第三章基因克隆載體

Chapter3GeneCloningVector1/321計劃學(xué)時:4h第一節(jié)質(zhì)粒載體(plasmidvector)第二節(jié)病毒載體(virusvector)第三節(jié)染色體定位整合載體(chromosomepositionfixingvectors)第四節(jié)酵母人工染色體載體(YACvector)第五節(jié)特殊用途的載體2/322克隆載體的定義通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細胞，并在其中得以維持的DNA分子。3/323載體的特點有多克隆位點,供外源DNA插入。多克隆位點(multiplecloningsite,polylinker):具有多個限制酶的識別序列,可供處源DNA片段插入.攜帶外源DNA進入受體細胞(receptorcell,hostcell)，并能自我復(fù)制。有選擇標記基因(markergene),例如：抗抗生素基因。載體要安全，對受體安全，不能轉(zhuǎn)入其他生物，尤其人細胞。4/324Theessentialnucleotidesequencesofcloningvectors:Areplicationorigin,Adrug-resistancegene,Multiplecloningsites.復(fù)制起始位點抗氨芐青霉素基因多克隆位點5/325第一節(jié)質(zhì)粒Plasmid1.1定義細菌染色體之外的能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

Circular,double-strandedDNA(dsDNA)thatareseparatedfromthechromosomalDNAinbacteria.1質(zhì)粒的特點6/326質(zhì)粒載體(Plasmidvector):以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建(construct)而成的克隆載體。構(gòu)型:超螺旋supercoilRelaxedDNASupercoilDNA7/3271.2質(zhì)粒的大小天然質(zhì)粒:1kb~100kb質(zhì)粒載體較小,有的只有3kb,具有作為載體的必須序列即可。200kb3kb8/3281.3質(zhì)粒的復(fù)制Replication每次細胞分裂，質(zhì)粒均可復(fù)制傳給子代細胞。一般，細胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)保持穩(wěn)定。9/329松馳型質(zhì)粒：拷貝數(shù)多，小質(zhì)粒。嚴緊型質(zhì)粒：拷貝數(shù)少，大質(zhì)粒。200kb<5kb10/32101.4質(zhì)粒的不親合性能寓于同一細胞的質(zhì)粒為親合性質(zhì)粒不能寓于同一細胞的質(zhì)粒為不親合性質(zhì)粒。布什本.拉登布什布萊爾受體細胞最好無內(nèi)源質(zhì)粒.11/32111.5質(zhì)粒的遷移性接合質(zhì)粒：含有tra基因，可連接宿主細胞和受體細胞，并在兩者間轉(zhuǎn)移。

特點:

大，拷貝數(shù)少，宿主多，不安全。非接合質(zhì)粒：無tra基因，

特點:

小，拷貝多，宿主少，安全，常用載體。接合質(zhì)粒染色體12/3212隱蔽質(zhì)粒：引入后，受體細胞的遺傳特性無變化。顯性質(zhì)粒：引入后，為受體細胞提供了新的遺傳特性。如：抗抗生素，顏色變化等。1.6顯性質(zhì)粒與隱蔽質(zhì)粒13/32132質(zhì)粒載體的構(gòu)建2.1選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒，并用限制酶切開。好的質(zhì)粒應(yīng)具備：復(fù)制起始位點（ReplicationOrigin，Ori）標記基因（Markergene）多克隆位點（Multiplecloningsite）啟動子（Promoter）終止子（Terminator）14/3214多克隆位點標記基因Ori啟動子終止子EcoRI合適的質(zhì)粒15/32152.2獲得合適的DNA片段.DNA也要用限制酶切開，有兩個粘性末端。易于DNAligase連接.16/32162.3、重組連接混合酶切后的DNA片段和載體，加入DNAligase催化連接。17/3217質(zhì)?？寺?018/32183Ti質(zhì)粒載體Ti質(zhì)粒:農(nóng)桿菌中可引起寄主產(chǎn)生腫瘤的質(zhì)粒。Tiplasmid(tumor-inducingplasmid)農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)19/32193.1Ti質(zhì)粒的組成（4個功能區(qū)）（1）T-DNATi質(zhì)粒中能轉(zhuǎn)移進入植物細胞內(nèi)的DNA片段。長約20kb，包含冠癭堿合成和冠癭瘤生長基因20/3220T-DNA的結(jié)構(gòu)特征：

T-DNA區(qū)兩端具有25個堿基對的順向重復(fù)序列稱為邊界序列。21/3221右邊界序列更重要。去除右邊界序列，將使T-DNA失去轉(zhuǎn)移和整合的功能；左邊界的缺失，對無明顯影響。22/3222Leftborderrightborder只要保留邊界序列，T-DNA的其它序列被外源DNA片段替換，仍可轉(zhuǎn)入植物基因組。23/3223（2）

Vir區(qū):位于T-DNA上游的一組基因，可引起T-DNA的轉(zhuǎn)移，長度約35kb

（3）

Con區(qū)：含有與農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra），使Ti質(zhì)粒在細菌間轉(zhuǎn)移。（4）

Ori區(qū)：復(fù)制起始區(qū).24/3224LeftborderrightborderLeftborderrightborderVirregionConregionOriregion25/3225農(nóng)桿菌感染后，植物細胞接受刺激釋放信號分子，反過來激活農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的vir基因；農(nóng)桿菌粘附到植物細胞壁。植物激素誘導(dǎo)vir基因表達，其表達產(chǎn)物引起T-DNA脫離質(zhì)粒并位移進入植物細胞中,進入植物細胞的T-DNA整合并表達。3.2基因轉(zhuǎn)化過程26/32Leftborderrightborder263.2、Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建(Construction)構(gòu)建Ti質(zhì)粒克隆載體不是真正用于農(nóng)桿菌，而是用于植物，農(nóng)桿菌起介導(dǎo)作用。27/3227共整合載體法：將目的基因克隆引入常規(guī)質(zhì)粒，在目的基因兩側(cè)分別引入T-DNA左右邊界.轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，經(jīng)內(nèi)同源重組，將目的基因整合到農(nóng)桿菌的T-DNA區(qū)，再轉(zhuǎn)化植物。28/3228Bacteriacelltransfer同源重組共整合載體法plasmidLeftborderrightborderAimgeneplantcellTiplasmidInfectplantcell29/3229二元載體法利用Vir區(qū)和T-DNA區(qū)（具Tborders）分別構(gòu)建兩個質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。Vir區(qū)基因群反式作用，將含外源基因的T-DNA轉(zhuǎn)入植物染色體。30/3230plantcellChromosomeDNABacteriacellInfectplanttransferplasmidPlasmid-1plasmidrightborderLeftborderAimgeneVirreg