設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)（二）

動(dòng)物細(xì)胞融合

組員：王勇、鄧代進(jìn)、田維、杜星志動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)受精作用兩個(gè)細(xì)胞正在融合動(dòng)物細(xì)胞融合基本過程：誘導(dǎo)方法：誘導(dǎo)方式物理法：化學(xué)法：生物法：滅活的病毒電刺激聚乙二醇PEG聚乙二醇PEG具有強(qiáng)烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白質(zhì)的作用，能夠有效地促進(jìn)植物原生質(zhì)體和動(dòng)物細(xì)胞的融合。在不同種類的動(dòng)物細(xì)胞混合液中加入聚乙二醇，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞凝集作用；在稀釋和除去聚乙二醇的過程中，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞融合。聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，但是它有一定毒性，對(duì)有些細(xì)胞(如卵細(xì)胞)不適用。聚乙二醇PEG誘導(dǎo)融合實(shí)驗(yàn)原理：

利用PEG介導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合，其實(shí)驗(yàn)原理到目前為止還沒有完全定論。學(xué)者們一般認(rèn)為，PEG改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜，在修復(fù)時(shí)相互合并在一起,使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通,從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。

利用PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合,其融合效果受以下幾種因素的影響：PEG的分子量與濃度:

細(xì)胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高,對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的PEG分子量一般為1000~4000，濃度一般為40~60%。2.PEG的pH值:

經(jīng)驗(yàn)證，PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果最好。3.PEG的處理時(shí)間:

處理時(shí)間越長(zhǎng)，融合效果越好,但對(duì)細(xì)胞的毒害也就越大。故一般將處理時(shí)間限制在1分鐘之內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞融合后無需繼續(xù)培養(yǎng),故處理時(shí)間可適當(dāng)放寬至數(shù)分鐘。4.融合時(shí)的溫度:

由于生物膜膜的流動(dòng)性與溫度成正比，故細(xì)胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果,在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度。對(duì)于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞,一般采用的溫度為38~40℃。

而本次試驗(yàn)基本在37℃的條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)選材：本次試驗(yàn)選用雞的外周血做細(xì)胞融合材料,這是因?yàn)?1.雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核，便于對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行鑒別；2.實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得，避免了用培養(yǎng)的細(xì)胞株做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)材料所耗的實(shí)驗(yàn)成本和精力；3.細(xì)胞融合與否，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來進(jìn)行鑒別。若細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)核，定為未融合細(xì)胞；有二至多個(gè)核，定為融合細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟：取新鮮雞血,制成體積分?jǐn)?shù)10%雞紅細(xì)胞懸液。稱0.5gPEG(MW=4000)，熔化。盡快加入0.5ml預(yù)熱80℃的Hanks

液，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%PEG，輕輕搖勻，散溫，置37℃恒溫水浴箱中備用（以防冷卻后會(huì)形成結(jié)晶）。吸取1mL

懸液置刻度離心管中,另加5mLHanks液,混勻,離心（1000r/min）5min

。吸取0.5mlPEG加入雞紅細(xì)胞沉淀管內(nèi)，1min內(nèi)加入離心管中，邊滴邊搖晃（此過程必須在37℃水浴箱中進(jìn)行）。靜置1min后，加入9mlHanks液，輕輕吹打混勻，在37℃水浴箱中放置10min。吸棄上清液，使沉淀物松散，置37℃水浴箱中維持。離心（1000r/min）5min,吸棄上清液，加入1ml不含血清的1640培養(yǎng)液，混勻后取1滴懸液制成臨時(shí)裝片。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%的次甲基藍(lán)染色。鏡檢。離心（1000r/min）5min,吸棄上清液，加入3ml含小牛血清的1640培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，置37℃水浴箱中溫育30min。注意事項(xiàng)：1、注意PEG濃度和作用時(shí)間等，即在制備雞紅細(xì)胞沉淀物時(shí)，一定不要有殘留的液體存在，并且要在37℃水浴鍋中于15min內(nèi)全部滴完P(guān)EG，這樣融合的效果最好；2、制備50%PEG完后，需置于37℃恒溫水浴箱中備用，以防冷卻后會(huì)形成結(jié)晶；討論：經(jīng)過小組成員內(nèi)部討論和查閱資料，我們對(duì)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)的選材有了補(bǔ)充：我們也可以用蟾蜍血紅細(xì)胞進(jìn)行這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，并且蟾蜍血紅細(xì)胞也易取得。同時(shí)也可做蟾蜍血紅細(xì)胞與雞血紅細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)，但實(shí)驗(yàn)試劑需要改變：1、Alsver液：葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，氯化鈉0.42g，加重蒸水至100mL即可。4、Ringer溶液：二氯化鈉0.25g，氯化鉀0.42g,氯化鈉6.5g,溶于1000mL重蒸水中。3、GKN液：氯化鈉8g,氯化鉀0.4g,磷酸氫二鈉1.77g,磷酸二氫鈉0.69g,葡萄糖2g，酚紅0.01g,溶于1000mL重蒸水中。2、0.85%生理鹽水：0.85g氯化鈉溶于100mL重蒸水中。5、50%PEG混合液：稱取少許PEG（Mv=4000）放入刻度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱，使其熔化，待冷卻至50℃時(shí)，放入預(yù)熱至50℃的等體積的GKN液，混勻。（注意使用前配置）

