ICS11.220B41中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19439—2004H5亞型禽流感病毒NASBA檢測(cè)方法ProtocolofdetectingavianinfiuenzavirussubtypeH5usingNASBA2004-02-14發(fā)布2004-02-15實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

GB/T19439-2004前高致病性禽流感由正粘病毒科流感病毒屬中A型流感病毒引起,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類(lèi)疾病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)檢測(cè)禽流感病毒的敏感性與經(jīng)典的雞胚病原分離方法相當(dāng).并具有檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、與雞旺病原分離方法符合率高、易于操作的特點(diǎn)。本標(biāo)準(zhǔn)是在綜合我國(guó)科研成果的基礎(chǔ)上,參考OIE《診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》(2000年版)并結(jié)合我國(guó)現(xiàn)有動(dòng)物衛(wèi)生法規(guī)及農(nóng)業(yè)部對(duì)禽流感的相關(guān)政策和措施制定的。本標(biāo)準(zhǔn)附錄A、附錄B、附錄C為規(guī)范性附錄，附錄D為資料性附錄本標(biāo)準(zhǔn)由上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局和中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局、上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局、香港基因品片開(kāi)發(fā)有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：?jiǎn)嗡扇A、陳家華、謝燕、楊錫全、倪旦紅、劉樂(lè)庭、劉俊平。

GB/T19439—2004H5亞型禽流感病毒NASBA檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了NASBA快速檢測(cè)H5亞型禽流感病毒技術(shù)規(guī)范的材料準(zhǔn)備、操作方法和結(jié)果判定本標(biāo)準(zhǔn)適用于禽類(lèi)、禽肉產(chǎn)品中H5亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)、診斷，規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件.其隨后所有的修改單(不包括勒誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn).然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T18936—2003高致病性禽流感診斷技術(shù)原理NASBA（Nueleicacidsequence-basedamplification·NASBA·依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)）是一項(xiàng)連續(xù)、等溫、基于酶反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)使用三種酶(反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、喔菌體T7核糖核酸聚合酶)和兩條寡核苷酸引物。上游引物5'末端含有喔菌體T7的依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，下游引物的5°末端含有和釘標(biāo)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針互補(bǔ)的序列。在擴(kuò)增步驃中.兩個(gè)5端都整合進(jìn)擴(kuò)增序列中.這樣既成為產(chǎn)生互補(bǔ)RNA序列的模板.又能特異性結(jié)合檢測(cè)步驃中的ECL探針。擴(kuò)增底物與ECL探針形成復(fù)合物，攜帶該復(fù)合物的磁珠被電極的表面磁性捕獲。電極上的電壓引起電化學(xué)發(fā)光（ECL)反應(yīng)。已雜交上的釘標(biāo)磁珠發(fā)出的光和擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的RNA擴(kuò)增產(chǎn)物總量成比例對(duì)應(yīng)。材料準(zhǔn)備武驗(yàn)環(huán)境干凈的環(huán)境,最好分區(qū)。分為核酸提取、核酸擴(kuò)增和核酸檢測(cè)三個(gè)區(qū)4.2器材采用常規(guī)的分子生物學(xué)器材，包括：一次性手套、移液器(量程5L到200L）、槍頭、無(wú)RNA酶的1.5mL塑料離心管、1.5mL離心管架、5mL試管架、旋渦振蕩器、計(jì)時(shí)器、高速臺(tái)式離心機(jī)、溫度計(jì)(精度士2C)、加熱器、水浴鍋、5mL聚丙烯試管(VWR)、封口膜等。如果采用ECL方法，需要NucliSens閱讀器或者等同的儀器如果采用ELISA方法·需要酶標(biāo)儀4.3物上游引物AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCAIAAAGA（C/T)AGACCAGCTAF游引物GATGCAAGGTCGCATATGAGGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGAC4.4檢測(cè)試劑所有檢測(cè)試劑在使用前，使其達(dá)到室溫裂解緩沖液：5mol/L異硫氰酸服.10%TritonX-100,10mmol/LTris