動物細胞培養(yǎng)

生物反應器1細胞培養(yǎng)工程南開大學4.分子傳遞現(xiàn)象2細胞培養(yǎng)工程南開大學分子傳遞的基本物理現(xiàn)象擴散（Diffusion）由于分子碰撞而傳遞熱能所引起的分子隨機運動舉例：氣泡外周液體滯流層內(nèi)溶解氧分子的擴散3細胞培養(yǎng)工程南開大學對流（Convection）由于流體主體的運動所引起的傳遞舉例：滯流層被從氣泡外周置換離開氣泡之后，溶解氧分子隨液體流動而位移至反應器的其它位置擴散在流體（氣體或液體）內(nèi)部，分子間每秒鐘發(fā)生數(shù)以萬億次碰撞，每次碰撞都會導致溶質(zhì)和溶劑分子的運動方向改變；分子的擴散速度取決于其大小、形狀、溫度和流體粘度（流動阻力）；宏觀效果：分子從濃度較高區(qū)域遷移至較低區(qū)域；可類比物理現(xiàn)象熱量（溫度）流體流動（壓力）4細胞培養(yǎng)工程南開大學擴散菲克第一定律（Fick’sfirstlaw）在單位時間內(nèi)，通過垂直于擴散方向的單位截面積的擴散物質(zhì)流量與該截面處的濃度梯度成正比，即濃度梯度越大，擴散通量越大擴散物質(zhì)流量：單位時間內(nèi)，分子L

通過單位面積的凈數(shù)量5細胞培養(yǎng)工程南開大學分子L的有效擴散系數(shù)分子L沿擴散方向的濃度梯度擴散：室溫下物質(zhì)的擴散系數(shù)范圍物質(zhì)與擴散媒介

擴散系數(shù)(cm2s-1)6Gasesingases0.1to0.5Gasesinliquids1x10-7to7x10-5Smallmoleculesinliquids1x10-5Proteinsinliquids1x10-7to7x10-7Proteinsintissues1x10-10to7x10-7Lipidsinlipidmembranes1x10-9Proteinsinlipidmembranes1x10-12to7x10-10數(shù)據(jù)來源：TransportPhenomenainBiologicalSystems(2nded.,2009)細胞培養(yǎng)工程南開大學擴散分子尺度與分子兩次碰撞間遷移尺度比較氣體：分子大小

遠遠小于

兩次碰撞間遷移尺度液體：分子大小

遠遠大于

于兩次碰撞間遷移尺度7細胞培養(yǎng)工程南開大學擴散Einstein’sEquationx=(2Dt)1/2x遷移距離D有效擴散系數(shù)t擴散時間8細胞培養(yǎng)工程南開大學應用估算細胞內(nèi)分子相結(jié)合（相遇）所需時間采用偏微分方程積分方法，計算靜態(tài)液相蛋白質(zhì)分子或病毒顆粒與固定的配基、受體或細胞相結(jié)合的累積量，以優(yōu)化檢測方法對流（流動）由于重力、壓力或剪切力的存在，流體（氣體或液體）主體發(fā)生流動，溶于其中的溶質(zhì)隨之移動；溶質(zhì)的擴散現(xiàn)象同時存在如果流體流動相對比較慢，溶質(zhì)的擴散現(xiàn)象對其傳遞起主導作用；如果流體流動相對比較快，液體主體流動對溶質(zhì)的傳遞起主導作用；粘度：流體對流動的摩擦阻力，受溫度和壓力影響密度：顯示物質(zhì)內(nèi)部分子之間的緊密程度9細胞培養(yǎng)工程南開大學對流：流體概念定義：在剪切力的作用下發(fā)生連續(xù)形變的物質(zhì)分類物理狀態(tài)氣體液體可壓縮性（密度）粘度牛頓非牛頓流體10Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples細胞培養(yǎng)工程南開大學對流：流線概念定義沿著流路，并顯示流速與相對位置關系的表示方法；線條的疏密程度表示流速的相對大小。恒定流速

