么物質(zhì)4.4.1定性分析2.如何定性？（1）利用保留值與已知物對照定性I.利用純物質(zhì)或已知物質(zhì)保留時間定性II.利用峰高增量定性III.利用雙色譜系統(tǒng)定性（2）與其它分析儀器聯(lián)用進行定性4.4.1定性分析2.如何定性？（1）利用保留值與已知物對照定性I.利用純物質(zhì)或已知物質(zhì)保留時間定性4.4.1定性分析在相同色譜條件下，將標準物和樣品分別進樣，兩者保留值相同，可能為同一物質(zhì)此方法要求操作條件穩(wěn)定、一致，必須嚴格控制操作條件，尤其是流速2.如何定性？（1）利用保留值與已知物對照定性II.利用峰高增量定性若樣品復(fù)雜，流出峰距離太近，或操作條件不易控制，可將已知物加到樣品中，混合進樣，若被測組分峰高增加了，則可能含該已知物。4.4.1定性分析2.如何定性？

(2)與其它分析儀器聯(lián)用的定性方法小型化的臺式色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD4.4.1定性分析

1.定量分析的依據(jù)氣相色譜定量分析是根據(jù)檢測器對溶質(zhì)產(chǎn)生的響應(yīng)信號與溶質(zhì)的量成正比的原理，通過色譜圖上的峰面積或峰高，計算樣品中溶質(zhì)的含量。mi=fiAi

mi=fihi

mi---被測組分i的質(zhì)量，fi---比例系數(shù)Ai、hi---被測組分的峰面積及峰高4.4.2定量分析

2.峰面積測量方法mi=fiAi

mi=fihi對稱色譜峰A=1.065×h×W1／2

不對稱色譜峰A=1.065×h（W0.15＋W0.85）/24.4.2定量分析3.定量校正因子mi=fiAi

mi=fihi色譜定量分析是基于峰面積與組分的量成正比關(guān)系但同一檢測器對不同物質(zhì)具有不同的響應(yīng)值，即不同物質(zhì)檢測器的靈敏度不同，相同的峰面積并不意味著有相等的量。定量校正因子：單位峰面積對應(yīng)組分的質(zhì)量。絕對定量校正因子fi=mi/Ai受操作條件影響較大，要嚴格控制色譜條件，不易準確測定，沒有統(tǒng)一標準，無法直接引用。相對定量校正因子fi’樣品中各組分的定量校正因子與標準物的定量校正因子之比。

用一個標準，把所有組分的A較正到標準物的A上，在同一標準上進行比較計算，熱導(dǎo)檢測器常用苯作標準4.4.2定量分析相對定量校正因子fi相對質(zhì)量校正因子相對摩爾校正因子fi(M)凡文獻查得的校正因子都是指相對校正因子可用fM′,fm′分別表示摩爾和質(zhì)量校正因子4、定量方法

（1）歸一化法（2）內(nèi)標法（3）外標法4.4.2定量分析4.4.2定量分析4、定量方法（1）歸一化法把所有出峰組分的含量之和當作100%的定量分析方法稱為歸一化法前提：試樣各組分都出峰若樣品中有幾個組分，每個組分的量分解為m1m2…mn

各組分含量總和為m，則組分的質(zhì)量分數(shù)Wi為

優(yōu)點：簡便、準確、不需標準物，不必準確稱量和準確進樣，操作條件稍有變化對結(jié)果影響較少。缺點：所有組分都出峰，并測所有組分的A和fi′4.定量分析

（2）內(nèi)標法準稱樣品m（含mi被測組分）+準稱純物質(zhì)作內(nèi)標物ms混合物→進樣被測組分標樣(內(nèi)標物)4.4.2定量分析ssiisiAf′Af′mm=對內(nèi)標物的要求：1）內(nèi)標物應(yīng)是樣品中不存在的純物質(zhì)。2）內(nèi)標物與被測物的峰盡量靠近，但又能完全分開，tR相差少。為簡便起見，求定量校正因子時，常以內(nèi)標物本身作標準。fs

′=1.0內(nèi)標法優(yōu)點定量準確，操作條件不必嚴格控制，與進樣量無關(guān)，被測組分和內(nèi)標物出峰即可，適用于微量組分的測定，應(yīng)用廣泛。內(nèi)標法缺點每次測定都要準確稱量樣品和內(nèi)標物（2）內(nèi)標法

4.定量分析

（3）外標法—標準曲線法適用于：樣品中各組分不能完全流出，又沒有合適內(nèi)標時。4.4.2定量分析將待測組分的純物質(zhì)配制不同濃度的標準系列，在相同操作條件下，定量進樣，測各個峰的A或h，繪制A—C曲線或h—C曲線。CA(h)在完全相同條件下，測待測樣品，根據(jù)A待或h待，從曲線上查出待測組分含量。A(h)CA待C待優(yōu)點：操作簡單，計算方便，不用fi′缺點：要求準確進樣，操作條件穩(wěn)定。例題已知物質(zhì)A和B在一根30.00cm長的柱上的保留時間分別為16.40min和17.63