農(nóng)學(xué)酶學(xué)與酶工程第1頁/共92頁第二節(jié)酶學(xué)與酶工程

酶的分類、組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制酶作為催化劑的顯著特點(diǎn)酶抑制作用的概念和分類可逆抑制作用不可逆抑制作用酶抑制劑的應(yīng)用第2頁/共92頁一、酶的分類、組成、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制酶的分類：酶的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)酶的作用機(jī)制第3頁/共92頁1．酶的分類：氧化還原酶轉(zhuǎn)移酶水解酶裂合酶異構(gòu)酶連接酶（合成酶）核酸酶（催化核酸）第4頁/共92頁（1）氧化還原酶(Oxidoreductase)包括脫氫酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、過氧化物酶、氧合酶、細(xì)胞色素氧化酶等第5頁/共92頁（2）轉(zhuǎn)移酶(Transferase)包括酮醛基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶、糖苷基轉(zhuǎn)移酶、含氮基轉(zhuǎn)移酶等第6頁/共92頁（3）水解酶(Hydrolase)脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需輔酶第7頁/共92頁（4）裂合酶(Lyase)這類酶可脫去底物上某一基團(tuán)留下雙鍵，或可相反地在雙鍵處加入某一基團(tuán)。第8頁/共92頁（5）異構(gòu)酶(Isomerase)此類酶為生物代謝需要對(duì)某些物質(zhì)進(jìn)行分子異構(gòu)化，分別進(jìn)行外消旋、差向異構(gòu)、順反異構(gòu)等第9頁/共92頁（6）連接酶（合成酶）

(LigaseorSynthetase)這類酶關(guān)系很多生命物質(zhì)的合成，其特點(diǎn)是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作為結(jié)合能源，有的還需金屬離子輔助因子。分別形成C-O鍵（與蛋白質(zhì)合成有關(guān)）、C-S鍵（與脂肪酸合成有關(guān)）、C-C鍵和磷酸酯鍵。

第10頁/共92頁（7）核酸酶（催化核酸）Ribozyme核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng)。第11頁/共92頁酶用于生物催化的概況類別占總酶比例%利用率%水解酶hydrolases2665氧化還原酶oxidoreductases2725轉(zhuǎn)移酶transferases245裂合酶lyases12~5異構(gòu)酶isomerases5~1連接酶ligases6~1第12頁/共92頁2．酶的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)單體酶寡聚酶多酶復(fù)合體第13頁/共92頁（1）多酶復(fù)合體的組成部分輔因子：酶蛋白中非蛋白質(zhì)部分，它可以是無機(jī)離子也可以是有機(jī)化合物。輔酶：有機(jī)輔因子與酶蛋白結(jié)合松散即為輔酶。輔基：有機(jī)輔因子與酶蛋白結(jié)合緊密即為輔基。第14頁/共92頁3．酶的作用機(jī)制酶的作用過程酶與底物的結(jié)合模型酶的催化作用第15頁/共92頁1）酶的作用過程酶的活性部位：是它結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是整個(gè)酶分子相當(dāng)小的部分，它是由在線性多肽中可能相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維實(shí)體。第16頁/共92頁2）酶與底物的結(jié)合模型a．鎖和鑰匙模型b．誘導(dǎo)鍥合模型第17頁/共92頁a．鎖和鑰匙模型第18頁/共92頁b．誘導(dǎo)鍥合模型第19頁/共92頁3）酶的催化作用（1）研究方法（2）影響酶的催化作用第20頁/共92頁（1）研究方法a.從非酶系統(tǒng)模式獲得催化作用規(guī)律b.從酶的結(jié)構(gòu)與功能研究中得到催化作用機(jī)理的證據(jù)。第21頁/共92頁（2）影響酶的催化作用a.廣義的酸堿催化b.共價(jià)催化c.鄰近效應(yīng)及定向效應(yīng)d.變形或張力e.酶的活性中心為疏水區(qū)域第22頁/共92頁a.廣義的酸堿催化能供給質(zhì)子的物質(zhì)即為酸，能接受質(zhì)子的物質(zhì)即為堿例HA=A-+H+HA為酸，A-為堿例HA（酸）+A=AXH（酸催化）AXH+B-（堿）=Y+BH+A-（堿催化）第23頁/共92頁b.共價(jià)催化底物與酶以共價(jià)方式形成中間物。這種中間物可以很快轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨艽鬄榻档偷霓D(zhuǎn)變態(tài)，從而提高催化反應(yīng)速度第24頁/共92頁b.共價(jià)催化親電試劑：一種試劑具有強(qiáng)烈親和電子的原子中心。親核試劑：就是一種試劑具有強(qiáng)烈供給電子的原子中心。第25頁/共92頁c.鄰近效應(yīng)及定向效應(yīng)所謂鄰近效應(yīng)就是底物的反應(yīng)基團(tuán)與酶的催化基團(tuán)越靠近，其反應(yīng)速度越快。第26頁/共92頁d.變形或張力第27頁/共92頁e.酶的活性中心為疏水區(qū)域酶的活性中心為酶分子的凹穴此處常為非極性或疏水性的氨基酸殘基第28頁/共92頁第一節(jié)結(jié)束酶的分類：酶的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)酶的作用機(jī)制氧化還原酶轉(zhuǎn)移酶水解酶裂合酶異構(gòu)酶連接酶

