蛋白質(zhì)分子設計第一節(jié)分子設計概況第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設計第四節(jié)計算蛋白質(zhì)設計第五節(jié)基于結(jié)構(gòu)的藥物分子設計隨著理論化學方法六十年來不斷發(fā)展，加上近年來計算機技術突飛猛進，分子設計已經(jīng)從煉金術士的夢想走上實際的研究和應用。世界最大的二十家藥廠無一例外地運用分子設計的方法把藥物篩選的范圍縮小到原先的1/5到1/10。從電子結(jié)構(gòu)出發(fā)，設計具有特殊性質(zhì)的新材料、新化合物也開始走向現(xiàn)實。分子設計也稱為分子建模(MolecularModeling)，目前已經(jīng)成為有的外國大學化學系的課程。它包括理論化學方法和計算機化學方法。理論化學方法包括量子化學、統(tǒng)計熱力學和非平衡統(tǒng)計力學等。第一節(jié)分子設計概況Molecularmodelingisatechniqueforderiving,representingandmanipulatingthestructuresandreactionsofmolecules,andthosepropertiesthataredependentonthesethreedimensionalstructures.

■MolecularModeling的基本定義第一節(jié)分子設計概況“moleculargraphics“(分子制圖法)or”molecularvisualizations”(分子造影術)“computationalchemistry”(計算化學)“computationalquantumchemistry”(計算量子化學)“theoreticalchemistry”(理論化學)“molecularsimulation”relatestheuseofmolecularmodelingtechniquestodescribingandunderstandingthestatisticalbehaviorandpropertiesofmoleculesona“macroscopic”scale.(分子模擬)“Moleculardynamics”dealswiththosetime-dependentpropertiesofmolecules,andusesmanyofthetechniquesofmoleculemodelingandstatisticalmechanics(統(tǒng)計力學).■MolecularModeling的別稱第一節(jié)分子設計概況■AdvantagesofComputerModels第一節(jié)分子設計概況Geometricallyaccurate(onlylimitedbyknowledge)CapableofprecisemanipulationConformationalenergiesmaybecalculatedReadilysuperimposed(compareconformations,properties,volumes,etc)(容易疊加)Onemoleculemaybepositionedpreciselywithrespecttoasetofspacialrequirements(enzyme-substrate,activatedcomplex,etc)Easilyandconvenientlystored,edited,andduplicated■Typicalmodelingexercisescouldinvolve:

第一節(jié)分子設計概況Predictionandvisualizationofshape/propertiesComparisonofshape/propertiesExamination/predictionofmolecularinteractionsandreactionsInvestigationofunstableorexcitedmoleculesModelingofdynamicsystems(vibrations振動

diffusion擴散,conformationalchanges,reactions)■分子設計常用軟件第一節(jié)分子設計概況免費顯示軟件Rasmol,Resinhttp:///ck化學分子顯示及分子力學計算PCModelanonymousftp:under:/pub/software/PCModel分子設計軟件包Tinker–Softwaretoolsformoleculardesign

http:///tinker/Java-basedon-linebiomolecularmodelingpackage–Bhttp:///~nwhite/Biomer■ApplicationsofModeling第一節(jié)分子設計概況

NewdrugsChemicalsensorsandprobesChromatographicagents色譜分析試劑

Enzymes/Catalysts

Stereoselectivesynthesis立體選擇合成

PesticidesMicroelectronicsAdvancedmaterials…………■小結(jié)第一節(jié)分子設計概況分子設計歷史計算化學(量子化學,分子力學等)結(jié)構(gòu)化學(晶體學，譜學等)計算機技術(計算數(shù)學，軟硬件，數(shù)據(jù)庫，圖形學等)分子設計應用領域藥物設計(有機分子，多肽等)材料設計(固體，表面，晶體，高分子等)生物大分子設計(酶，蛋白質(zhì)等)其它(有機反應合成路線等)★分子設計只是一種工具，它不能代替實驗手段，更不能取代科學家的思考。比如一個科學家要設計一種具有新的催化性質(zhì)的酶，他必須了解催化過程及機理；了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)化學、生物化學等多方面的知識。因此蛋白質(zhì)設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密結(jié)合。

蛋白質(zhì)分子設計■蛋白質(zhì)設計（即蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能預測）及結(jié)構(gòu)與功能關系的研究非常必要

蛋白質(zhì)是一類非常有用的物質(zhì)與化學試劑相比，蛋白質(zhì)的分子量非常巨大，大多數(shù)不能通過化學方法生產(chǎn)專一性很強是蛋白質(zhì)一大優(yōu)點，但因此其應用范圍卻受到影響分子生物學的發(fā)展克服了上述缺點。特別是定位突變及PCR使得蛋白質(zhì)可能工程化，但用隨機方法從事蛋白質(zhì)工程研究的效率非常低

它涉及材料科學、化學、生物學、物理及計算機科學等。蛋白質(zhì)設計涉及藥物、食品工業(yè)用酶、污水處理、化學合成、疫苗、生物傳感器等，設計的蛋白質(zhì)不僅限于22種天然氨基酸，也可以包括非天然氨基酸以及有機/無機模板等?！龅鞍踪|(zhì)設計是多學科的交叉領域蛋白質(zhì)分子設計■蛋白質(zhì)設計的目的一是為蛋白質(zhì)工程提供指導性信息；二是探索蛋白質(zhì)的折疊機理。蛋白質(zhì)設計分為基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計及全新蛋白質(zhì)設計或蛋白質(zhì)從頭設計(proteindenovodesign）。設計的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨特性及明顯的功能優(yōu)越性。所有設計的蛋白質(zhì)有正確的形貌、顯著的二級結(jié)構(gòu)及合理的熱力學穩(wěn)定性，但一般說來它們?nèi)壗Y(jié)構(gòu)的確定性較差■蛋白質(zhì)設計目前存在的問題

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計即使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)已知，選擇一個合適的突變體依然困難，這說明蛋白質(zhì)設計任務的艱巨性，它涉及多種學科的配合，如計算機模擬專家、X射線晶體學家、蛋白質(zhì)化學家、生物技術專家等的合作與配合。

★1.蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)知識對于蛋白質(zhì)工程絕對必要

目前PDB(ProteinDataBank)已收集數(shù)以萬計個蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，但是通常蛋白質(zhì)序列的數(shù)目比蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的數(shù)目大100倍。當我們開始對某一天然蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)分子設計時，首先要查找PDB了解這個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是否已被收錄。如果PDB中沒有收錄又未見文獻報道，則需要通過蛋白質(zhì)X射線晶體學及NMR方法測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，或者通過結(jié)構(gòu)預測的方法構(gòu)建該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。

■一、概述●在蛋白質(zhì)設計開始之前，要對所要求的活性進行篩選●篩選以及純化蛋白質(zhì)需要進行細致的表征，測定它們的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等

●專一性突變產(chǎn)物是蛋白質(zhì)設計成敗的關鍵

●計算機模擬技術在蛋白質(zhì)設計循環(huán)中占有重要位置。建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變位點或區(qū)域以及預測突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對蛋白質(zhì)工程至關重要

●在明確突變位點或蛋白質(zhì)序列應改變的區(qū)域后，可以進行定位突變，但要得到具有預期結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)是不容易的，可能需要經(jīng)過幾輪的循環(huán)

★2.蛋白質(zhì)分子設計流程第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計★3.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關系對于蛋白質(zhì)工程及蛋白質(zhì)分子設計都至關重要如果我們想改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)，必須改變蛋白質(zhì)的序列。Hartley等于1986年完成了一個我們所要的設計目標及解決的辦法，如下表所示。該表至今仍有重要的參考價值。

◆蛋白質(zhì)設計的目標及解決辦法

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計①從天然蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)出發(fā)（實驗測定或預測），利用計算機模擬技術確定突變位點及替換的氨基酸。這是非常關鍵的步驟，一般應注意幾個問題。②利用能量優(yōu)化及蛋白質(zhì)動力學方法預測修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。③預測的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關知識及理論計算預測新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)。

在上述設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新的蛋白質(zhì)。注意★4.蛋白質(zhì)突變體的設計步驟第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計a應確定對蛋白質(zhì)折疊敏感的區(qū)域，這些區(qū)域包括帶有特殊扭角的氨基酸（例如cis-脯氨酸、帶正的的甘氨酸或天冬氨酸）、鹽橋、密堆積區(qū)等。b應確定對功能非常重要的位置，這些可以從結(jié)構(gòu)與功能關系、生物化學或蛋白質(zhì)工程實驗及結(jié)構(gòu)上來考慮。c應該考察剩余位置對所希望改變的影響。d當進行互換或插入/刪除殘基時應考慮它們對結(jié)構(gòu)特征的影響，如疏水堆積、側(cè)鏈取向、氫鍵、鹽橋等。同時也應考慮它們對蛋白質(zhì)功能的影響。互換或插入刪除區(qū)域一般都在外環(huán)。有如下一些假設：氨基酸側(cè)鏈的改變不會影響核主鏈折疊的改變，插入刪除某些部分不會影響表面區(qū)域，側(cè)鏈交換遵守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守原則?！?.

