第四章電子顯微分析發(fā)育中的擬南芥花芽

掃描電子顯微鏡拍攝，人工上色，萼片為綠色，花瓣為紅色，花藥為橙色，柱頭未上色。圖為西番蓮花粉的掃描電子顯微鏡照片4.1引言-電子光學基礎

4.1.1分辨本領

1)人的眼睛僅能分辨0.1~0.2mm的細節(jié)

2)光學顯微鏡，人們可觀察到象細菌那樣小的物體。

3)用光學顯微鏡來揭示更小粒子的顯微組織結構是不可能的，受光學顯微鏡分辨本領(或分辨率)的限制。

分辨本領

指顯微鏡能分辨的樣品上兩點間的最小距離。以物鏡的分辨本領來定義顯微鏡的分辨本領。1、光的折射現(xiàn)象及成像原理ABB`A`..FFL1L2一個物體可看作是由許多物點所組成，每一個物點散射的光經(jīng)透鏡后都會聚在相應的像點上，許多的像點就構成了物體的像。透鏡成像公式：放大倍數(shù)：2、光的衍射現(xiàn)象和分辨本領的極限由于光的衍射，使得由物平面內(nèi)的點A、B在象平面形成一A`、

B`圓斑，圓斑由具有一定尺寸的中央亮斑及其周圍明暗相間的圓環(huán)組成，稱為埃利斑（Airy斑）。Rn－透鏡物方介質(zhì)的折射率λ－照明光波長α－透鏡孔徑半角，即入射光束與透鏡主軸的夾角；

nsinα

－數(shù)值孔徑M－放大倍數(shù)圖（1）兩個Airy斑明顯可分辨出。圖（2）兩個Airy斑剛好可分辨出。圖（3）兩個Airy斑分辨不出。R將剛好可分辨出的兩Airy斑中心間距相應于兩個物點間距離△r0定義為顯微鏡能分辨出的最小距離，此即透鏡的分辨本領。一般來說，孔徑角較大時為70－75°，n約為1.5,則nsinα約為1.25-1.35,故：波長是透鏡分辨率大小的決定因素。

透鏡的分辨本領主要取決于照明束波長λ。若用波長最短的可見光(λ=400nm)作照明源，

則

d0=200nm

200nm是光學顯微鏡分辨本領的極限提高透鏡的分辨本領：增大數(shù)值孔徑是困難的和有限的，唯有尋找比可見光波長更短的光線才能解決這個問題。知識補充2014年諾貝爾化學獎給了三個物理學家：艾力克·貝齊格（EricBetzig）、斯特凡·W·赫爾（StefanW.Hell）和W·E·莫納（W.E.Moerner），以表彰他們對于發(fā)展超分辨率熒光顯微鏡做出的卓越貢獻。他們的突破性工作使光學顯微技術進入了納米尺度，從而使科學家們能夠觀察到活細胞中不同分子在納米尺度上的運動。貝齊格赫爾莫納4.1.2電子束的波長

比可見光波長更短的有：

1）紫外線——會被物體強烈的吸收；

2）X射線——無法使其會聚；

3）電子波根據(jù)德布羅意物質(zhì)波的假設，即電子具有微粒性，也具有波動性。電子波

h——Plank常數(shù)，

m——v——電子速度

初速度為0的自由電子從零電位開始運動，因受到加速電壓U的作用獲得速度為v：

1/2mv2=eU

當電子速度v遠遠小于光速C時，電子質(zhì)量m近似等于電子靜止質(zhì)量m0，由上述兩式整理得：

電子波長與加速電壓平方根成反比，即加速電壓越高，電子波長越短，但當電壓很高時，電子質(zhì)量需引入相對論進行校正。

將常數(shù)代入上式，并注意到電子電荷e的單位為庫侖，h的單位為J·s，我們將得到：

［nm］

表1不同加速電壓下的電子波長

加速電壓/kV2030501002005001000電子波長/10-3nm8.596.985.363.702.511.420.687一般電鏡的加速電壓為50－200KV,100KV以上的為超高壓電鏡。

當加速電壓為100kV時，電子束的波長約為可見光波長的十萬分之一。因此，若用電子束作照明源，顯微鏡的分辨本領要高得多。但是，電磁透鏡的孔徑半角的典型值僅為10-2-10-3rad。如果加速電壓為100kV，孔徑半角為10-2rad，那么分辨本領為：

d0=0.61×3.7×10-3/10-2=0.225nm4.1.3電磁透鏡電鏡中用來對電子束聚焦的是電磁透鏡，簡單的電磁透鏡就是一個通電的短線圈。通電線圈所產(chǎn)生的磁場對電子束有聚焦成像的作用。其焦點f為：式中，V0-電壓；R-透鏡半徑；I-電流；N-線圈匝數(shù)；

