免疫熒光細胞化學第1頁/共14頁免疫熒光細胞化學04081008冷雪飛第2頁/共14頁

抗體(或抗原)

熒光抗體（或抗原）

熒光素

相應(yīng)抗原（或抗體）

復(fù)合物原理第3頁/共14頁再發(fā)射約10-9s內(nèi)發(fā)生稱為熒光

第4頁/共14頁免疫熒光細胞化學技術(shù)用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術(shù)。

直接法、夾心法、間接法、補體法。

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檢查抗原法檢查抗體法

直接法第6頁/共14頁檢查抗原法

這是最早的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法很特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，且敏感性較差

第7頁/共14頁雙重免疫熒光標記法

在同一細胞組織標本上需要同時檢查兩種抗原時，要進行雙重熒光染色，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗A和抗B）以適當比例混合，加在標本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。

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檢查抗體法（夾心法）

先用特異性抗原與細胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。間接法第9頁/共14頁用已知抗原細胞或組織標本的切片，加上待檢血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（特異性IgG熒光抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。

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檢查抗原法(雙薄片)

先用特異性（對細胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱第一抗體）與細胞標本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（也稱第二抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。

間接法第11頁/共14頁

直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法間接檢查組織內(nèi)抗原法補體法第12頁/共14頁

將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原補體抗體反應(yīng)，補體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應(yīng)，形成抗原抗體—抗補體熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各