蛋白質(zhì)突變體的設計

返回第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計①內(nèi)核假設。所謂內(nèi)核是指蛋白質(zhì)在進化中保守的內(nèi)部區(qū)域。在大多數(shù)清況，內(nèi)核由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)單元組成。一個非常簡單和有用的關于蛋白質(zhì)折疊的假設是，假定蛋白質(zhì)獨特的折疊形式主要是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用所決定。②所有蛋白質(zhì)內(nèi)部都是密堆積（很少有空穴大到可以結(jié)合一個水分子或惰性氣體），并且沒有重疊。這個限制是由兩個因素造成的。第一個因素是分子是從內(nèi)部排出的，這是總疏水效應的一部分；第二個因素是由原子間的倫敦色散力所引起的，是由于短吸引力的優(yōu)化?！龆⒌鞍踪|(zhì)設計原理

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計③所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈及側(cè)鏈）。蛋白質(zhì)的氫鍵形成涉及一個交換反應，溶劑鍵被蛋白質(zhì)鍵所替代。隨著溶劑鍵的斷裂所帶來的能量損失是由折疊狀態(tài)的重組以及可能釋放一個結(jié)合的水分子而引起的熵的增益來彌補。

④疏水與親水基團需要合理地分布在溶劑可及表面與不可及表面。這種分布代表了疏水效應的主要驅(qū)動力。這種分布的正確設計不是簡單地使暴露殘基親水、使埋藏殘基疏水。至少有兩種原因使圖像復雜化。首先，側(cè)鏈不總是完全地親水，例如賴氨酸有一個帶電的胺基，但是連接到主鏈上的碳原子是疏水的。因此在建模過程中要在原子水平上區(qū)分側(cè)鏈為疏水及親水部分。第二，正確的分布是要安排少許疏水基團在表面，少許親水基團在內(nèi)部。■二、蛋白質(zhì)設計原理

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計⑤在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。這要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。⑥對于金屬蛋白，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用很重要。大部分配基含有多于一個與金屬作用或形成氫鍵的基團。如果一個功能基團與金屬結(jié)合，另幾個功能基團可以自由地采取其他的相互作用方式。例如，組氨酸中的咪唑可以與Nε或者Nδ成鍵，另外可以形成氫鍵。總結(jié)金屬蛋白的結(jié)構(gòu)表明，這些第二基團總是參與圍繞金屬中心的氫鍵網(wǎng)絡。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質(zhì)主鏈的相互作用，有時也參與同側(cè)鏈或水分子的相互作用。(這些相互作用起到兩個作用。第一、符合蛋白質(zhì)折疊的熱力學要求；第二、這些氫鍵固定在空間的配位位置。)

■二、蛋白質(zhì)設計原理

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計⑦最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列。蛋白質(zhì)中側(cè)鏈構(gòu)象是由空間兩個立體因素所決定。首先側(cè)鏈構(gòu)象是由旋轉(zhuǎn)每條鏈的立體勢壘所決定，其擇優(yōu)構(gòu)象可以通過實驗統(tǒng)計測量，也可以由第一原理計算得到。第二個因素是由氨基酸在結(jié)構(gòu)中的位置所決定。蛋白質(zhì)內(nèi)部的密堆積表明在折疊狀態(tài)側(cè)鏈構(gòu)象只能采取一種合適的構(gòu)象，即一種能量最低的構(gòu)象。⑧結(jié)構(gòu)及功能的專一性。形成獨特的結(jié)構(gòu)，獨特的分子間相互作用是生物相互作用及反應的標志。實踐表明這是蛋白質(zhì)設計最困難的問題。要構(gòu)筑一個蛋白質(zhì)模型必須滿足所有的合適的幾何要求，同時滿足蛋白質(zhì)折疊的幾何限制。因為蛋白質(zhì)是一個復雜的體系，體系有可能采取一個能量與所希望狀態(tài)相近的另外一個構(gòu)象。因此在設計程序中必須引入一個特征，它穩(wěn)定所希望的狀態(tài)，而不穩(wěn)定不希望的狀態(tài)，這也是最困難的計算機模擬技術之一。■二、蛋白質(zhì)設計原理

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構(gòu)，熱力學及功能性質(zhì)之間的關系是目前廣泛關注的熱點。它對于蛋白質(zhì)工程及蛋白質(zhì)設計都非常重要。這方面的研究有助于基于序列和三維結(jié)構(gòu)信息預測蛋白質(zhì)的功能以及序列的改變?nèi)绾斡绊懙鞍踪|(zhì)的功能，增加設計具有預定結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)的能力。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的認識過程始于蛋白質(zhì)中重要功能殘基及蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的確定。通過定位突變替換單獨的氨基酸殘基是分析功能殘基的有力工具。選擇突變殘基，最重要的信息來自結(jié)構(gòu)特征。

■三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計定位突變可以在蛋白質(zhì)中引入特殊的替代氨基酸并顯示蛋白質(zhì)功能的損失及變化。因此它是鑒定蛋白質(zhì)功能殘基的重要手段。對于蛋白質(zhì)中某些已經(jīng)通過結(jié)構(gòu)及生物化學實驗證明其功能重要性的殘基，通過定位突變可以探測它們的作用機理。這些研究為認識蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及酶催化的本質(zhì)提供理論基礎，也為蛋白質(zhì)工程及蛋白質(zhì)設計提供依據(jù)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關系研究也可用于藥物開發(fā)。根據(jù)上述目的，可以進行3類突變：插入一個或多個氨基酸殘基，刪除一個或多個氨基酸殘基，替換或取代一個或多個氨基酸殘基。最大量的定位突變是在體外利用重組DNA技術或PCR方法。

■三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計對于三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)經(jīng)過X射線測定或NMR譜測定的蛋白質(zhì)，可以根據(jù)氨基酸來推測專一性殘基的功能作用。如果蛋白質(zhì)與它們的抑制劑、輔酶及受體的三維結(jié)構(gòu)是已知的話，這個方法就更有價值。可以根據(jù)蛋白質(zhì)上的氨基酸與配件上的受體基團間的距離與取向決定它們之間形成的氫鍵、離子對或疏水相互作用。這樣的殘基通過定位突變?nèi)〈?，能夠證實某一殘基對鍵合過程的參與以及每一個相互作用對復合物結(jié)構(gòu)的貢獻。這樣的研究是認識專一性及酶催化的基礎。這種分析方法的一個例子是酪氨酰-tRNA

合成酶的分析。

■三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究

★1.根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計在酪氨酰tRNA合成酶中Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，當其被結(jié)構(gòu)相似的Ser(19)所取代后，酶的活性降低，證實了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。此后高分辨率的酶結(jié)合酪氨酰腺苷酸晶體結(jié)構(gòu)表明在酶與底物之間可能存在11條氫鍵。每個氫鍵基團都經(jīng)過突變實驗證實了它們對于催化功能的貢獻。

■三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究

★1.根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計隨著克隆基因數(shù)據(jù)庫的增加，根據(jù)與其他蛋白質(zhì)的序列對比確定蛋白質(zhì)中的功能域已成為可能。每個殘基所起作用的信息能夠來自不同種同源蛋白的序列比較或一類具有相應活性的蛋白質(zhì)的序列比較。同源蛋白質(zhì)的保守殘基是保持那類蛋白質(zhì)共同的功能或者是維持共同結(jié)構(gòu)的關鍵因素。相反，在一類蛋白質(zhì)內(nèi)變化的殘基對結(jié)構(gòu)及功能不重要，但涉及在分子識別中起作用的專一性。這兩個假設已經(jīng)用于指導位點突變分析蛋白質(zhì)。三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究

★2.利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計隨機突變、刪除分析以及連接片段掃描突變(linkerscanningmutagenesis)等實驗方法可用于鑒定功能殘基。隨機突變技術分析蛋白質(zhì)功能的優(yōu)點是用一種簡單方法就可產(chǎn)生突變體。然而，因為對于突變沒有控制，因此必須進行大規(guī)模的突變產(chǎn)生大量的可解釋的數(shù)據(jù)。一個通過隨機突變分析基因序列的例子是HIV-1蛋白酶。蛋白酶的99個殘基的編碼區(qū)的每個殘基用不同的氨基酸替換，得到33個突變體，平均每個殘基有3.3個替代物。如圖2-5。