A-與透鏡結構有關的比例常數(shù)改變電流可以方便調(diào)整透鏡的焦距，從而使放大倍數(shù)發(fā)生改變1、電磁透鏡的焦距電磁透鏡結構示意圖

控制電子束的運動在電子光學領域中主要使用電磁透鏡裝置。但電磁透鏡在成像時會產(chǎn)生像差－由于透鏡物理條件的限制，所成的像會模糊不清或發(fā)生畸變，形成的所有缺陷和偏差統(tǒng)稱為像差。

像差分為幾何像差和色差兩類。

幾何像差：由于透鏡磁場幾何形狀上的缺陷而造成的像差。主要指球差和像散。

色差：由于電子波的波長或能量發(fā)生一定幅度的改變而造成的像差。2、電磁透鏡的像差與分辨本領

透鏡的實際分辨本領除了與衍射效應有關以外，還與透鏡的像差有關。

光學透鏡，已經(jīng)可以采用凸透鏡和凹透鏡的組合等辦法來矯正像差，使之對分辨本領的影響遠遠小于衍射效應的影響;

但電子透鏡只有會聚透鏡，沒有發(fā)散透鏡，所以至今還沒有找到一種能矯正球差的辦法。這樣，像差對電子透鏡分辨本領的限制就不容忽略了。（1）球差即球面像差，是由于電磁透鏡的中心區(qū)域和邊緣區(qū)域?qū)﹄娮拥恼凵淠芰Σ环项A定的規(guī)律而造成的。離主軸較遠的電子比主軸附近的電子被折射程度要大，當物點P通過透鏡成像時，電子就不會聚到同一焦點上，而形成一個散焦斑。得到的最小散焦斑的半徑用Rs表示。若把Rs除以放大倍數(shù)，就可以把其折算到物平面上去，大小為：也就是說，當物平面上兩點距離小于2rs時，則透鏡不能分辨。rs可通過下式計算：Cs為球差系數(shù)，α為孔徑半角。采用小孔徑成像是減少球差的有效途徑。(2)色差：是由于入射電子波長（或能量）的非單一性造成。電子束的能量變化率取決于加速電壓的穩(wěn)定性和電子穿過樣品時發(fā)生非彈性散射的程度。（3）電磁透鏡的分辨本領電磁透鏡的分辨本領由衍射效應和球面像差來決定。

衍射效應對分辨本領的影響：Δr0=0.61λ/Nsinα

球差對分辨率的影響：必須確定一個最佳孔徑半角，使得衍射效應Airy斑和球差散焦斑尺寸大小相等時，表明兩者對透鏡分辨本領影響效果一樣。目前電鏡的最佳分辨本領達到了0.1nm數(shù)量級。3、電磁透鏡的景深和焦長電磁透鏡的特點是景深大（場深），焦長很長。透鏡的景深是指在保持像清晰的前提下，試樣在物平面上下沿鏡軸可移動的距離Dr。換言之，在景深范圍內(nèi)，樣品位置的變化并不影響物像的清晰度。從原理上講，當透鏡焦距、像距一定時，只有一層樣品平面與透鏡的理想物平面重合，能在透鏡像平面上獲得該層平面的理想圖象，而偏離理想物平面的物點都存在一定程度的失焦，他們在透鏡像平面上將產(chǎn)生具有一定尺寸的失焦圓斑，如果失焦圓斑尺寸不超過由衍射效應和像差引起的散焦斑，那么對透鏡像分辨本領并不產(chǎn)生影響。Dr與電磁透鏡分辨率△r0、孔徑半角α之間的關系：取Δr0=1nm,

α=10-2～10-3rad則

Dr

=200～2000nm試樣（薄膜）一般厚200～300nm，上述景深范圍可保證樣品整個厚度范圍內(nèi)各個結構細節(jié)都清晰可見。藍寶石襯底表面形貌觀察

表面三維島狀結構焦長：指物點固定不變（物距不變），在保持成像清晰的條件下，像平面沿透鏡軸線可移動的距離。

當透鏡焦距、物距一定時，像平面在一定的軸向距離內(nèi)移動，也會引起失焦。如果失焦尺寸不超過由衍射效應和像差引起的散焦斑，那么像平面在一定的軸向距離內(nèi)移