但從上述過程看來，實(shí)際配制過程較為繁瑣，因此，我們還是選擇雞血紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞核的分離和鑒定

實(shí)驗(yàn)原理

一、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核

１.破碎細(xì)胞細(xì)胞破碎的方法機(jī)械法高速組織搗碎機(jī)玻璃勻漿器研缽物理法超聲勻漿器凍融法化學(xué)法自溶法酶處理表面活性劑處理法細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的比重和大小等都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同介質(zhì)和不同轉(zhuǎn)速的離心，將細(xì)胞各種組分分級(jí)分離出來(cellfractionation)。２.離心技術(shù)組織細(xì)胞勻漿分級(jí)分離分析離心方法差速沉降離心法

速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)帶離心法

差速離心法differentialcentrifugation原理：由低速到高速逐漸沉降將不同大小的顆粒分離。加速低速高速差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差較大（一般為10倍）的顆粒。

二、細(xì)胞核的鑒定本次試驗(yàn)細(xì)胞選擇的是小白鼠的肝細(xì)胞，這是因?yàn)楦渭?xì)胞分裂旺盛。鑒定試劑：甲苯胺藍(lán)細(xì)胞來源：

甲苯胺藍(lán)是常用的人工合成染料的一種,屬于醌亞胺染料類,這類染料一般含有兩個(gè)發(fā)色團(tuán),一個(gè)是胺基,一個(gè)是醌型苯環(huán),來構(gòu)成色原顯色。染料除有發(fā)色團(tuán)外,還要有能使色原對(duì)組織及其他被染物產(chǎn)生親和力的原子團(tuán)即助色。助色團(tuán)能促使染料產(chǎn)生電離成鹽類,幫助發(fā)色團(tuán)對(duì)組織產(chǎn)生染色力,使切片上的組織細(xì)胞著色。甲苯胺藍(lán)不僅含有兩個(gè)發(fā)色團(tuán),還含有兩個(gè)助色團(tuán),為堿性染料,因此可以和組織細(xì)胞的酸性物質(zhì)結(jié)合而使其染色。即可染細(xì)胞核使之呈藍(lán)色。另外，肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍(lán)可呈易染性紫紅色，因此可用于肥大細(xì)胞的檢測(cè)，例如色素性蕁麻疹。

實(shí)驗(yàn)步驟：1、頸椎脫臼法處死小白鼠。迅速開腹取肝，在盛有生理鹽水的小燒杯中反復(fù)洗滌。2、稱取濕重約1g的肝組織，量取8ml預(yù)冷的勻漿緩沖液（0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化鈣溶液）并加入燒杯中，盡量剪碎肝組織。3、將剪碎的肝組織倒入勻漿器勻漿（勻漿器下段浸入盛有冰塊的小燒杯中保持低溫），搗毀組織，直至看不到明顯的組織塊。4、勻漿徹底后，8層紗布過濾（先用少量勻漿緩沖液潤(rùn)濕紗布），濾液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中。5、平衡離心管，離心10min(2500r/min),將上清移入另一玻璃離心管中。取上清液制一張