三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究★3.其他實驗方法鑒定功能殘基

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計82位置纈氨酸被疏水殘基(Ile,Leu,Phe)或小的中性殘基(Ala,Thr)的取代對蛋白質(zhì)的功能沒有產(chǎn)生有害的影響，而非保守殘基(Asp或Gly)的置換沒有可容忍性。又如基于位置9的脯氨酸用Thr、His及Arg替代沒有可容忍性，說明它是重要的。用Ser(典型的保守殘基)替代對活性沒有影響，說明這個位置結(jié)構(gòu)靈敏而不涉及蛋白酶的活性。三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究★3.其他實驗方法鑒定功能殘基

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計刪除分析以及連接片段掃描突變是另一個鑒定功能殘基的重要方法。這些突變涉及在整個基因位置刪除或插入小數(shù)目的核苷酸，可以通過重組DNA技術構(gòu)建。利用能識別序列內(nèi)的多重位點的限制酶部分降解基因，并分離得到在單一位點被切斷的線性片段。為了進行分散插入小的DNA片段，常常合成一個有限位點的片段(linkers)，可以把它配位到斷開位置。為了建立分散刪除，在重新配位形成之前用外核酸酶降解DNA，目標是快速掃描編碼序列的長度以及鑒定重要功能區(qū)域，然后可以進行單一氨基酸替換的更仔細分析。這兩種技術已經(jīng)非常成功地用于確定在基因調(diào)控區(qū)域的DNA序列單元。這些方法也可用于蛋白質(zhì)的分析。三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究★3.其他實驗方法鑒定功能殘基第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計這些技術在描繪蛋白質(zhì)功能域的邊界以及決定整個多功能蛋白質(zhì)域的結(jié)構(gòu)非常有效。例如HIV逆轉(zhuǎn)錄酶p66亞單元，它可分為p51和p15兩個更小的亞單元，用連接插入突變分析p66亞單元。掃描刪除分析曾用于鑒定鼠和人的粒狀白細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的重要活性區(qū)域。GM-CSF的功能是刺激造血細胞的增殖。通過突變在5個氨基酸的間隔里刪除3個氨基酸。然后在大腸桿菌中表達以及檢測它們刺激骨髓細胞線的增殖能力。與天然的GM-CSF比較，大多數(shù)的刪除使活性完全喪失，只有很少幾個刪除保持中等的活性。

三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究★3.其他實驗方法鑒定功能殘基第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計對于功能分析，最重要的是數(shù)據(jù)的解釋。在數(shù)據(jù)分析中，如何區(qū)別功能殘基替換引起的效應及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化引起的效應是所有突變分析中共同存在的困難。對于三維結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)這個問題特別嚴重，因為不能確定殘基的立體位置與周圍結(jié)構(gòu)環(huán)境，殘基對溶劑的暴露程度以及同附近殘基的相互作用。雖然有幾種方法可以探測突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)整體性質(zhì)，但沒有一種方法是滿意的。在某些情況，溶解度與突變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定表達可以作為結(jié)構(gòu)整體性的一個標志，因為突變可能破壞蛋白質(zhì)的球形整體結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)失活、不溶以及在細胞中降解。利用分析一系列構(gòu)象靈敏的單克隆抗體的結(jié)合能力可以探測突變蛋白的構(gòu)象變化。

■三、蛋白質(zhì)設計中的結(jié)構(gòu)-功能關系研究

第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設計分子剪裁是指在對天然蛋白質(zhì)的改造中替換1個肽段或一個結(jié)構(gòu)域。Winter等將分子剪裁技術成功用于抗體分子的改造。他們將小鼠單克隆抗體分子重鏈的互補決定子用基因操作方法插到人的抗體分子的相應部位上，使得小鼠單抗分子所具有的抗原結(jié)合專一性轉(zhuǎn)移到人的抗體分子上。這項實驗有重要的醫(yī)學價值。一個小的天然蛋白質(zhì)重新設計成功的例子是Rop，一個反平行四螺旋束。它不是經(jīng)過簡單的點突變，而是通過肽段剪裁。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能對殘基的替換有一定的容忍度，即結(jié)構(gòu)與功能關系有一定的穩(wěn)健度。例如Fersht等替換了barnase的所有內(nèi)核殘基，結(jié)果表明23％的突變體保留了酶的活性。

■四、天然蛋白質(zhì)的剪裁

第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設計在原子水平認識蛋白質(zhì)折疊問題對于認識生命過程和設計具有新奇結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的蛋白質(zhì)有重要意義。這個領域的工作涉及了解決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的基本物理、化學規(guī)律以及蛋白質(zhì)折疊過程與步驟。全新蛋白質(zhì)設計正是實現(xiàn)這個目標的重要途徑。全新蛋白質(zhì)設計也稱反折疊研究，它是根據(jù)所希望的結(jié)構(gòu)及功能設計序列。蛋白質(zhì)的功能是直接與它的三維結(jié)構(gòu)相關的，通過序列的改變來操縱結(jié)構(gòu)提供功能的多樣性?；谔烊坏鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)改造的蛋白質(zhì)工程可以優(yōu)化蛋白質(zhì)的活性，改善它們的藥效動力學性質(zhì)。而全新蛋白設計是另一類蛋白質(zhì)工程，它合成具有新奇結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì)。■一、引言第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設計折疊問題與反向折疊問題息息相關，但解決問題的途徑是有差別的。蛋白質(zhì)設計對于蛋白質(zhì)折疊及反向折疊要回答的關鍵問題是多少及哪一個序列能折疊為確定的構(gòu)象具有預想的性能。這是一項在序列空間搜索結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及功能特殊的序列。蛋白質(zhì)工程工作者所面臨的困難問題是如何選擇哪一個序列作為合成的目標。選擇序列的一個方法是基于生物進化，另一方法是基于全新蛋白質(zhì)設計，根據(jù)穩(wěn)定不同類型蛋白質(zhì)的相互作用力來設計不同類型的蛋白質(zhì)。這些方法已取得明顯的進展。例如，離子通道納米管、血紅素結(jié)合蛋白、氧化還原活性蛋白質(zhì)、DNA結(jié)合蛋白及基于蛋白質(zhì)的高分子材料。蛋白質(zhì)的全新設計包括從頭結(jié)構(gòu)設計和從頭功能設計。

■一、引言第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設計設計一個新奇的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的中心問題是設計一個具有穩(wěn)定及獨特的三維結(jié)構(gòu)的序列。要達到這個目標需要克服的基本障礙是線性聚合鏈的構(gòu)象熵。例如，如果在具有100個殘基的蛋白質(zhì)中每個殘基采取10個可能構(gòu)象中的一個構(gòu)象，則這條鏈折疊成為確定的三維構(gòu)象所消耗的熵是RTln10100＝568.48kJ/mol。這個數(shù)字代表不合適的自由能的真實的量。因此要實現(xiàn)正確的折疊必須借助于許多合適的相互作用，要使一個序列能折疊為確定的三維結(jié)構(gòu)，設計的相互作用能必須超過構(gòu)象熵?？梢圆捎貌煌牟呗赃_到這個目標。最主要是使相互作用的強度與數(shù)目達到最大。另一個策略是通過共價交叉連接減小折疊的構(gòu)象熵。根據(jù)第一原理設計一個蛋白質(zhì)，我們必須依賴于分析已知結(jié)構(gòu)的天然蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)單元。

■二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計

一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)α－螺旋β－折疊第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設計分析已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可以認為復雜的三級折疊和四級結(jié)構(gòu)可以分解為有數(shù)的二級結(jié)構(gòu)單元，例如螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角，它們通過loop連接為三級結(jié)構(gòu)。特殊折疊的穩(wěn)定性是由一定距離殘基間非鍵相互作用決定的。全新蛋白質(zhì)設計要求很好地認識蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的規(guī)律。在了解殘基形成二級結(jié)構(gòu)單元的傾向性后，要安排殘基的最大的疏水相互作用形成一個緊密的疏水內(nèi)核。離子相互作用及氫鍵可以進一步用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。另外一種途徑是根據(jù)主鏈的構(gòu)象限制設計二級結(jié)構(gòu)。

■二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計

★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝★2.

