ICS11220

B41.

中華人民共和國國家標準

GB/T27539—2011

動物流感檢測A型流感病毒

通用熒光RT-PCR檢測方法

Animalinfluenzadetection—Methodofreal-timeRT-PCRfordetectionof

influenzavirusA

2011-11-21發(fā)布2012-03-01實施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

GB/T27539—2011

前言

本標準按照給出的規(guī)則起草

GB/T1.1—2009。

本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出

。

本標準由全國動物防疫標準化技術委員會歸口

(SAC/TC181)。

本標準起草單位中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局中華人民共和國廣東出入境檢驗檢疫

:、

局深圳匹基生物工程有限公司

、。

本標準主要起草人汪琳林志雄周琦高志強陳茹喬彩霞蒲靜楊偉梁成珠

:、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T27539—2011

動物流感檢測A型流感病毒

通用熒光RT-PCR檢測方法

1范圍

本標準規(guī)定了型流感病毒通用熒光檢測的操作方法

ART-PCR。

本標準適用于活動物及其產(chǎn)品中型流感病毒的檢測

A。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文

。,

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于本文件

。,()。

分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T6682

實驗室生物安全通用要求

GB19489

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術要求

GB/T19495.2

實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫

GB/T27401

進出口生熟毛皮檢驗規(guī)程

SN/T1330、

3縮略語

下列縮略語適用于本文件

。

值每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

Ct:(Ctvalue)

焦碳酸二乙酯

DEPC:(diethylpyrocarbonate)

磷酸鹽緩沖液配方見附錄

PBS:(A)(phosphatebuffersaline)

核糖核酸

RNA:(ribonucleicacid)

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應

RT-PCR:-(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)

4原理

流感病毒屬正粘病毒科根據(jù)抗原特性及其基因特性的不同流感病毒分為甲

(influenzavirus),,

乙丙型乙型變異性較弱丙型抗原性比較穩(wěn)定僅感染人類甲型抗原變異性最強

(A)、(B)、(C)。、,;(A),

感染人類和其他動物常引起世界性大流行編碼基質(zhì)蛋白的基因是型流感病毒共有且較保守

,。MA。

采用技術針對基因中特定序列合成一對特異性引物和一條特異性的熒光雙標記探針探

Taqman,M,,

針的端標記報告熒光基團端標記淬滅熒光基團在退火階段一對引物和一條探針

5′(R),3′(Q)。PCR,

同時與目的基因片段結(jié)合探針上基團發(fā)出的熒光信號被基團所吸收儀器檢測不到所發(fā)出的

,RQ,R

熒光信號在延伸階段酶在引物的引導下沿著模板鏈合成新鏈當鏈的延伸進行到探針結(jié)合

;PCR,Taq,

部位時受到探針的阻礙而無法繼續(xù)酶發(fā)揮外切核酸酶的功能將探針水解成單核苷酸標

,,Taq5′→3′,,

記在探針上的基團就游離出來所發(fā)出的熒光不為所吸收而被檢測儀所接收隨著反應的