發(fā)布發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局2023-01-082022-12-08ICS67.120.01CCSICS67.120.01CCSB45內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB15/T2832—2022PCRReal-timePCRmethodfordetectionofprairiemarmots-derivedmaterialsDB15/T2832—2022DB15/T2832—2022II前 言本文按GB/T1.1—2020《準(zhǔn)工導(dǎo)則 第部分標(biāo)化件結(jié)和起規(guī)》起草。本文件由中華人民共和國(guó)呼和浩特海關(guān)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國(guó)二連海關(guān)。本文件主要起草人：王伊琴、陳少博、楊帆、郝靜云、包勇敢、荊文魁、張志峰、常鴻、趙治國(guó)。DB15/T2832—2022DB15/T2832—2022DB15/T2832—2022DB15/T2832—202211下列縮略語(yǔ)適用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)PCR（polymerasechainreaction）TAMRA:(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]4 縮略語(yǔ)Ct值 cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。實(shí)時(shí)光 PCRreal-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過程。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。旱獺源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法范圍本文件規(guī)定了動(dòng)物源性產(chǎn)品中旱獺源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本文件適用于動(dòng)物源性產(chǎn)品（肉制品、皮毛制品、飼料等）中旱獺源性成分的鑒定，靈敏度為0.001ng/L。（GB/T6682 GB/T27403 22DNA提取DNADNADNAA260/A280在1.7～1.9PCR實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)7.2.1 反應(yīng)體系體積為25.0L，見表1。實(shí)時(shí)熒光PCR儀。高速臺(tái)式離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速12000rpm）。（3000rpm）天平（感量0.01g）。單孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。7 6 5 GB/T6682上游：5′-CCCTATTAATCTTAACAGCA-3′；下游：5′-GGGATTAGAGTAGCTTCA-3′；5′-(FAM)-TATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCA-(TAMRA)-3DNA。Tris-HCl(pH8.0NaCl。。K20mg/mL75PCRDNA。DNA。ddH2O。表1 旱獺性分時(shí)光PCR檢方的應(yīng)系試劑名稱貯備液濃度mol/L反應(yīng)體系體積LPCR反應(yīng)預(yù)混合液—12.5上游引物（F）10.01.0下游引物（R）10.01.0探針（P）10.01.0模板—2.0ddH2O—補(bǔ)足至總體積為25.0檢測(cè)過程分別設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白提取對(duì)照。7.2.2 95℃，1095℃，1554℃，1min，4054℃時(shí)質(zhì)量控制質(zhì)控對(duì)照應(yīng)滿足以下條件，否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)：Ct40.0；Ct40.0；Ct35.0。結(jié)果判定，2Ct40.0，2Ct35.01Ct35.0～40.0DNAPCRCtCt40.0結(jié)果表述檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。3444000rpm/min～5000r/min離心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～650LEP2CTAB1min。12000rpm離心10min350的1.2mol/LNaCl（2350L溶液。加入350L30min，12000rpm10min。EP0.20min，12000rpm離心10min500L7512000rpm10min。，6015s～20s（。100LTEbuffer或DEPC附錄A（資料性）溶液配制及提取方法將5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用鹽酸調(diào)pH8.0后，定容至250mL，115℃高壓15min。CTAB稱0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高壓15min。1.2mol/LNaCl稱取28gNaCl，定容至400mL，115℃高壓15min。DNA0.5g～11.5mL～3.5mLCTAB12L～20L根據(jù)CTAB265℃至少1h(CTAB,1mL10。55附錄B（規(guī)范性）旱獺源性成分的目標(biāo)擴(kuò)增序列193bpCCCTATTAATCTTAACAGCATGACTTCTACCCCTTATAATTATAGCAAGCCAAGGTCACTTAACTCAAGAGCC