外顯子組測序在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

一外顯子組測序技術(shù)簡介二外顯子組測序流程三外顯子組測序信息分析內(nèi)容四外顯子組測序的應(yīng)用方案一、外顯子組測序技術(shù)簡介

外顯子組序列僅占全基因組序列的1%左右，與人類85%致病基因突變相關(guān)。與全基因組測序相比，外顯子組測序不僅費用較低，而且測序覆蓋度更深，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高。外顯子測序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后，再進行高通量測序的基因組分析方法。二、外顯子組測序流程基因組DNA的隨機打斷DNA片段的末端修復(fù)和接頭的連接PCR擴增文庫DNA液相探針雜交捕獲目的片段PCR擴增捕獲的DNA片段測序文庫的檢測HiSeq2500測序生物信息分析三、外顯子組測序信息分析流程主要信息分析內(nèi)容歸類3.1、數(shù)據(jù)過濾與評估3.2、整體質(zhì)量評估3.3、SNP檢測與注釋3.4、InDel檢測與注釋3.5、高級分析3.1、數(shù)據(jù)過濾與評估過濾接頭。對含接頭的reads去除接頭序列。一條reads上N（未能確定出具體的堿基類型）的比例大于5%，則過濾掉該reads。過濾低質(zhì)量reads，過濾掉Q30<85%reads。3.1.1、原始數(shù)據(jù)過濾3.1.2、測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與評估測序質(zhì)量值分布圖堿基含量分布圖3.2、整體測序質(zhì)量評估3.2.1、測序深度統(tǒng)計注：橫坐標(biāo)代表測序深度，縱坐標(biāo)代表目標(biāo)區(qū)域上對應(yīng)深度的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的百分比。目標(biāo)區(qū)域的單堿基分布近似服從泊松分布。3.2.2、外顯子捕獲統(tǒng)計TargetregionstatX1X2X3X4Length_of_target_region(Mb)1118.70118.70118.70118.70Reads_mapping_ref(singlereads)2182.95168.4897.7696.16Mapping_datasize(Mb)3137211263697769616Effective_sequences_on_target(Mb)592.0590.8666.8464.37Average_sequencing_depth_on_target747.3146.7543.0541.45Mismatch_rate_in_target_region8Mismatch_rate_in_all_effective_sequence9Base_covered_on_target(Mb)106904681566846437Coverage_of_target_region11Fraction_of_target_covered_with_at_least_20x12Fraction_of_target_covered_with_at_least_10x13Fraction_of_target_covered_with_at_least_4x14當(dāng)比對到參考基因組目標(biāo)區(qū)域的數(shù)據(jù)量在60%之上，認為外顯子捕獲效率合格。3.2.3、染色體覆蓋深度分布注：橫坐標(biāo)為染色體長度，縱坐標(biāo)為覆蓋深度取對數(shù)。3.3、SNP檢測及注釋3.3.1、SNP檢測SNP的檢測主要使用GATK軟件工具包實現(xiàn)。BMKIDSNPNumberTransitionNumberTransversionNumberTi/TvRatioHeterozygosityNumberHomozygosityNumberX19852546691723160822.11207400777854X28425165733992691172.13167179675337X3263326178220851062.0926436236890X4289954196145938092.0930446259508Total1556901TypeR01R02R03R04INTERGENIC449352380794113110125682INTRAGENIC34252896892975INTRON401739343966111218121865UPSTREAM244522135061056521DOWNSTREAM95551835652773230377UTR_3_PRIME395407112124UTR_5_PRIME21651891776850SPLICE_SITE_ACCEPTOR31361414SPLICE_SITE_DONOR61541921CDSNON_SYNONYMOUS_CODING19711899882925NON_SYNONYMOUS_START2100START_GAINED37834693100START_LOST8632STOP_GAINED2624108STOP_LOST5310SYNONYMOUS_CODING17721732923940SYNONYMOUS_STOP1100Other1068932183.3.2、SNP注釋3.3.3、突變特征突變頻譜圖注：橫坐標(biāo)為不同類型的突變，縱坐標(biāo)為不同類型突變對應(yīng)的頻率。3.3.3、突變特征突變位點上下文堿基偏好性注：橫坐標(biāo)為突變位點上下文的堿基位置，0為SNP突變位點，負數(shù)代表突變位點前的堿基，正數(shù)代表突變位點后的堿基，縱坐標(biāo)為不同堿基對應(yīng)的比例。從圖上可以看出，不同類型的SNP突變上下文具有不同的堿基偏好性。3.4、