單體酶寡聚酶多酶復(fù)合體

酶的作用過程

酶與底物的結(jié)合模型

酶的催化作用廣義的酸堿催化共價(jià)催化鄰近效應(yīng)及定向效應(yīng)變形或張力酶的活性中心為疏水區(qū)域鎖和鑰匙模型誘導(dǎo)鍥合模型第29頁/共92頁二、酶作為催化劑的顯著特點(diǎn)催化能力專一性調(diào)節(jié)性第30頁/共92頁1.催化能力催化轉(zhuǎn)換數(shù)：每個(gè)酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的分子數(shù)。一般為103min-1，碳酸酐酶最高為3.6*107min-1有酶加入比無酶參加反應(yīng)速度一般要高107-1013第31頁/共92頁2.專一性絕對(duì)專一：只催化一種底物進(jìn)行快速反應(yīng)，甚至是立體專一性相對(duì)專一性：基團(tuán)專一和鍵專一第32頁/共92頁3.調(diào)節(jié)性酶濃度的調(diào)節(jié)激素調(diào)節(jié)共價(jià)修飾調(diào)節(jié)限制性蛋白水解作用與酶活力調(diào)控抑制劑的調(diào)節(jié)反饋調(diào)節(jié)金屬離子和其他小分子化合物的調(diào)節(jié)第33頁/共92頁催化能力專一性調(diào)節(jié)性酶作為催化劑的顯著特點(diǎn)絕對(duì)專一相對(duì)專一1.酶濃度的調(diào)節(jié)2激素調(diào)節(jié)3.共價(jià)修飾調(diào)節(jié)4.限制性蛋白水解作用與酶活力調(diào)控5.抑制劑的調(diào)節(jié)6.反饋調(diào)節(jié)7.金屬離子和其他小分子化合物的調(diào)節(jié)第34頁/共92頁三、酶抑制作用的概念和分類概念抑制程度的表示抑制作用的分類抑制作用的定義第35頁/共92頁1、概念：能降低酶催化反應(yīng)速度的因素失活作用抑制作用去激活作用4.阻遏作用第36頁/共92頁1）.失活作用失活作用是指由于一些物理因素和化學(xué)試劑部分或全部破壞了酶的三維結(jié)構(gòu)，即引起酶蛋白變性，導(dǎo)致部分或全部喪失活性。第37頁/共92頁2）.抑制作用抑制作用是指在酶不變性的情況下，由于必需基團(tuán)或活性中心化學(xué)性質(zhì)的改變而引起的酶活性的降低或喪失。第38頁/共92頁3）.去激活作用去激活作用，某些酶只有在金屬離子存在下才有活性，去除金屬離子也會(huì)引起這些酶活性的降低或喪失。第39頁/共92頁4）.阻遏作用阻遏作用指某些因素（如激素或藥物等）使細(xì)胞內(nèi)酶蛋白的合成減少，反應(yīng)速度的降低是由于酶分子數(shù)量的減少，每分子酶的催化效力并無變化.第40頁/共92頁2.抑制程度的表示