配體誘導組裝★3.通過共價交叉連接實現(xiàn)肽的自組裝■二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設計★4.在合成模板上肽的組裝★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)★6.基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設計二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計設計新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的最簡單、最直接的策略是合成單一二級結(jié)構(gòu)單元(α-螺旋或β-折疊股)作為多肽鏈的片段的模塊途徑，然后復制這些二級結(jié)構(gòu)片段并把它們連接為整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通常，這些二級結(jié)構(gòu)是兩親性的。疏水表面埋藏在內(nèi)核形成緊密的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，如圖2-7所示。★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

模塊方法有幾個特點，使它成為蛋白質(zhì)設計有吸引力的第一步。這個方法最大的優(yōu)點是無論從設計或合成角度來看，它都是簡單的。在自組裝的模塊結(jié)構(gòu)中，關鍵的設計步驟是二級結(jié)構(gòu)單元。模塊途徑另一優(yōu)點是容易合成。α-螺旋或β-折疊股可以通過固相合成儀直接大量合成。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計模塊方法的簡單也限制了它作為蛋白質(zhì)設計一般方法的能力。二級結(jié)構(gòu)模塊自組裝蛋白與單鏈天然類蛋白比較有如下幾個缺點：最突出的缺點涉及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。正像前面所描述的情況，蛋白質(zhì)設計最主要障礙是非折疊態(tài)隨機波動的構(gòu)象熵。在結(jié)構(gòu)設計的情況下，幾個非連接鏈的自組裝形成一個獨特的結(jié)構(gòu)，它的熵消耗大于單肽鏈折疊的熵的消耗。通過分子間相互作用結(jié)合形成的任何結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性都必須依賴于濃度，這明顯區(qū)別于單鏈蛋白質(zhì)（天然的或設計的）。它們的折疊靠分子內(nèi)的相互作用，其穩(wěn)定性不依賴于濃度。模塊方法的另一缺點就是結(jié)構(gòu)的簡單重復。它比大多數(shù)天然蛋白質(zhì)有更大的重復性及對稱性。盡管有上述缺點，但模塊設計模擬了天然蛋白質(zhì)共同的結(jié)構(gòu)與熱力學特征，因此它代表了蛋白質(zhì)從頭設計的一個重要手段。

★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計α螺旋是一個吸引人的建筑模塊。因為α螺旋通過氫鍵達到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，單一α螺旋在溶液中是穩(wěn)定的。系統(tǒng)的研究已經(jīng)取得穩(wěn)定螺旋構(gòu)筑的規(guī)律。螺旋設計使用的策略包括：①使用形成螺旋傾向性較大的殘基，如亮氨酸、谷氨酸或賴氨酸等；②使用合適的基團去除端基的電荷，防止與螺旋偶極不合適的電荷相互作用；③使用極化或荷電氨基酸引入穩(wěn)定的氫鍵或在螺旋中相隔一圈殘基間的離子相互作用；★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計④使用在螺旋中相隔一圈的殘基間疏水的（脂肪的或芳香的）范德華相互作用；⑤使用芳香荷電或芳香硫的相互作用。最簡單的在自然界觀察得到的α螺旋結(jié)構(gòu)是coiled-coil以及四螺旋束。這些結(jié)構(gòu)在全新蛋白質(zhì)領域也是首次通過模板方法設計成功。表2-2列出了可溶于水、已經(jīng)用X射線或NMR測定的超二級結(jié)構(gòu)?！?.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計四螺旋束在全新蛋白質(zhì)設計中占有獨特的位置。螺旋束的熱力學及結(jié)構(gòu)規(guī)律相當普通，它們已被應用到2螺旋束、3螺旋束、4螺旋束以及n螺旋束的設計中。在結(jié)構(gòu)形成過程中，不合適的構(gòu)象熵由來自非共價相互作用補償。這些非共價相互作用包括氫鍵、電荷電荷、疏水相互作用。螺旋束是基于兩親螺旋，它們的聚集主要是基于疏水相互作用提供足夠的結(jié)合能量去驅(qū)動折疊平衡。埋藏疏水殘基獲得的結(jié)合能約為21MJ/nm2。在熱力學研究中的一個規(guī)則是：對于多肽鏈的折疊，折疊態(tài)的自由能小于非折疊態(tài)幾十kJ/mol，不合適折疊熵的作用會逐步由結(jié)合足夠數(shù)目的疏水殘基所克服。如16殘基中包括4個疏水殘基就可以驅(qū)動一個疏水過程。相反，電荷-電荷相互作用不能單獨提供結(jié)合能引起序列折疊?！?.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計coiled-coil是一相對簡單的模型體系，已經(jīng)有不少研究組在結(jié)構(gòu)與設計方面做了出色的工作。coiled-coil結(jié)構(gòu)是2個到4個α螺旋彼此以平行或反平行堆積在一起，螺旋的交叉角接近20°。Crick、Pauling以及Corey于1953年指出，如果兩條螺旋彼此成20°的角度傾斜相交，彼此間盤繞，最后結(jié)構(gòu)的每一圈就包括3.5個殘基。這與正常的α螺旋每圈3.6個殘基稍有差別。這種差別對于蛋白質(zhì)設計是有意義的。當周期是3.5個殘基時，整個結(jié)構(gòu)是每7個殘基重復一次。因此，coiled-coil讓結(jié)構(gòu)設計可以簡化為設計一個7個殘基鏈的重復。Hodges及其合作者設計了一批由簡單7肽重復組成的coiled-coil結(jié)構(gòu)并研究了它們的重復特征。

★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

圖中序列設計要求同時穩(wěn)定α螺旋二級結(jié)構(gòu)以及雙條螺旋間的相互作用。亮氨酸在2位和5位提供一個疏水界面，賴氨酸及谷氨酸在l位和6位主要提供螺旋間的離子相互作用。圖2-8所示的7殘基序列的幾個重復片段的結(jié)構(gòu)由圓二色散射測定表明形成了coiled-coil結(jié)構(gòu)，而且設計并合成得到的結(jié)構(gòu)比序列類似的天然原肌凝蛋白中相應的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計簡單的7肽重復的設計的成功在于產(chǎn)生了所希望的結(jié)構(gòu)。Hodges等鑒定了它們對于增加或減小穩(wěn)定性的特征。首先探討鏈長度的影響。合成不同長度的重復7肽，比較結(jié)果表明，在這個體系中，至少要求含有29個殘基才能自組裝為coiled-coil。第二步，探討在二聚界面改變疏水接觸的影響。他們合成了由5個7肽組成的肽，在中心7肽2位、5位置的Leu被Ile、Val、A1a、Phe或Tyr所取代。除Phe和Tyr外，coiled-coil的穩(wěn)定性還與殘基的疏水性有關(疏水性Leu>Ile>Val>Ala)。Phe和Tyr雖然有非常強的疏水性，可能是因為結(jié)構(gòu)的立體障礙問題，所以它們的替換不增加穩(wěn)定性。最后，進一步探討在兩個α螺旋之間增加一個二硫橋是否能增加穩(wěn)定性。他們通過蛋白質(zhì)工程在幾個天然蛋白質(zhì)中引人二硫橋。實驗證明這種策略有助于加強蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。他們合成了一個半胱氨酸在第2個位置的序列，他們發(fā)現(xiàn)引入鏈間的二硫橋能穩(wěn)定coiled-coil?！?.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計然而他們也發(fā)現(xiàn)一些意外的結(jié)果。通過二硫橋增加穩(wěn)定性的程度依賴于設計序列本身的穩(wěn)定性。沒有二硫橋的coiled-coil的穩(wěn)定性愈大，則二硫橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性的貢獻愈大。例如，一個含有亮氨酸在所有界面位置的coiled-coil，二硫鍵能增加穩(wěn)定性13.81kJ/mo1。然而當在接觸位置有兩個亮氨酸被苯丙氨酸所取代時，肽的穩(wěn)定性降低，此時形成二硫鍵僅增加5.02kJ/mol的穩(wěn)定性。看來，二硫鍵的形成增加了coiled-coil的剛性，因此妨礙了苯丙氨酸取代亮氨酸后的穩(wěn)定性。這些實驗建議盡管二硫鍵的設計能增加新蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，但是二硫鍵的立體及幾何環(huán)境必須小心考慮。★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計以上介紹的是設計形成均一的二聚體。O’shea等從頭設計了異二聚體coiled-coil。他們設計了兩個肽，稱為ACIP-p-l及BASE-p-l。在異二聚體中，分子間的鹽橋可以穩(wěn)定復合物結(jié)構(gòu)。而在均二聚體中這些有利的相互作用被相同電荷的排斥所取代。純化后的肽的表征表明，形成異二聚體的傾向大于均二聚體至少100000倍。pH值及離子強度研究也表明形成異二聚體的傾向性大得多，這也是因為均二聚體的靜電的不穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明，成功的蛋白質(zhì)設計不僅依賴于所希望結(jié)構(gòu)的“正設計”，也依賴于替代競爭結(jié)構(gòu)的“負設計”。★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計是什么決定coiled-coil的寡聚狀態(tài)呢？①疏水性殘基在coiled-coil結(jié)構(gòu)螺旋間的接觸中起調(diào)節(jié)作用。②還必須考慮側(cè)鏈間的特殊的相互作用。③通過對GCN4亮氨酸拉鏈(GCN4leucinezipper)突變體的仔細研究，殘基的接觸決定coiled-coil肽的寡聚態(tài)。