低流速中有障礙物

發(fā)酵罐擋板區(qū)域?qū)恿魍牧麂鰷u（Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples）細胞培養(yǎng)工程南開大學對流：雷諾準數(shù)（Re）流體的流動狀態(tài)，取決于流體的流速、粘度、密度、以及流路的幾何形狀；雷諾準數(shù)是用來描述流體的流動特點的參數(shù)（無物理單位）12圓形橫截面管道

攪拌式發(fā)酵罐攪拌槳

D管徑υ平均線性流速ρ

流體密度μ

流體粘度層流：小于2,100過渡：2,100-4,000湍流：4,000Ni攪拌槳轉(zhuǎn)速Di

攪拌槳管徑ρ

流體密度μ

流體粘度攪拌槳形狀對液體流動狀態(tài)影響很大，層流狀態(tài)一般低于10細胞培養(yǎng)工程南開大學對流：邊界層概念定義當流體與靜止物體相接觸時，受到影響的流體薄層被稱作邊界層；在靜止物體表面，流速為零，稱作靜止層；由于流體粘度作用，邊界層內(nèi)部與靜止層相鄰的液層流速會降低（粘滯阻力）；離靜止層越遠，粘滯阻力越弱，流速越高，逐漸接近主體流速。因此，在邊界層內(nèi)部存在一個速度梯度。13意義：邊界層的存在，不僅影響流體流動的性質(zhì)，而且會影響各相之間傳熱和傳質(zhì)。（Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples）細胞培養(yǎng)工程南開大學對流：粘度概念流體薄層內(nèi)部同心圓柱體的轉(zhuǎn)動能否帶動外圓筒的轉(zhuǎn)動？液體的性質(zhì)：拉拽作用力的傳導介質(zhì)液體介質(zhì)的作用面積直接影響作用力大小Brookfield粘度計工作原理14細胞培養(yǎng)工程南開大學對流：粘度（μ）將液體注入上下兩塊平板之間，距離D，面積為A當下板發(fā)生移動時，流體隨其運動，但上板表面液體速度為零，因此形成速度梯度剪切力

F與速度梯度成正比154.剪切應力定義Doran：BioprocessingEngineeringPrinciples細胞培養(yǎng)工程南開大學粘度流體的流變學分類細胞培養(yǎng)工程南開大學對流：粘度的意義17Gases10－40.0010.1Water0.011.00.01Glycerol10110Blood0.031.20.025粘度（常溫）

密度

運動粘度粘度是影響流體行為最重要的流體性質(zhì)，相當于流體本身對流動所施加的摩擦阻力，損耗機械能粘度對流體的泵送、攪拌混合、傳質(zhì)、傳熱和液體通氣，都有顯著作用，因此，對于生物過程設計以及經(jīng)濟成本也有重要影響培養(yǎng)液的粘度受細胞、底物和空氣影響。細胞培養(yǎng)工程南開大學5.攪拌式生物反應器

液體流動與混合18細胞培養(yǎng)工程南開大學攪拌式生物反應器內(nèi)部基本結(jié)構(gòu)19攪拌槳攪拌軸罐體細胞培養(yǎng)工程南開大學攪拌式生物反應器-攪拌槳主要類型MarinePitched-bladeTurbineRushtonTurbine軸向兼徑向混合

徑向混合

ElephantEar20細胞培養(yǎng)工程南開大學攪拌式生物反應器–徑向混合流型RushtonTurbine21細胞培養(yǎng)工程南開大學微混合為主，兼有主體混合效果，氧傳質(zhì)效果較強高剪切力，適合微生物發(fā)酵高H/D反應器可配置多個攪拌槳攪拌式生物反應器–軸向混合流型22細胞培養(yǎng)工程南開大學軸向主體混合為主，攪拌溫和大槳葉設計更適合大規(guī)模細胞培養(yǎng)攪拌式生物反應器–攪拌混合機理交換：湍流狀態(tài)下，固態(tài)物質(zhì)間發(fā)生相對運動剪切力：層流狀態(tài)下，液層之間相對運動擴散：分子水平的交換。攪拌槳作用較大漩渦較小漩渦最小漩渦擴散作用Kolmogorovscale（cm）培養(yǎng)基運動粘性系數(shù)(cm2/s)單位質(zhì)量流體能量耗散速率(cm2/s3)細胞培養(yǎng)工程南開大學cell攪拌式生物反應器–混合效果評估方法：在固定位點跟蹤標示物濃度24細胞培養(yǎng)工程南開大學攪拌式生物反應器–混合效果評估Ci： 標示物初始濃度Cf