一般用反應(yīng)速度的變化來表示。若以不加抑制劑時(shí)的反應(yīng)速度為Vo，加入抑制劑后的反應(yīng)速度為Vi，則酶的抑制程度有下列幾種表示方法：第41頁/共92頁2.抑制程度的表示：相對(duì)活力分?jǐn)?shù)（殘余活力分?jǐn)?shù)）

a=Vi/Vo相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)（殘余活力百分?jǐn)?shù)）

a%==Vi/Vo*100%抑制分?jǐn)?shù)指被抑制而失去活力的分?jǐn)?shù)i=1-a=1-Vi/Vo抑制百分?jǐn)?shù)

i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100%

通常所謂抑制率是指抑制分?jǐn)?shù)或抑制百分?jǐn)?shù)。第42頁/共92頁3.抑制作用的分類不可逆抑制作用（非專一性不可逆抑制作用；專一性不可逆抑制作用）可逆抑制作用（競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，混合型抑制）第43頁/共92頁四.抑制作用的定義不可逆抑制作用可逆抑制作用第44頁/共92頁1）.不可逆抑制作用抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合而引起酶活性喪失，不能用透析，超濾或凝膠過濾等物理方法去除抑制劑而使酶復(fù)活者，稱為不可逆抑制作用。第45頁/共92頁2）.可逆抑制作用抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合而引起酶活性的降低或喪失，能用物理的方法除去抑制劑而使酶復(fù)活者稱為可逆抑制作用。第46頁/共92頁5．可逆抑制和不可逆抑制作用的鑒別除了根據(jù)上述透析，過濾等物理方法視其能否去除抑制劑來區(qū)別不可逆抑制和可逆抑制作用外，還可以利用下列兩種動(dòng)力學(xué)方法來加鑒別。第47頁/共92頁第48頁/共92頁方法1第49頁/共92頁方法2第50頁/共92頁一概念二抑制程度的表示三抑制作用的分類四抑制作用的動(dòng)力學(xué)方法鑒別1.失活作用2.抑制作用3.去激活作用4.阻遏作用1．不可逆抑制作用2．可逆抑制作用1．相對(duì)活力分?jǐn)?shù)2．相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)3．抑制分?jǐn)?shù)4．抑制百分?jǐn)?shù)第51頁/共92頁四、可逆抑制作用競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用反競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性其他可逆抑制第52頁/共92頁1競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的含義競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的機(jī)理競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用舉例過渡態(tài)的類似物作為競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑第53頁/共92頁1）.競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的含義第54頁/共92頁2）.競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的機(jī)理競(jìng)爭(zhēng)性抑制的機(jī)理