★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計上述結(jié)果顯示一個圍繞設計策略的重要特征是依賴于二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝。因為獨立單元不直接連接到多肽鏈，寡聚的組裝狀態(tài)是由側(cè)鏈相互作用所決定的，因此，通過模塊肽組裝設計全新蛋白質(zhì)必須仔細設計適合于所希望的寡聚狀態(tài)以及不合適的競爭替代。除coiled-coil外，在天然蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的最簡單α螺旋模體是四螺旋束。四螺旋束同coiled-coil一樣有助于模塊設計策略，即利用二級結(jié)構(gòu)單元自組裝為完整的結(jié)構(gòu)。DeGrado及其合作者很成功地利用這個策略設計出非常穩(wěn)定的四螺旋束，如圖2-9所示。

★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計DeGrado等很好地發(fā)展了模塊方法。首先從二級結(jié)構(gòu)單元出發(fā)，他們優(yōu)化其結(jié)構(gòu)特征，使α螺旋序列在短肽范圍內(nèi)變化，這有利于合成。連接兩個α螺旋的轉(zhuǎn)折在α2中有所變化。這些特征都經(jīng)過優(yōu)化后合成得到了α4。這些努力使DeGrado等設計并合成了第一個全新蛋白，在溶液中能折疊為穩(wěn)定的球形構(gòu)象?！?.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計螺旋束與coiled-coil肽的序列有許多共同之處，它們都是兩親性螺旋。兩者主要的差別在于coiled-coil含有一個狹窄的疏水面，而螺旋束含有較寬的疏水面。大的疏水面有利于形成高的寡聚態(tài)，四螺旋束比較常見。雖然大多數(shù)模塊設計集中于α螺旋結(jié)構(gòu)，但仍有一些研究關注β折疊片蛋白。它們是通過合成的β折疊股的結(jié)合形成的。因為β結(jié)構(gòu)在溶液中不穩(wěn)定，所以β折疊與α螺旋相比是較少利用的模塊。它們必須通過氫鍵連接在一起。與α螺旋一樣，形成自組裝多聚體的β折疊股的序列必須是兩親性。

★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計對于模塊設計，什么特征是最基本的？是否存在設計形成二級結(jié)構(gòu)及自組裝肽的一般規(guī)律？因為自組裝主要涉及疏水相互作用，所以設計的序列必須是兩親性的。這個兩親性的二級結(jié)構(gòu)序列有一個極性和非極性殘基的周期性。形成兩親α螺旋，通常要求序列非極性殘基每隔3個或4個位置出現(xiàn)一次。有關實驗證明極性和非極性殘基的周期性出現(xiàn)對于二級結(jié)構(gòu)的形成及自組裝起著決定性作用?！?.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計是否必須考慮氨基酸殘基形成二級結(jié)構(gòu)的傾向？是否α螺旋必須由α螺旋的形成者組成？β結(jié)構(gòu)必須由β結(jié)構(gòu)形成者組成？實驗結(jié)果證明固有的傾向性對結(jié)構(gòu)的支配能力可以被序列的極性/非極性周期性所征服。例如，如果一個序列是由很好的α螺旋形成者組成，但它的極性/非極性殘基的周期是2，它形成自組裝的β折疊股。相反，一個序列由很好的形成者組成，但是極性/非極性周期是3或4，則它形成α螺旋。因此，當序列的周期性是嚴格控制的，則自組裝模塊的結(jié)構(gòu)能容忍序列在一定范圍內(nèi)變化。★1.二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝（模塊方法）

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計全新蛋白質(zhì)設計的第二個策略是使用一個配體(典型的是一個金屬離子)誘導模塊蛋白片段的組裝，如圖2-10所示?！?.配體誘導組裝

一個配位結(jié)合位點設計在結(jié)構(gòu)中幾個相互作用片段的界面處。如果這個位點對配體有很高的親和力，則結(jié)合配體的合適的自由能將充分克服熵消耗并驅(qū)動肽自組裝。Lieberman和Sasaki利用Fe(II)誘導組裝形成一個三螺旋束。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★2.配體誘導組裝

他們合成了一個15肽的兩親α螺旋，雙吡啶的一部分結(jié)合到N端。根據(jù)已知的Fe(II)與3個雙吡啶配合物的結(jié)構(gòu)特征，他們在3個α螺旋端點的雙吡啶間設計了一個金屬結(jié)合位點，使金屬絡合誘導三螺旋束的形成，如圖2-11所示。圓振二向色散譜表明，孤立的多肽沒有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)，但Fe(II)誘導了二級結(jié)構(gòu)占優(yōu)勢的結(jié)構(gòu)的形成。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★2.配體誘導組裝

Ghadiri

等也進行了類似的工作。他們在15肽雙親α螺旋的N端接一個雙吡啶基團，使用二價金屬離子如Ni(II)、Co(II)或Ru(II)誘導形成三螺旋束。Ghadiri研究組擴展了金屬離子輔助自組裝策略，從三螺旋擴展到四螺旋束。他們合成了15殘基的兩親肽，并把吡啶基接在N端，Ru(II)的親和作用使含氮的芳香雜環(huán)提供一個很強的驅(qū)動力組裝四螺旋束，如圖2-12所示。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★3.通過共價交叉連接實現(xiàn)肽的自組裝

設計全新蛋白的主要障礙是肽鏈的構(gòu)象熵。當幾個沒有連接的肽鏈進行自組裝時，熵勢壘是比較難以克服的。通過共價交叉連接可以減少構(gòu)象熵。因此通過共價連接它們的預組織肽是直接形成所希望結(jié)構(gòu)的有力途徑，如圖2-13所示。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★3.通過共價交叉連接實現(xiàn)肽的自組裝

在自然界惟一用于交叉連接的方法是二硫鍵。在全新蛋白設計中也使用其他種類的交叉連接。例如，Richardson、Erickson等在Betabillin的設計中使用稱為DAB的新的交叉連接方法。在8股-barrel中形成簡單的從上到下連接方法，如圖2-14所示。

合成自組裝肽也可以不使用二硫鍵或其他人工連接片段。賴氨酸的側(cè)鏈基團以及谷氨酸、天冬氨酸的側(cè)鏈羧酸彼此間能形成肽鍵，它們也能與主鏈的N端或C端形成肽鍵。這樣交叉連接導致枝杈結(jié)構(gòu)，一個優(yōu)點是鏈交叉連接限制了鏈彼此間的位置，因此減少了形成獨特結(jié)構(gòu)的熵消耗。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★3.通過共價交叉連接實現(xiàn)肽的自組裝

這種策略對于設計由平行或反平行二級結(jié)構(gòu)單元組成的結(jié)構(gòu)是很適用的。上述例子與天然蛋白有顯著差別，但具有胰凝乳蛋白酶的活性。Stewart及其合作者設計的Chymohelizyme是這種策略的一個例子。在這個平行的四螺旋束中，4條合成的多肽鏈通過肽鍵連接。如圖2-15所示。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★4.在合成模板上肽的組裝

Mutter及其合作者發(fā)展了一種模板組裝合成蛋白(TASPs)方法。他們不是使用天然蛋白中的turn和loops連接二級結(jié)構(gòu)單元，而是使用圖2-16中所顯示的人工模板。與天然線性蛋白質(zhì)不同，α螺旋和β折疊股在一個特殊折疊過程有一個正確的相對取向。TASP分子的螺旋和股通過模板結(jié)構(gòu)導向形成所希望的構(gòu)象。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★4.在合成模板上肽的組裝

Mutter研究組使用的模板是寡肽，一個典型的例子是環(huán)十聚體。其模板是：乙?；?Cys-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Lys-Cys-酰胺。這個模板用于形成兩個反平行β折疊股，通過一個在一端的Pro-Gly轉(zhuǎn)折和一個在另一端的二硫鍵形成兩個反平行的β折疊股。因為它有一個環(huán)結(jié)構(gòu)，因此這個的構(gòu)象因受到限制而比較確定，并且殘基側(cè)鏈的取向也比較確定。這個特點非常重要，因為4個賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基是作為幾個二級結(jié)構(gòu)單元的連接位點。例如，設計平行的四螺旋束的單一肽鏈的序列Glu-Ala-Leu-Gln-Lys-Ala-Leu-Lys-Gln-Ala-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly是兩親性的α螺旋。每條肽鏈是連接到環(huán)肽上4個賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基上。TASPs的特點是每條肽鏈顯示最低限度的濃度依賴關系，但是一旦它們連接到模板上，它們的結(jié)構(gòu)傾向于穩(wěn)定并且不依賴于濃度。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★4.在合成模板上肽的組裝