： 標示物最終濃度Tc

： 循環(huán)時間Tm： 混合時間，指達到所設定均勻度所需時間，

一般定義為

0.1(Cf-Ci)混合時間越短意味著混合效果越好25細胞培養(yǎng)工程南開大學6.攪拌式生物反應器

氣-液傳質(zhì)26細胞培養(yǎng)工程南開大學引言細胞生長需要齊備的營養(yǎng)供給，限制性底物濃度對比生長速率（μ）的影響27細胞培養(yǎng)工程南開大學當其中一種底物濃度（Si）降低至制約細胞生長，成為限制性底物，Monod方程當溶解氧作為底物氧是細胞生長和代謝所必需底物之一氧在水溶液中的溶解度極低28細胞培養(yǎng)工程南開大學為了滿足細胞的生理要求，反應器操作（主要是攪拌轉(zhuǎn)速和通氣流量）必須及時向培養(yǎng)體系提供氧氣，避免耗盡氧的溶解度溫度(oC)O2(mM)02.18101.70151.54201.38251.26301.16351.09401.03電解質(zhì)（M)O2(mM)HClH2SO4NaCl0.01.261.261.260.51.211.211.071.01.161.120.892.01.121.020.71一個大氣壓下，溫度對純氧在水中溶解度的影響一個大氣壓下（25oC）,純氧在不同濃度電解質(zhì)溶液中的溶解度來源：Bailey&Ollis(1986),BiochemicalEngineeringFundamentals(2nded.),p46329細胞培養(yǎng)工程南開大學攪拌式生物反應器–通氧方式（2）頂部通氧（輔助）通氧效率較低，適合細胞濃度低的接種初期階段不產(chǎn)生氣泡（1）底部通氧（主要）通氧效率高產(chǎn)生氣泡，需要采取保護措施（2）（1）細胞培養(yǎng)工程南開大學WAVEBioreactor-Cellbags細胞袋預先消毒，一次性使用，不必清洗通過支架的搖擺實現(xiàn)主體混合DO/CO2/pH控制0.1-500L細胞培養(yǎng)工程南開大學特殊細胞營養(yǎng)物質(zhì)-溶解氧（DO）細胞生理代謝需要量最大的必需營養(yǎng)物質(zhì)：

1C6H12O6+6O2

→6CO2+6H2O氧氣以溶解氧（DO）形式在水溶液中存在，常溫下溶解度非常低一個大氣壓空氣（其中

O2占21%）37oC培養(yǎng)基溶液（鹽類溶質(zhì)的存在降低其溶解度）飽和濃度約為

0.21mM相較于葡萄糖濃度（如25mM），溶解氧不足以滿足細胞生長需要，需要不斷提供通氧（向反應器內(nèi)部鼓氣，或培養(yǎng)基頂部界面換氣） (25-0)x6/(0.21-0)=714.3(倍)細胞膜對氧分子具有通透性，氧分子通過被動擴散進入細胞內(nèi)部32細胞培養(yǎng)工程南開大學在不通氧的條件下，DO耗竭需要多久？假設條件：

活細胞密度為5x106(cells/mL)

細胞比需氧量為3.2x10-13(moles/cell/hour)

培養(yǎng)基為100%空氣飽和（一般為50%左右），純氧飽和溶解度為1.0mM。計算（以1000毫升計算）：1000毫升培養(yǎng)液中DO的總量為

(1.0mMx21%-0)=0.21(mmoles)=0.21x10-32.1000毫升培養(yǎng)液中總活細胞數(shù)量為 5x106(cells/mL)x1000(mL)=5x109(cells)3.活細胞每小時的需氧量（假設不隨DO降低而變化） 5x109(cells)x3.2x10-13(moles/cell/hour)=1.6x10-3(moles/hour)