InDel檢測及注釋3.4.1、

InDel檢測RegionR01R02R03R04TotalInsertion5168944234152331657392775Deletion57643510611670517840107838Heterozygosity89744788482858630639--Homozygosity195881644733523774--Total109332952953193834413200613TypeR01R02R03R04INTERGENIC48070416011357914755INTRAGENIC410337123117INTRON45413396821370114581UPSTREAM30602706759851DOWNSTREAM116331026535533851UTR_3_PRIME333174UTR_5_PRIME26524687106SPLICE_SITE_ACCEPTOR152364SPLICE_SITE_DONOR6833CDSCODON_DELETION151635CODON_INSERTION12502EXON_DELETED2672427393FRAME_SHIFT94922730CODON_DELETION151635CODON_INSERTION12502Other19241263.4.1、

InDel注釋3.5、高級分析3.5.1、基因融合注：最外圈表示人基因組及基因組上基因分布情況；文字代表發(fā)生基因融合的基因ID；紅色線條代表染色體間基因融合；綠色線條代表染色體內(nèi)基因融合。3.5.2、氨基酸替換預(yù)測ChrIDPosCodonsSubstitutionSNPTypePredictionGenechr1881627CTG-tTGL615LSynonymousTOLERATEDENSG00000188976chr111884555GAG-GgGE198GNonsynonymousTOLERATEDENSG00000011021chr112776344ATG-tTGM1LNonsynonymousTOLERATEDENSG00000188984chr112919111GAA-aAAE83KNonsynonymousDAMAGINGENSG00000120952chr116356501GCC-aCCA447TNonsynonymousTOLERATEDENSG00000186510注：

Codons：密碼子的變化情況；Substitution：氨基酸的替換信息；SNPType：SNP的類型；Prediction：預(yù)測結(jié)果(damaging/tolerated)，TOLERATED表示這個突變是可以容忍的，即對蛋白質(zhì)功能沒有影響或影響很小，DAMAGING表示突變是有害的，即對蛋白質(zhì)功能有較大影響；

Gene

：發(fā)生替換所在的基因。3.5.3、樣品間差異表達基因COG分類統(tǒng)計COG數(shù)據(jù)庫是基于細菌、藻類、真核生物的系統(tǒng)進化關(guān)系構(gòu)建得到的，利用COG數(shù)據(jù)庫可以對基因產(chǎn)物進行直系同源分類。注：橫坐標(biāo)為COG各分類內(nèi)容，縱坐標(biāo)為基因數(shù)目。在不同的功能類中，基因所占比例多少反映對應(yīng)時期和環(huán)境下代謝或者生理偏向等內(nèi)容，可以結(jié)合研究對象在各個功能類的分布作出科學(xué)的解釋。差異基因GO注釋聚類圖

topGO有向無環(huán)圖3.5.4、樣品間差異表達基因GO分類統(tǒng)計差異基因KEGG通路示意圖3.5.5、樣品間差異表達基因KEGG注釋四、外顯子組測序的應(yīng)用思路4.1WES找尋孟德爾疾病致病基因思路全外顯子測序Whole-exomesequencing分析及預(yù)測候選基因突變致病性Analysisandpredictcandidatecausativevariats生物學(xué)功能研究Functionalresearch在多個家系或散發(fā)病例中進行突變篩查研究Mutat