TASP方法一個可能的限制是把不同類型的肽連接到一個給定的模板上也許是困難的。任何一個肽鏈連接到模板的賴氨酸都有可能導致模板上4個賴氨酸的偶聯(lián)。Mutter等在模板的賴氨酸上加上不同的保護基。TASP方法加以改進能夠構(gòu)筑不同形貌的結(jié)構(gòu)包括βαβ、4α/4β結(jié)構(gòu)。TASP能夠模擬單鏈肽不能模擬的天然蛋白的性質(zhì)。例如，短的、孤立的肽一般不能作為抗原，因為它們的結(jié)構(gòu)在溶液中不穩(wěn)定，而且在體內(nèi)迅速降解。因此在它們作為抗原使用之前，通常把這些肽接到大的蛋白載體上。Mutter等模擬大的天然蛋白抗原的性質(zhì)，把來自HLA-A2蛋白的α螺旋序列的4個復制序列連接到環(huán)肽模板上。他們得到的分子雖然不含載體蛋白但仍能提高識別能力。因此TASP策略能模擬天然蛋白的關鍵性質(zhì)。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★4.在合成模板上肽的組裝

Sasaki等使用一個卟啉作為模板，連接α兩親螺旋的4條復制序列，如圖2-17所示。得到的最終蛋白質(zhì)稱為Helichrome，相當穩(wěn)定。但是不存在卟啉基團時，這個孤立肽不能形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。設計的Helichrome不僅形成穩(wěn)定的球形結(jié)構(gòu)，而且具有酶活性。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

不用模板或交叉連接而通過線性多肽折疊形成球形的確定的三維結(jié)構(gòu)是全新蛋白質(zhì)設計追求的目標之一。把一個線性肽折疊形成獨特的三維結(jié)構(gòu)的主要障礙是構(gòu)象熵，這需要精心設計一系列的相互作用才能穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。這方面工作已取得重大進展。單鏈多肽成功地折疊為穩(wěn)定的球形結(jié)構(gòu)的第一個例子是DeGrado及其合作者完成的α4結(jié)構(gòu)。首先合成含16個殘基的α1

，然后αl自組裝為四螺旋束。在α4中，這些螺旋是由Pro-Arg-Arg轉(zhuǎn)折連接的，74個氨基酸的序列由一個合成的基因所表達。折疊后的最后分子相對非折疊形式自由能的差為94.05kJ/mol，比天然蛋白質(zhì)更穩(wěn)定，其差值約20.9~41.8kJ/mo1。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

從α4結(jié)構(gòu)的極端穩(wěn)定性看出，α4是一個理想化的結(jié)構(gòu)。研究人員把全新設計的復雜性簡化為幾個涉及天然蛋白穩(wěn)定性的關鍵特征，然后優(yōu)化這些特征，稱最小化途徑。穩(wěn)定α4的最重要特征是α螺旋明顯的兩親性。螺旋對溶劑的暴露面以及埋藏的內(nèi)部面可以由表面位置的荷電殘基(Gln或Lys)和埋藏的極端疏水側(cè)鏈(Leu)所確定。疏水表面的埋藏一般認為是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力。α4顯著穩(wěn)定性的主要特征是形成明顯的疏水核。α4的設計還考慮其他對穩(wěn)定性有貢獻的因素，如形成Glu-…Lys+鹽橋，螺旋偶極的電荷中和，增加在螺旋/轉(zhuǎn)折連接處的柔性。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

盡管最小化途徑已經(jīng)取得許多成功，但它也有某些缺點。由于使復雜性最小化，因此設計的結(jié)構(gòu)比天然蛋白簡單且有更多的重復部分。這些重復的序列使結(jié)構(gòu)更易變，難于精確測定。α4缺少天然蛋白那樣好的互補堆積。Raleigh和DeGrado相繼修飾四螺旋束序列，使其較少重復以及更易形成有序結(jié)構(gòu)。他們使用幾個非極性側(cè)鏈殘基，例如Val、Phe、Trp以及Ile等替代埋藏的賴氨酸殘基。它們比賴氨酸有更多的構(gòu)象限制以及能夠增加螺旋間堆積的立體互補性。因此DeGrado及其合作者構(gòu)筑了結(jié)構(gòu)及熱力學性質(zhì)比原來的分子更接近天然蛋白的分子。一個減少鏈內(nèi)側(cè)柔性的策略是在新蛋白中引入一個金屬結(jié)合位點。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

Hecht等利用一個替代最小化途徑的方法設計了沒有重復序列的四螺旋束Felix。他們的目標是設計與合成一個由不同側(cè)鏈間特殊相互作用所穩(wěn)定的獨特的三維結(jié)構(gòu)的類天然蛋白。Felix避免了簡單的重復序列，它的序列與天然蛋白類似：四螺旋中每一條都是不同的；每條螺旋本身沒有重復的片段；在79個氨基酸序列中包括19種天然氨基酸。在Felix中4條α螺旋均為兩親性，盡管程度比α4低但與天然蛋白質(zhì)相近。在四螺旋束中每個重要位置的殘基都選擇在天然蛋白的相應位置上頻繁出現(xiàn)的殘基。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

螺旋確定后要考慮鏈間的堆積，適當修飾序列使其很好的互補。對于一個成功的設計，內(nèi)堆積是一個重要因素，也是最難實現(xiàn)的因素。最后引入一個分子內(nèi)的二硫鍵連接第一個螺旋上的Cys11與第四個螺旋上的Cys71。二硫鍵的作用是：減少構(gòu)象熵并穩(wěn)定構(gòu)象；它可以探測第一條及第四條鏈彼此間的取向。圖2-18列出了Felix的序列及建議的飄帶圖。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)設計涉及要穩(wěn)定一個所希望的結(jié)構(gòu)及不穩(wěn)定一個競爭結(jié)構(gòu)。設計一個互補的替代結(jié)構(gòu)稱為“負設計。Felix的設計結(jié)合了“負設計”的某些特征。例如，在設計α螺旋中避免含有有利于形成β折疊片的某些疏水和親水殘基，他們選擇轉(zhuǎn)折的長度以防止形成螺旋發(fā)夾。他們構(gòu)建了一個合成基因，在大腸桿菌中高水平地表達蛋白。他們得到如下結(jié)果：①譜學研究證明Felix折疊成緊密的球形結(jié)構(gòu)；②CD譜證明α螺旋在蛋白質(zhì)中占優(yōu)勢；③Cys11-Cys71二硫鍵的形成說明雖然Cys11、Cys71在序列上是遠離的，但在三維空間它們是彼此靠近的，第一條α螺旋堆積靠近第四條螺旋；④二硫鍵是在分子內(nèi)而不是分子間；⑤熒光譜表明在位置15的色氨酸埋藏在小極性環(huán)境中；⑥熒光猝滅研究證明色氨酸非常接近Cys11-Cys71二硫鍵。這些結(jié)果說明Felix的折疊結(jié)構(gòu)是非常類似于圖2-18模型。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

雖然Felix折疊為近似正確的結(jié)構(gòu)，但它不是非常穩(wěn)定的。去折疊實驗表明折疊構(gòu)象只比非折疊態(tài)穩(wěn)定(<4.18kJ/mol)。在Felix設計中不成功的地方正是蛋白質(zhì)本身的核心問題。在蛋白質(zhì)內(nèi)疏水側(cè)鏈間的特殊相互作用是形成獨特結(jié)構(gòu)的關鍵，但這種設計很困難。實質(zhì)上，F(xiàn)elix的低穩(wěn)定性可能表明它沒有一個獨特的很好堆積的疏水內(nèi)核。雖然四螺旋束代表一個誘人的模型體系，但對于設計全新蛋白不能限制于這些結(jié)構(gòu)。在天然蛋白中另一個共同觀察的結(jié)構(gòu)是8股α/βbarrel(丙糖磷酸異構(gòu)酶)。Goraj等設計了一個類似于α4，稱為Octarellin的新奇的α/β

barrel的氨基酸序列，它是由單一結(jié)構(gòu)單元多次重復形成的理想化的結(jié)構(gòu)。1994年Qunn等設計了一個稱為Betadoublet的β折疊蛋白質(zhì)。早期Richardson實驗室有關Betabellin的工作表明β折疊蛋白質(zhì)可能比α螺旋蛋白質(zhì)更難設計。主要原因是β-體系在水溶液中溶解度很低。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★5.線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)

以上設計的蛋白質(zhì)都是基于在天然蛋白質(zhì)中頻繁觀察到的結(jié)構(gòu)模體設計的。Ptitsyn及其合作者設計了一個三維結(jié)構(gòu)與天然蛋白質(zhì)不同的結(jié)構(gòu)。圖2-19所示的結(jié)構(gòu)是“OpenSandwich”，由4串β折疊片對著兩個α螺旋。這個蛋白質(zhì)稱為Aibebetin。Ptitsyn等把纈氨酸殘基放在β串i、i+2以及i+4位置，把亮氨酸放在α螺旋的i、i+3、i+4以及i+7位置。這個序列有利于形成二級結(jié)構(gòu)的兩親性單元。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★6.基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設計