耗盡DO所需時間為 0.21x10-3(mles)/1.6x10-3(moles/hour)=0.13(hour)33細胞培養(yǎng)工程南開大學反應器通氧與攪拌Casea：通氣量過高，攪拌速率過低，氣泡圍繞攪拌軸區(qū)域上升，攪拌槳起不到打散和分散氣泡的作用（最低攪拌速率）；Casee：攪拌速率過高，上升氣泡會再次回到主體，槳葉與氣泡過多接觸減少槳葉對液體的拉拽，降低液體主體的能量輸入和混合（最高攪拌速率）。34細胞培養(yǎng)工程南開大學攪拌式生物反應器–攪拌器轉(zhuǎn)向“PumpDown”-延長氣泡停留時間×35細胞培養(yǎng)工程南開大學氧分子從氣泡到細胞內(nèi)傳遞步驟從氣相主體擴散到氣-液界面遷移并穿過氣-液界面擴散并穿過第一個滯流層（最主要傳質(zhì)阻力），進入流體主體在主體流體中傳遞，進入第二個滯流層擴散并穿過第二個滯流層進入細胞內(nèi)部參與生化反應（7）滯流層氣泡細胞流體主體⑥⑤④③②①細胞膜⑦氣-液傳遞37傳遞機制：成分A從氣相進入液相，濃度梯度從氣相到液相，由高到低氣相CAGA在氣相主體的濃度CAGiA在氣-液界面的濃度kG

A的氣相傳遞系數(shù)液相CALA在液相主體的濃度CALiA在氣-液界面的濃度kLA的液相傳遞系數(shù)氣-液傳遞38氣相CAGA的氣相主體濃度CAGiA的氣液界面濃度kGA的氣相傳遞系數(shù)液相CALA的液相主體濃度CALiA的氣液界面濃度kLA的液相傳遞系數(shù)A的氣相傳遞速率:a：氣液相間界面總面積A的液相傳遞速率:氣-液傳遞39氣相CAGA的氣相主體濃度CAGiA的氣液界面濃度kGA的氣相傳遞系數(shù)液相CALA的液相主體濃度CALiA的氣液界面濃度kLA的液相傳遞系數(shù)a：氣液相間界面總面積問題：難以準確測量！（1）氣-液界面變量

CAGi/CALi/a（2）氣、液相傳遞系數(shù)kG與

kL假設：（1）CAGi與CALi

的達到平衡（2）在CAGi濃度較低的情況下，CAGi與CALi

呈線性關系，m為分配因子氣-液傳遞40細胞培養(yǎng)工程南開大學氣-液傳遞41細胞培養(yǎng)工程南開大學體積傳遞系數(shù)

KLa傳質(zhì)系數(shù)（KL）氧傳質(zhì)阻力的倒數(shù)測定難度單位液體體積氣-液界面面積（a）受通氣量和攪拌速率影響測定難度體積傳遞系數(shù)

KLa可測定度量反應器氧傳遞能力，KLa值越高，系統(tǒng)氧傳遞能力越強，可支持更高細胞密度生長42細胞培養(yǎng)工程南開大學體積傳遞系數(shù)

KLa測定

-動態(tài)法將上式進行積分，得到43細胞培養(yǎng)工程南開大學為與氣相氧濃度對應的液相飽和溶解氧濃度體積傳遞系數(shù)（KLa）測定-動態(tài)法通過向培養(yǎng)基液體中鼓氮氣，使DO降低至一定水平關掉氮氣并開始鼓空氣，實時記錄溶氧濃度44細胞培養(yǎng)工程南開大學體積傳遞系數(shù)（KLa）測定-動態(tài)法3.ln(C*-CL)對時間

