10分子標(biāo)記及基因芯片技術(shù)及應(yīng)用10.1分子標(biāo)記技術(shù)和應(yīng)用10.2基因芯片技術(shù)及應(yīng)用10.1分子標(biāo)記技術(shù)和應(yīng)用概述RFLPAFLPRAPDSSR和ISSRSSCPSNPA分子標(biāo)記概述遺傳標(biāo)記的種類：形態(tài)標(biāo)記細(xì)胞標(biāo)記生化標(biāo)記

分子標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記是指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀。細(xì)胞標(biāo)記是指明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。生化標(biāo)記是指明確顯示生物大分子或生物化合物多態(tài)性的生化特征。同功酶：具有相同催化功能而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一類酶分子標(biāo)記廣義的分子標(biāo)記：可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白。包括蛋白質(zhì)標(biāo)記和DNA標(biāo)記。狹義的分子標(biāo)記只是指DNA標(biāo)記。具有高的多態(tài)性共顯性遺傳；能明確辨別等位基因；遍布整個(gè)基因組；選擇中性，即無基因多效性；檢測手段簡單快速；開發(fā)和使用成本低；重復(fù)性好。理想的分子標(biāo)記目前已開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)1.以電泳和分子雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記

RFLP，VNTR2.以電泳和PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記

SSR，RAPD，AFLP，SSCP，ISSR3.以DNA序列為核心的分子標(biāo)記SNP，ITS各種分子標(biāo)記的特點(diǎn)（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，不受季節(jié)、環(huán)境限制；（2）數(shù)量多，遍布整個(gè)基因組；（3）存在共顯性分子標(biāo)記；（4）選擇中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）檢測手段簡單迅速，可分析微量樣品B.RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)

限制性片段長度多態(tài)性

DNA某一位點(diǎn)上的變異有可能引起該位點(diǎn)特異性的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的改變，包括原有位點(diǎn)的消失或出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)，致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化。RFLP

操作RFLP與性狀的連鎖RFLP帶譜的分析RFLP特點(diǎn)共顯性（能夠區(qū)分雜合子和純合子）；無組織特異性，不受環(huán)境影響；數(shù)量豐富需要儀器設(shè)備多，試驗(yàn)操作復(fù)雜；DNA需要量大；大多數(shù)RFLP表現(xiàn)為二態(tài)性，提供信息量低；需要選用恰當(dāng)?shù)南拗泼?，才能表現(xiàn)較好的多態(tài)性。C.AFLP（amplifiedfragmentslengthpolymorphism

）

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性集合了RFLP和PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。AFLP的特點(diǎn)標(biāo)記豐富：使用少量引物得到大量標(biāo)記；高分辨率；兩步PCR擴(kuò)增，高效，高靈敏度，重復(fù)性好；不需要事先知道DNA序列，也具有通用性。費(fèi)用高，操作復(fù)雜；絕大多數(shù)顯性標(biāo)記，不能區(qū)分雜合子和純合子對DNA模板質(zhì)量、內(nèi)切酶質(zhì)量要求高（酶切充分）。D.RAPD

(randomamplifiedpolymorphicDNA)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

以基因組DNA為模板，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)的單個(gè)寡核甘酸序列（6-12bp）為引物，通過PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，用于檢測DNA序列的多態(tài)性。RAPD的數(shù)據(jù)分析RAPD的特點(diǎn)不需要探針，不需要已知DNA信息；對DNA需要量少，對質(zhì)量要求不高；技術(shù)簡單，分析自動化，成本低；操作簡單，無放射性物質(zhì)，檢測速度快，成本較低；可以轉(zhuǎn)化為SCAR（SequenceCharacterizedAmplifiedRegion）標(biāo)記。顯性遺傳，不能區(qū)分純合子和雜合子;PCR敏感，重復(fù)性差；存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但堿基序列組成不同的片段;需要篩選多態(tài)性高的引物。E.SSR和ISSRSSR（simplesequencerepeat）：簡單重復(fù)序列多態(tài)性，又稱微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)目不等而出現(xiàn)的多態(tài)現(xiàn)象。ISSR(inter-simplesequencerepeat)：:用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2-4個(gè)隨機(jī)核昔酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SSRGATGACCAACCAAGAGGCTGTTGATGAGATCAAAGACATCAAGGACGCACAGGCAGCTGCGAAGCATCTGACGGAGCATATATATATATATATAGGCGGTGAACAGGAAGAGCAAAGACGACATCTCCTGCGTCGTCGTAAACTTCCACTGCTAGCAGAGCTTGAAGCTGCTAGCCCCTCAAGTGTACAATTGCTTISSR檢測手段：

PAGE—高分辨率SSRISSRSSR和ISSR的特點(diǎn)多態(tài)性豐富，所需DNA量少共顯性,故可鑒別雜合子和純合子；操作簡單，穩(wěn)定可靠.一般檢測到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn).開發(fā)成本高，或需要對目標(biāo)生物具有一定的前期研究基礎(chǔ).結(jié)合了RAPD標(biāo)記技術(shù)和SSR標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，模板DNA用量少；標(biāo)記為顯性標(biāo)記，符合孟德爾遺傳規(guī)律。易操作。檢測兩個(gè)隨機(jī)存在的微衛(wèi)星位點(diǎn)。無需知道任何耙序列的SSR背景信息。SSRISSRSSR資源的挖掘構(gòu)建基因組或cDNA文庫EST數(shù)據(jù)庫搜尋法利用物種保守性微衛(wèi)星富集文庫F.SSCP(Single-StrandConformationPolymorphism)單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.電泳檢測SSCP測序檢測SSCPSSCP特點(diǎn)原理及操作簡便,周期短。成本低,所用試劑價(jià)格相對低廉。適用于大樣本篩選,常規(guī)方法在研究基因突變時(shí)需DNA測序,SSCP技術(shù)在測序前對DNA樣本進(jìn)行篩選。對DNA原始材料純度要求不高,且所需量較少。

PCR-SSCP技術(shù)并不能檢測變異的位置,且隨DNA片段長度增加,檢測的敏感性逐漸降低。E.SNP(singlenucleotidepolymorphism)SNP主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。其比較的