課題三血紅蛋白的提取和分離

1.知道凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子技術的基本原理。2.掌握血紅蛋白提取和分離的基本過程。（預習教材15分鐘）

學習目標思考1分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。思考2蛋白質的分離和提取的原理是什么？根據蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度和吸附的性質和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質。1．凝膠色譜法

(1)概念也稱做

，是根據

分離蛋白質的有效方法。分配色譜法相對分子質量的大小凝膠是什么？(2)原理

由

構成的凝膠，內部有許多貫穿的

。多孔球體通道1．凝膠色譜法

當

不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子質量

的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程

，移動速度

。而相對分子質量

的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在

移動，路程

，移動速度

，從而使相對分子質量不同的蛋白質分子得以

。相對分子質量較小較長較慢較大凝膠外部較短較快分離【例】

下圖中，可表示為相對分子質量不同的蛋白質在凝膠中的移動過程的是 ()B【鞏固】凝膠色譜法分離蛋白質的原理依據是 ()A．根據蛋白質分子與凝膠的親和力的大小B．根據蛋白質相對分子質量的大小C．根據蛋白質所帶電荷的多少D．根據蛋白質溶解度的大小B2.緩沖溶液1、作用：能夠抵制（）對溶液的（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值

在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是（），目的是利用緩沖液模擬細胞內的（），保證血紅蛋白的正常（），便于觀察紅色和材料的科學研究活性。磷酸緩沖液PH環(huán)境結構和功能2.緩沖溶液(1)概念指

在電場的作用下發(fā)生

的過程。(2)原理在一定的

下，多肽、核酸等生物大分子的可解離基團會帶上

或

，在電場的作用下，這些帶電分子會向著

的電極移動。帶電粒子遷移pH正電負電與其所帶電荷相反3．

電泳(3)作用電泳利用了待分離樣品中各種分子

的差異及分子本身的

、

的不同，使帶電分子產生不同的

，從而實現樣品中

。(4)方法常用的電泳方法有

和

。測定蛋白質分子量時通常使用

。帶電性質大小形狀遷移速度各種分子的分離瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳3．

電泳使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異[思維激活]

凝膠色譜法和電泳法在實現分子分離的原理方面有何不同？提示凝膠色譜法分離分子是依據分子質量大小，利用凝膠色譜柱使大分子優(yōu)先洗脫出來，而小分子后分離出來。電泳法分離分子則是依據各種分子帶電性質的差異，以及分子本身的大小，形狀不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現在電場中將各種分子分離。洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。血紅蛋白提取和分離的實驗操作

實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉1．蛋白質的提取和分離一般分為四步：

、

、

和

。A樣品處理及粗分離(1)紅細胞的洗滌采集血樣，

，吸取血漿后加

，再低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色。目的是除去雜質，以利于后續(xù)步驟的分離純化。血紅蛋白提取和分離的實驗操作

樣品處理粗分離純化純度鑒定低速短時間離心生理鹽水(2)血紅蛋白的釋放將洗滌好的紅細胞依次加入

至原血液體積、40%體積的

，置于磁力攪拌器上攪拌10min，使紅細胞吸水

，血紅蛋白釋放出來。(3)分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合液轉移到

中，以2000r/min的速度

10min。使血紅蛋白和其他雜質分離開，便于下一步對血紅蛋白的純化。蒸餾水甲苯漲破離心管離心血紅蛋白提取和分離的實驗操作

分離血紅蛋白溶液有機溶劑（無色透明的甲苯層）脂類物質（白色脂溶性物質沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細胞破碎物沉淀（暗紅色沉淀物）（4）透析(粗分離)a過程：b目的：c原理：除去樣品中分子量較小的雜質；用于更換樣品的緩沖液。透析袋能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內。B凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的制作：準備材料→加工橡皮塞→安裝

。(2)凝膠色譜柱的裝填。(3)樣品的

。色譜柱加入和洗脫血紅蛋白提取和分離的實驗操作

（2）凝膠色譜柱的裝填材料：

凝膠的前處理：交聯葡聚糖凝膠（G-75）配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。（2）凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。（3）樣品加入與洗脫①調節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）。（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A．加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內C．等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透