蛋白質(zhì)組學是目前備受關注的新領域，它包括天然蛋白質(zhì)的多樣性、相互作用、結(jié)構(gòu)以及功能。它回答的問題是“什么是天然存在的”。組合庫方法要回答的問題是“什么是可能的”。要回答這個問題要構(gòu)筑大的全新蛋白質(zhì)庫。比較庫中的全新蛋白質(zhì)與自然進化選擇的蛋白質(zhì)，可以得到很多有用的信息。所有可能的氨基酸序列是一個天文數(shù)字，但是實際能形成獨特三維結(jié)構(gòu)的序列僅占序列空間的很小部分。組合庫的構(gòu)筑既要顧及序列的多樣性又要利用合理設計大大減少序列的數(shù)目。

組合庫設計的一個核心問題是埋藏疏水部分。一個常用的方法是基于極性(P)和非極性(N)氨基酸的“二元模式”。二元模式一方面要有利于形成二級結(jié)構(gòu)，另一方面又要埋藏疏水殘基。二元模式可用于二級結(jié)構(gòu)兩親片段，一面完全是極性殘基，另一面完全是非極性殘基。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★6.基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設計

α螺旋的周期是每一圈含3.6個殘基，β折疊股有一個交替的周期(上-下-上-下等)。α螺旋一面極性、一面非極性順序可為P-N-P-P-N-N-P-P-N。β折疊股一面完全疏水、一面完全親水，一個交替序列可為P-N-P-N，如圖2-20所示。全新蛋白的組合庫的第一個報道是形成四螺旋束的氨基酸序列二元設計，如圖2-20(a)、(b)。組合庫是通過合成基因在細菌中表達制備，同時通過基因編碼實現(xiàn)組合多樣性。二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★6.基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設計

從實驗結(jié)果看出二元模式方法可以得到一大批可以折疊為α螺旋的可溶蛋白質(zhì)，但預定的目標并沒有完全達到。其原因是這個方法沒有很好地考慮內(nèi)核的堆積。為了克服上述不足，又發(fā)展了第二代二元編碼組合庫。如圖2-21，新庫以原來的74殘基組合庫中的第86號蛋白為起始材料，對其轉(zhuǎn)折區(qū)域作些小修改。

最重要的修飾是4條螺旋中的每條螺旋加6個組合的不同殘基，組合的方式仍服從二元模式。從第二代組合庫中任意取出5個蛋白質(zhì)作進一步的分析證明這些蛋白質(zhì)是單體且螺旋度很高?；瘜W失活實驗表明這些蛋白的穩(wěn)定化自由能比其母體高2-3倍。NMR譜研究證明這些蛋白質(zhì)是很好折疊的天然類蛋白質(zhì)。第二代庫的成功表明，二元編碼方法能夠產(chǎn)生類似于天然蛋白質(zhì)的全新蛋白質(zhì)。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★6.基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設計

二元編碼方法不僅用于α螺旋，也可用于β折疊片。兩親性的β折疊股有一個P-N-P-N-P-N周期性。建立一個基于這個周期性的編碼β折疊片蛋白質(zhì)的組合庫，極性殘基在一面而非極性殘基在另一面[如圖2-20(c)所示]。組合庫中的蛋白質(zhì)含有6條β折疊股，每一條有二元周期P-N-P-N-P-N-P。CD譜研究表明這些蛋白質(zhì)具有β折疊片結(jié)構(gòu)。β折疊片自組裝為電子顯微鏡及原子力顯微鏡可觀察的纖維狀蛋白質(zhì)，類似于在幾種神經(jīng)退化疾病中發(fā)現(xiàn)的淀粉狀纖維。這種纖維狀蛋白質(zhì)類似于天然淀粉，新的纖維由折疊片二級結(jié)構(gòu)組成并能與剛果紅診斷染料結(jié)合。組合庫的設計中要考慮優(yōu)化疏水核，通過篩選發(fā)現(xiàn)最優(yōu)的堆積相互作用。主要使用兩種篩選方法：第一種是使用一維1H-NMR譜；第二種方法是使用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)觀察H-D交換動力學。除了考慮疏水核堆積外，還要考慮優(yōu)化二級結(jié)構(gòu)單元間的界面。

二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設計★6.基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設計

近年來發(fā)展了一些計算機輔助設計方法，在開始實驗之前先進行計算機篩選。一般分為兩步，第一步建立側(cè)鏈的旋轉(zhuǎn)構(gòu)象庫(rotamer)；第二步把Rotamer庫作為輸入，計算低能序列組合的可能性。Dahiyat以及Mayo首先報道了自動計算機篩選序列的工作。他們采用Zif268的鋅指結(jié)構(gòu)域并使用死端消除法，搜索殘基的低能安排。對于28個殘基序列，可能的組合多樣性是2028=3×1036。每個殘基需要考慮幾個旋轉(zhuǎn)構(gòu)象，可能的組合數(shù)目應為1.1×1062。利用死端消除法可以減少計算工作量，他們從庫中篩選出FSD-1。合成這個序列并進行NMR研究，結(jié)果表明FSD-1非常類似于天然的靶結(jié)構(gòu)，其與天然靶結(jié)構(gòu)的均方根偏差僅為0.198nm。利用組合庫方法尋找全新蛋白質(zhì)已在如下方面取得成功：α螺旋；β折疊片；單體；自組裝為有序的排列；堆積為天然類蛋白質(zhì)；超熱穩(wěn)定性；結(jié)合輔因子的能力；催化活性。

★1.通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設計新的功能★2.鍵合及催化的從頭設計★3.在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點■三、蛋白質(zhì)的功能設計第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設計★4.催化活性蛋白質(zhì)的設計★5.膜蛋白及離子通道的設計★6.新材料的設計三、蛋白質(zhì)的功能設計★1.通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設計新的功能蛋白質(zhì)設計的目標是產(chǎn)生既能折疊為預想的結(jié)構(gòu)又具有一定的功能。功能設計主要涉及鍵合及催化。為達到這些目的可以采用兩條不同的途徑：①反向?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)與工程底物的契合，改變功能；②從頭設計功能蛋白質(zhì)。執(zhí)行特別生物功能的天然蛋白質(zhì)能通過反向擬合獲得新的活性。修飾進化億萬年的蛋白質(zhì)，執(zhí)行我們自己選擇的功能是非常誘人的任務。自然界已經(jīng)向我們提供許多相當穩(wěn)定、能夠耐受序列修飾改變的結(jié)構(gòu)骨架。通過修飾天然結(jié)構(gòu)得到專一性及活性改變的天然蛋白質(zhì)是可能的，在如下范圍已取得成功：DNA結(jié)合專一肽；改變輔因子的專一性；改變底物的專一性。三、蛋白質(zhì)的功能設計★1.通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設計新的功能反向擬合能把新奇的性質(zhì)附加到原蛋白質(zhì)骨架的結(jié)構(gòu)上。幾個通過蛋白質(zhì)工程使天然蛋白質(zhì)獲得新功能的實例：(l)引入金屬結(jié)合位點。在大腸桿菌中引入新的過渡金屬結(jié)合位點以及在溶菌酶中引入新的鈣結(jié)合位點，使金屬溶菌酶的活性及熱穩(wěn)定性都優(yōu)于天然酶。(2)位點專一DNA裂解。重組脫氧核糖核酸酶的一個52殘基的DNA-結(jié)合碎片共價連接一個鰲合試劑EDTA后形成一個序列專一的DNA裂解蛋白質(zhì)。催化抗體的設計是反向擬合天然蛋白質(zhì)最廣泛、最有力的應用?？贵w是嫁接功能的理想蛋白。通過改變loop區(qū)免疫體系能產(chǎn)生新奇的結(jié)合專一性。免疫學家以及化學家誘導哺乳動物免疫體系產(chǎn)生不僅能結(jié)合專一抗原而且能催化不同化學反應的抗體。催化抗體的核心是使用類似于反應過渡態(tài)的抗原。三、蛋白質(zhì)的功能設計★2.鍵合及催化的從頭設計能結(jié)合特殊配件的新蛋白質(zhì)設計的早期工作是Gutte及其合作者開展的。1979年他們報道了能與核酸相互作用的34個殘基肽的設計、合成與表征。如圖2-22所示的序列形成ββα結(jié)構(gòu)，它能結(jié)合三核苷酸2’-甲基-鳥嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤。Thr12、Gln14以及Gln16側(cè)鍵與堿基部分形成氫鍵；Phe1、Phe3以及Tyr5與堿基堆積或插入；Lys28和His32與三核苷酸配體磷酸鹽形成穩(wěn)定鹽橋。一個連接Cys10與Cys33的二硫鍵加強了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。三、蛋白質(zhì)的功能設計★3.在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點

