核磁共振氫譜測(cè)定羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度摘要】目的建立測(cè)定無(wú)對(duì)照品或者指示劑的羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度的快速、專屬、簡(jiǎn)單的核磁共振氫譜方法。方法BrukerAVANCEIII600MHz核磁共振譜儀，在25°C、以重水為溶劑、觀測(cè)頻率600.137MHz、譜寬：4200Hz、90度脈沖寬度10.06“、脈沖延遲時(shí)間1s、采樣時(shí)間3s、高斯增寬因子0、線增寬因子0.2和采樣次數(shù)64次的條件下采集試樣的氫譜。結(jié)果分別對(duì)5.3-4.85ppm（葡萄糖環(huán)上的氫）和1.2-1.0ppm（羥丙基上的甲基氫）的積分面積比，測(cè)定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD為0.08%（n=6）。結(jié)論分析結(jié)果表明，在沒(méi)有對(duì)照品或者指示劑的情況下，核磁共振氫譜法，可以用于羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度的測(cè)定和質(zhì)量控制?！娟P(guān)鍵詞】核磁共振羥丙基-倍他-環(huán)糊精取代度【中圖分類號(hào)】R965【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1672-5085（2013）31-0087-021引言環(huán)糊精（cyclodextrin,CD）是由數(shù)個(gè)D-吡喃葡萄糖構(gòu)成的環(huán)狀低聚糖，環(huán)糊精的最顯著的特征是具有一個(gè)腔外親水、腔內(nèi)疏水并且具有一定尺寸的立體手性空腔。B-環(huán)糊精（B-CD）是由七個(gè)D-吡喃葡萄糖構(gòu)成的環(huán)狀低聚糖。目前，B-環(huán)糊精在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，例如：提高藥物分子的水溶性、穩(wěn)定性等［1,2］。通過(guò)安全性試驗(yàn)證明環(huán)糊精毒性低，口服環(huán)糊精是安全有效的。但B-環(huán)糊精胃腸外給藥有一定毒性，經(jīng)肌肉給藥后能形成潰瘍，靜脈給藥可導(dǎo)致腎臟毒性和溶血作用［3］。為了解決靜脈給藥安全性、提高溶解性，需要對(duì)B-環(huán)糊精進(jìn)行修飾，羥丙基-倍他-環(huán)糊精是B-環(huán)糊精的醚化衍生物［4,5］。HP-B-CD的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，因?yàn)椋總€(gè)B-CD分子中有七個(gè)D-吡喃葡萄糖殘基，每個(gè)葡萄糖殘基上有三個(gè)可被取代的羥基，所以，這樣計(jì)算HP-B-CD的平均取代度為0-21。HP-B-CD平均取代度的不同，其各種性能參數(shù)也稍有不同。目前國(guó)際上使用HP-B-CD的平均取代度一般為4.0-6.0。目前中國(guó)藥典和歐洲藥典中，用于測(cè)定HP-B-CD平均取代度的方法有氣相色譜法、容量法及核磁法［6,7］。目前國(guó)內(nèi)采用核磁共振方法測(cè)定HP-B-CD平均取代度還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用核磁共振氫譜（1H-NMR）方法，建立了一種快速、專屬、簡(jiǎn)單，用于無(wú)對(duì)照品或者指示劑的HP-B-CD平均取代度測(cè)定的分析方法。2實(shí)驗(yàn)部分儀器與試劑AVANCEIII600MHz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）。D2O（（D，99.9%），美國(guó)CIL）；三批羥丙基-B-環(huán)糊精（批號(hào)：130101、130102、130103；由石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司提供）。實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定溫度：25C；環(huán)境濕度：15RH%；觀測(cè)頻率：600.137MHz；譜寬：4200Hz；90度脈沖寬度：10.06“；脈沖延遲時(shí)間：1s；采樣時(shí)間：3s；采樣次數(shù):64次；高斯增寬因子：0；線增寬因子：0.2。分別準(zhǔn)確稱量不同批次羥丙基-倍他-環(huán)糊精10mg置于5mm的核磁共振樣品管中，加入0.6毫升D2O振蕩溶解，制成待測(cè)試樣溶液。在上述的實(shí)驗(yàn)條件下，調(diào)整儀器參數(shù)，調(diào)諧、控溫、勻場(chǎng)、采樣，得到1H-NMR譜。在進(jìn)行相位和基線調(diào)整，以水峰為內(nèi)標(biāo)，標(biāo)記為4.75ppm分別對(duì)5.3-4.85ppm（葡萄糖環(huán)上氫的化學(xué)位移）和1.2-1.0ppm（羥丙基上甲基的化學(xué)位移）分別進(jìn)行積分，將得到積分值進(jìn)行平均取代度的計(jì)算[7]。A1：羥丙基上甲基氫的積分面積；A2:葡萄糖環(huán)上氫的積分面積；3結(jié)果與討論3.11H-NMR測(cè)定羥丙基-倍他-環(huán)糊精（HP-B-CD）平均取代度方法的建立溶劑及內(nèi)標(biāo)峰選定固體樣品須配成溶液測(cè)試，合適的溶劑粘度小，對(duì)樣品溶解性能好，不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或者締合，其譜峰不與樣品峰發(fā)生重疊。