t

作圖，計算斜率–KLa（秒-1）45細胞培養(yǎng)工程南開大學7.攪拌式生物反應器中的

細胞損傷46細胞培養(yǎng)工程南開大學引言攪拌式生物反應器大規(guī)模細胞培養(yǎng)工業(yè)生產(chǎn)過程的主要工具培養(yǎng)過程研究與優(yōu)化，對其它反應器類型具有指導意義細胞損傷生理損傷營養(yǎng)缺乏與代謝副產(chǎn)物累積與反應器型式關系不大，所有培養(yǎng)過程都有可能發(fā)生物理損傷動物細胞無細胞壁反應器中強制混合所產(chǎn)生的水力作用反應器通氣供氧過程中的氣泡作用47細胞培養(yǎng)工程南開大學主體流體中的細胞損傷主體流體的基本結(jié)構(gòu)：流體環(huán)境：湍流能量發(fā)散模式：旋渦鏈：攪拌槳運動產(chǎn)生大旋渦槳葉寬度決定旋渦大小較大旋渦衍生較小旋渦直至形成最小旋渦能量轉(zhuǎn)化：通過粘性耗散，動能轉(zhuǎn)化成熱。在旋渦形成鏈中，能量首先以從大旋渦到小旋渦的形式傳遞；最后在最小旋渦中，通過粘性耗散轉(zhuǎn)化成熱。48細胞培養(yǎng)工程南開大學主體流體中的細胞損傷Kolmogorov理論：Kolmogorov尺度(KolmogorovLengthScale,cm)培養(yǎng)基液體運動粘性系數(shù)(cm2/s)局部單位質(zhì)量流體的能量耗散速率(cm2/s3)49細胞培養(yǎng)工程南開大學主體流體中的細胞損傷Kolmogorov理論詮釋：Kolmogorov尺度對應最小湍流漩渦大小培養(yǎng)基運動粘性系數(shù)與其呈正相關關系攪拌槳能量輸入與其呈負相關關系指導意義：與細胞或微載體尺度相當?shù)男郎u是導致細胞損傷的主要因素之一；在實際操作中，當最小旋渦的直徑小于微載體直徑的1/2–2/3時對細胞的破壞效果最強；過程放大：幾何結(jié)構(gòu)相似反應器攪拌槳轉(zhuǎn)速預測50細胞培養(yǎng)工程南開大學主體流體中的細胞損傷過程放大：幾何結(jié)構(gòu)相似反應器攪拌槳轉(zhuǎn)速預測51細胞的比死亡速率（sec-1）系數(shù)攪拌槳轉(zhuǎn)速（sec-1）微載體直徑（m）反應器體積（m3）培養(yǎng)基液體運動粘性系數(shù)(cm2/s)細胞培養(yǎng)工程南開大學主體流體中的細胞損傷過程放大：幾何結(jié)構(gòu)相似反應器攪拌槳轉(zhuǎn)速預測

體積增大到10倍，維持比死亡速率不變52細胞培養(yǎng)工程南開大學主體流體中的細胞損傷攪拌槳轉(zhuǎn)速預測的經(jīng)驗法則：反應器幾何結(jié)構(gòu)相似反應器體積增大到10倍，為了維持細胞的比死亡速率不變，攪拌槳轉(zhuǎn)速需要減低到原轉(zhuǎn)速的60%左右;該法則雖然來自微載體培養(yǎng)過程，但對攪拌式細胞懸浮培養(yǎng)過程放大仍具有指導意義。

53細胞培養(yǎng)工程南開大學氣泡相關的細胞損傷攪拌式生物反應器在大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中的使用最為普遍大多以氣體直接鼓入來滿足細胞對氧的需求；直接鼓泡供氧方式最簡單有效；但是，鼓泡會導致細胞損傷。反應器頂部通氣雖然效率較低，但在早期培養(yǎng)階段（細胞密度較低）不失為上策；其它供氧方法在大規(guī)模培養(yǎng)中有放大技術問題，但可能會在其它特殊應用中發(fā)揮作用。54細胞培養(yǎng)工程南開大學氣泡相關的細胞損傷反應器中的氣泡行為：在鼓泡器（或分布器）上的生成和釋放在液相主體中的上升在頂部空間破裂55細胞培養(yǎng)工程南開大學氣泡相關的細胞損傷氣泡在鼓泡器（或分布器）上的生成和釋放觀察：在相同氣體體積流量下，改變分布器氣孔氣流速率，細胞比死亡速率沒有明顯變化；結(jié)論：氣泡生成和釋放不是細胞損傷主要原因。

氣泡在液相主體中的上升觀察：尚有