全新蛋白質(zhì)設計除了能折疊為預想的結(jié)構(gòu)外，還要設計新的結(jié)合位點及催化性質(zhì)。在設計和合成α4后，DeGrado及Regan兩個研究組修飾這個非常穩(wěn)定的序列使其具有結(jié)合金屬的位點。他們選擇設計了一個能結(jié)合Zn2+的四面體位點。Regan等設計了一個像幾種天然蛋白質(zhì)那樣的結(jié)合位點。他們通過計算機設計，以α4結(jié)構(gòu)模型作為初始結(jié)構(gòu)，每個殘基都分別被Cys及His所取代。通過計算機模擬找到形成Zn2+的四面體配位位點。他們找到了第二條螺旋的Cys21、His25及第三條螺旋的Cys47和His51形成合適的位點。通過在大腸桿菌中基因表達α4蛋白質(zhì)的變種。純化后的蛋白質(zhì)的表征結(jié)果表明：Zn2+的解離常數(shù)是2510-8mol/L；結(jié)合位點在單一蛋白質(zhì)的單體內(nèi)；結(jié)合金屬后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)沒有改變；結(jié)合Zn2+后增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；半胱氨酸巰基對結(jié)合是最重要的。DeGrado等通過修飾α4序列設計了Zn2+的結(jié)合位點。實驗結(jié)果表明，結(jié)合金屬后蛋白質(zhì)變?yōu)楦行虻慕Y(jié)構(gòu)。三、蛋白質(zhì)的功能設計★3.在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點

新的金屬蛋白質(zhì)的構(gòu)筑不限于α螺旋。Pessi等根據(jù)免疫球蛋白McPC603設計了一個在β折疊片骨架引入結(jié)合位點的蛋白質(zhì)，稱為“minibody”。這個蛋白質(zhì)含61個殘基，圖2-23表示它的建議的結(jié)構(gòu)模型及序列。

三、蛋白質(zhì)的功能設計★3.在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點

全新蛋白結(jié)合位點的設計不僅限于金屬位點。DeGrado等在α-2序列中引入血紅素結(jié)合位點。Robertson等構(gòu)筑了由兩個62肽組成的新奇四螺旋束。這個自組裝的大分子結(jié)合了4個平行的血紅素并具有與天然蛋白質(zhì)相似的光譜及電化學性質(zhì)。特別誘人的是觀察到紅血素-血紅素電化學協(xié)同作用。這些工作表明，全新蛋白質(zhì)不僅能結(jié)合輔因子而且能模擬天然蛋白質(zhì)的某些復雜性質(zhì)。

★4.催化活性蛋白質(zhì)的設計

這類設計的早期代表性工作是Hahn設計的Chymohelizyme及Sasaki等設計的Helichrome。這兩個設計蛋白質(zhì)均使用人工交叉連接預組織結(jié)構(gòu)并使活性口袋的位置接近催化活性部分。它們的催化位點與天然酶相似。

三、蛋白質(zhì)的功能設計★4.催化活性蛋白質(zhì)的設計

Benner設計了一個人工脫羧酶(ART-OAD)。他們放置一個賴氨酸在兩親螺旋極性面上并非常接近其他賴氨酸鏈，其結(jié)構(gòu)如圖2-24所示。其意圖是使中心的賴氨酸作為親核試劑，同時支架上的賴氨酸應當是荷正電，能與荷負電的底物成鍵。通過固相方法合成ART-OAD，CD譜以及NMR譜研究表明α螺旋占優(yōu)勢。它的二級結(jié)構(gòu)依賴于濃度，表明兩親螺旋的組裝體為期望的多聚體(可能是四聚體)。合成肽的Kcat(0.4min-1)比天然酶慢5個數(shù)量級但仍比脫羧反應快900倍。

三、蛋白質(zhì)的功能設計★5.膜蛋白及離子通道的設計

膜蛋白在許多生物過程中起重要作用。設計與構(gòu)筑具有預期結(jié)構(gòu)與性能的膜蛋白有非常重要的意義。膜蛋白結(jié)構(gòu)形成的驅(qū)動力與在水中可溶的蛋白不同，設計及合成中所遇到的困難也不同。例如疏水效應要求在溶液環(huán)境中非極性殘基在內(nèi)部，極性殘基在外部，但對于在非極性環(huán)境中的膜蛋白就完全不同。膜蛋白在體內(nèi)表達或在體外合成形成典型的包含物。一個全新膜蛋白從一個不溶水的聚集體轉(zhuǎn)換為類似于膜的環(huán)境要求構(gòu)象變化。盡管存在很大困難，但科學家們?nèi)栽O計表征了一些全新膜蛋白。三、蛋白質(zhì)的功能設計★5.膜蛋白及離子通道的設計

(1)Montal等使用Mutter的模板輔助方法設計了一系列模擬天然離子通道特征的全新微孔蛋白質(zhì)Synporin。4條相同的23肽α螺旋被固定在載體模板上，并且相互平行，如圖2-25所示。CD譜研究支持了圖2-25所示的模型。結(jié)果表明，101個殘基的Synporin主要是α螺旋。根據(jù)設計，非極性殘基側(cè)鏈形成外親脂表面，能與脂雙層相互作用，同時螺旋的極性側(cè)鏈形成中心孔。表征實驗證明新蛋白質(zhì)形成了離子通道。這些通道具有如下特點：單通道；能區(qū)別不同的陽離子；在毫秒時間范圍內(nèi)打開與關閉；對局部麻醉通道阻塞劑敏感。

三、蛋白質(zhì)的功能設計★5.膜蛋白及離子通道的設計

(2)根據(jù)天然離子通道的螺旋束結(jié)構(gòu)，Lear等設計并合成了含有簡單兩親α螺旋的離子通道。這些離子通道的特點是：序列與天然離子通道序列不同；它不用模板，是通過自組裝形成圍繞一個中心親水孔的多聚體。它雖然簡單，但仍具備天然離子通道的基本特征。

★6.新材料的設計

在生物體系中蛋白質(zhì)的作用涉及結(jié)構(gòu)與功能。通常情況下，結(jié)構(gòu)性質(zhì)支配功能。例如，纖維蛋白、α-角蛋白、β-角蛋白、膠原蛋白及彈性蛋白的不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)決定頭發(fā)、蠶絲、皮膚及彈性紉帶的性質(zhì)。類似的、新奇的多肽材料的結(jié)構(gòu)可以充分提供新的功能。三、蛋白質(zhì)的功能設計★6.新材料的設計

自組裝是構(gòu)筑新材料的重要方法，是材料科學和蛋白質(zhì)折疊的共同的課題。Ghadiri等設計并利用了多肽模塊自組裝成中空納米管的新材料。它采取一個平面環(huán)形構(gòu)象，如圖2-26所示。在酸堿性為中性情況下，谷氨酸側(cè)鏈荷負電，同時環(huán)肽彼此排斥。然而，在酸性情況下，酸性基團質(zhì)子化并形成平面分子間的氫鍵，替代了環(huán)肽間的排斥。因此介質(zhì)的酸化導致環(huán)肽的自組裝。

■計算蛋白質(zhì)設計包括能量表達、能量優(yōu)化、側(cè)鏈構(gòu)象的離散化、殘基分類（內(nèi)核、表面、邊界）、功能位點設計、專一性、穩(wěn)定性及序列空間的穩(wěn)健性預測、負設計等方面內(nèi)容。

第四節(jié)計算蛋白質(zhì)設計

★一、能量表達★二、能量優(yōu)化★三、序列優(yōu)化★四、序列-結(jié)構(gòu)專一性★五、底物專一性設計★六、金屬結(jié)合位點的設計第四節(jié)計算蛋白質(zhì)設計

★一、能量表達

蛋白質(zhì)設計通過能量表達（函數(shù)）或力場計算給定序列的能量，決定系列序列的能量順序，并了解蛋白質(zhì)內(nèi)的相互作用力。能量的表達包括內(nèi)坐標項、范德華作用項、氫鍵項、靜電相互作用項、溶劑效應項及熵效應項等。項目的選擇是根據(jù)提高實驗與理論的相關性的要求進行的。改善的能量表達用于設計新的序列，完善這個循環(huán)。

在典型的分子力學力場中，共價鍵、鍵角、扭角等是必須考慮的。在產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)構(gòu)象集合（庫）和修飾蛋白質(zhì)主鏈時這些內(nèi)坐標項都應該包括。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計分析能產(chǎn)生很好的內(nèi)坐標項?！賰?nèi)坐標項第四節(jié)計算蛋白質(zhì)設計

★一、能量表達

范德華勢涉及蛋白質(zhì)內(nèi)的堆積，堆積專一性對蛋白質(zhì)設計非常重要。對于蛋白質(zhì)內(nèi)核的設計，堆積是非常關鍵的。范德華勢提供了側(cè)鏈專一性堆積的物理基礎，據(jù)此可以設計很好折疊的蛋白質(zhì)。

氫鍵對蛋白質(zhì)設計也非常重要，特別是對α螺旋及全序列設計。在某些蛋白質(zhì)