因?yàn)榱u丙基-倍他-環(huán)糊精的水溶解性好，所以采用水作為溶劑，羥丙基-倍他-環(huán)糊精的1H-NMR譜見(jiàn)圖2。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)應(yīng)該具有較高的純度和準(zhǔn)確的含量，不與樣品和溶劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或締合，能溶于NMR溶劑，含有多個(gè)質(zhì)子，具有易于識(shí)別的譜峰，最好有尖銳單峰[8]；本實(shí)驗(yàn)選取水峰作為內(nèi)標(biāo)峰，其化學(xué)位移定為4.75ppm，避免外加入的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。采集時(shí)間的選擇足夠的采樣時(shí)間可以保證只有感應(yīng)衰減信號(hào)能衰減完全，得到基底沒(méi)有振蕩的相應(yīng)譜峰，從而提高分辨率[9]。以不同的采集時(shí)間采集圖譜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)采樣時(shí)間大于2.4秒自由感應(yīng)衰減完全。因此，實(shí)驗(yàn)可選取采樣時(shí)間等于3秒。脈沖延遲時(shí)間的選擇弛豫過(guò)程是核磁共振現(xiàn)象發(fā)生后得以保持的必要條件。因此，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選取合適的脈沖延遲時(shí)間，保證譜峰強(qiáng)度不會(huì)被飽和，這樣有利于對(duì)譜峰進(jìn)行正確的積分，得到準(zhǔn)確的結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)中，按照脈沖從短（0.03秒）到長(zhǎng)（3秒）分別采樣，然后對(duì)定量峰進(jìn)行積分，其峰面積比A1/A2隨脈沖延遲時(shí)間的變化如表2所示：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.5秒之前，隨著脈沖延遲時(shí)間的增大，A1/A2增大；在脈沖延遲時(shí)間大于0.5秒后，A1/A2沒(méi)有明顯的變化，因此實(shí)驗(yàn)選取脈沖延遲時(shí)間是1秒。3.1.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按2.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法，以20130101批次羥丙基-倍他-環(huán)糊精（HP-B-CD）樣品，在同一實(shí)驗(yàn)條件下，連續(xù)做6個(gè)1H-NMR，并以A1/A2峰面積比計(jì)算考察實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.08%（n=6），表明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。3.2羥丙基-倍他-環(huán)糊精（HP-B-CD）平均取代度結(jié)果取羥丙基-倍他-環(huán)糊精（HP-B-CD）（批號(hào)：20130101,、20130102、20130103），按照2.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法，在同一條件下做1H-NMR圖譜，通過(guò)公式計(jì)算得到20130101、2013010220130103批次的平均取代度分別為：4.84,4.81,4.87。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用核磁共振方法測(cè)定羥丙基-倍他-環(huán)糊精的平均取代度專屬性較好，重復(fù)性較好，能夠快速測(cè)定，對(duì)操作人員無(wú)人身危害等優(yōu)點(diǎn)。參考文獻(xiàn):DucheneD[M].Newtrendsincyclodextrinsandderivatives,EditionsdeSante,1991:11?18.UekamaK.PharmaceuticalapplicationsofmethylatedcyclodextrinsJ.Pharm.Int.,1985,6:61?65.高申[M]?現(xiàn)代藥物-新劑型新技術(shù)?北京：人民軍醫(yī)出版社,2002:35?40.BrewsterME,HoraMS,SimpkinsJW,etal.Useof2-hydroxypropyW-cyclodextrinasasolubilizingandstabilizingexcipientforproteindrugsJ.Pharm.Res,1991,8:792?795.袁超,金征宇.羥丙基環(huán)糊精性質(zhì).應(yīng)用及前景展望[J].糧食與油脂,2009,1:4?6.ChinesePharmacopoeia,2005,VII-F-48.EP7.301/2009:1804.胡敏,胡昌勤，劉文英.核磁共振氫譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定茚地普隆的含量[J].分析化學(xué),2004,32（4）:451?455.KeelerJ[M].UnderstandingNMRspectros