1抑制劑與底物在結(jié)構(gòu)上有類似之處2可能結(jié)合在底物所結(jié)合的位點(diǎn)（如結(jié)合基團(tuán)）上，從而阻斷了底物和酶的結(jié)合3降低酶和底物的親和力。第55頁/共92頁3）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用舉例舉例某些藥物或體內(nèi)代謝物對(duì)酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用藥物（抑制劑）被抑制的酶競(jìng)爭(zhēng)底物臨床應(yīng)用及機(jī)理磺胺藥二氫葉酸合成酶（細(xì)菌）苯甲酸抗菌作用（抑制四氫葉酸）氨基蝶呤二氫葉酸還原酶二氫葉酸抗白血病5-氟尿嘧啶（5-FU）尿嘧啶核苷磷酸化酶（胸腺嘧啶核苷磷酸化酶）尿嘧啶（胸腺嘧啶）抗癌作用（抑制核苷酸合成）別嘌呤醇黃嘌呤氧化酶黃嘌呤，次黃嘌呤抗通風(fēng)（抑制尿酸生成）6-氨基已酸纖溶酶-賴氨酸-氨基酰止血，抗纖溶（抑制纖溶酶）苯丙胺（麻黃素）單胺氧化酶腎上腺素（去甲腎上腺素）中樞興奮，抗哮喘第56頁/共92頁4）過渡態(tài)的類似物作為競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑所謂過渡態(tài)底物是指底物和酶結(jié)合成中間復(fù)合體后被活化的過渡形式，一般用S*表示，由于其能障小，和酶結(jié)合就緊密得多。第57頁/共92頁4）過渡態(tài)的類似物作為競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑第58頁/共92頁4）過渡態(tài)的類似物作為競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑第59頁/共92頁2.反競(jìng)爭(zhēng)性抑制第60頁/共92頁2.反競(jìng)爭(zhēng)性抑制舉例2．舉例：?jiǎn)蔚孜锩福喝绶枷慊蛩峄碾陆馇杌镆种品枷懔蛩狨ッ傅淖饔枚嗟孜铮喝珉p底物乒乓機(jī)制中，任何一個(gè)底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑也是另一底物的反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。第61頁/共92頁3.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ki=Ki’第62頁/共92頁2.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制舉例第63頁/共92頁4．混合型抑制第64頁/共92頁5．其他可逆抑制部分抑制底物抑制產(chǎn)物抑制第65頁/共92頁1）部分抑制1．部分抑制：假如混合型抑制中ESI復(fù)合物也能釋放產(chǎn)物即為部分抑制。第66頁/共92頁2）底物抑制第67頁/共92頁3）產(chǎn)物抑制3．產(chǎn)物抑制：產(chǎn)物對(duì)酶反應(yīng)的抑制作用在生物體中較為常見，在細(xì)胞內(nèi)，酶反應(yīng)的產(chǎn)物雖然不斷被另外的酶作用，但S和P總是同時(shí)存在的，因此，考慮產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)速度的影響，可能具有一定的意義。第68頁/共92頁競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用反競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制混合型抑制其他可逆抑制1．競(jìng)爭(zhēng)性抑制的含義2．競(jìng)爭(zhēng)性抑制的機(jī)理3．競(jìng)爭(zhēng)性抑制舉例4．過渡態(tài)的類似物作為競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑1．概念2．舉例1．部分抑制2．底物抑制3．產(chǎn)物抑制第69頁/共92頁五、不可逆抑制作用不可逆作用可分為非專一性專一性第70頁/共92頁1.非專一性的不可逆抑制作用概念：抑制劑能和酶上的一類或幾類基團(tuán)反應(yīng)。類型：：酰化劑、烴基化劑、含活潑雙鍵的試劑、親電試劑、氧化劑、還原劑第71頁/共92頁2.專一性不可逆抑制劑專一性不可逆抑制劑的類型:Ks型結(jié)合型不可逆抑制劑Kcat型催化型不可逆抑制劑（自殺底物）第72頁/共92頁1）Ks型結(jié)合型專一性不可逆抑制劑抑制劑只能專一地與某種酶結(jié)合而引起的不可逆抑制作用舉例：1對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶

2對(duì)甲苯磺酰-L-賴氨酰氯甲酮抑制胰蛋白酶

第73頁/共92頁2）Kcat型催化型不可逆抑制劑（自殺底物）抑制劑能專一地與某種酶結(jié)合并發(fā)生催化反應(yīng)，而反應(yīng)的產(chǎn)物中含有一個(gè)基團(tuán)可以與酶分子活性中心的基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致酶分子不可逆地喪失催化活性。第74頁/共92頁Kcat型不可逆抑制劑（自殺底物）（1）天然酶的自殺底物（2）治療用人工合成的酶自殺底物第75頁/共92頁（1）天然酶的自殺底物

Ackee(Blighiasapida)植物——未成熟果實(shí)的假種皮中含有一種有毒的降糖氨酸（即甲叉環(huán)丙基丙氨酸）第76頁/共92頁（2）治療用人工合成的酶自殺底物治療高血壓；癲癇；抗青霉素的菌株；在腫瘤治療上；治療震顛麻痹癥；痛風(fēng)癥的自殺底物療法。第77頁/共92頁非專一性的不可逆抑制作用專一性不可逆抑制劑的類型酰化劑烴基化劑含活潑雙鍵的試劑親電試劑氧化劑還原劑Ks型專一性不可逆抑制劑Kcat型不可逆抑制劑（自殺底物）第78頁/共92頁六、酶抑制劑的應(yīng)用醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用第79頁/共92頁1、醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

青霉素類藥物長(zhǎng)期使用青霉素，細(xì)菌中產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，可水解青霉素中的內(nèi)酰胺環(huán)，使之成為不殺菌的青霉酸酰。（不能形成D-丙氨酸-D-丙氨酸結(jié)構(gòu)，喪失了殺菌能力）第80頁/共92頁1．青霉素類藥物第81頁/共92頁1．青霉素類藥物兩者結(jié)構(gòu)類似，故可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制轉(zhuǎn)肽酶，導(dǎo)致胞壁合成障礙。第82頁/共92頁傳統(tǒng)化學(xué)法生產(chǎn)β－內(nèi)酰胺抗生素路線

圖1.1傳統(tǒng)化學(xué)法生產(chǎn)β－內(nèi)酰胺抗生素路線Figure1.1.Anoverviewofthetraditional,chemicalsynthesisofβ-lactamantibiotics第83頁/共92頁

酶法生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素路線圖圖1.2酶法生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素路線圖Figure1.2.Thenetworkofenzymaticmodificationofβ-lactamantibioticsPGAforpenecillinGacylase;6-APAfor6-aminopenicillinicacid;7-ADCAfor7-aminodeacetoxi-cephalospornicacid;7-ACAfor7-aminocephalospornicacid第84頁/共92頁青霉素G?；冈诖竽c桿菌中的合成與后加工圖1.3青霉素G?；冈诖竽c桿菌中的合成與后加工Fig.1.3SynthesisandmaturationofpenicillinGacylaseinE.coli.：ThepacgenefromE.coliencodesapolypeptideprecursor(preproPAC)whichiscomposedof,inthedirectionofN-terminustoC-terminus,asignalpeptide(S),αsubunit(α),connectingpeptide(C),andβsubunit(β).第85頁/共92頁青霉素?；傅娜S結(jié)構(gòu)圖圖1.4青霉素?；傅娜S結(jié)構(gòu)圖Figure1.4.Thethree-dimensionalstructureofpenicillinacylaseMOLSCRIPTrepresentationoftheheterodimer.TheAchainisshowninredwrappedaroudtheBchain(blue)。（Duggleby,H.J.Nature,1995,(373):264-268）.第86頁/共92頁青霉素?；傅慕Y(jié)構(gòu)不同來源的青霉素酰化酶都有α，β兩個(gè)亞基組成，α亞基的分子量在24k左右，β亞基的分子量在65k左右。E.coli來源的PGA結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)2538個(gè)核苷酸，編碼846個(gè)氨基酸組成的前體蛋白，包括26個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，209個(gè)氨基酸組成的α亞基，54個(gè)氨基酸組成的連接肽和557個(gè)氨基酸組成的β亞基。第87頁/共92頁青霉素?；傅拇呋钚灾行牟捎枚嗟孜锔?jìng)爭(zhēng)性抑制用X晶體衍射測(cè)定了復(fù)合物（青霉素?；负偷孜锉揭宜幔?，4二羥基苯乙酸，2，5二羥基苯乙酸，p－硝基苯乙酸)的三維結(jié)構(gòu)，這些復(fù)合物揭示了底物結(jié)合區(qū)域構(gòu)象的變化可能作為酶自催化的開關(guān)。顯示了催化中心中的AsnB241的作用。PGA活性高度依賴于AsnB241，在催化中心里，B241Asn導(dǎo)致形成陽離子的洞，包括底物與SerB1。ArgA263參與了與底物的結(jié)合并協(xié)助AsnB241的定位。Phe146是底物進(jìn)入活性中心的開關(guān)，所以準(zhǔn)確地說，青霉素?；傅拇呋钚灾行氖荢er-Asn二聯(lián)體。第88頁/共92頁青霉素酰化酶催化機(jī)制

圖1.6青