病毒蝕斑技術1952年Dulbecco噬體斑術應用于物毒，而病蝕技術plaque成許多毒滴和究法。(一理

病毒染胞，于體質限，釋的毒能最感的細胞周擴。過個殖期便形一局性變胞，即毒斑。理上，個斑由初染細的個毒粒成，而項術常于毒粒數分病克。但實操中?，F個毒粒時感一細的況影滴的確性克的一，此接的毒要充分和釋對細結性毒，MDV，需單細；細釋性病毒即用相質浮細，可用層胞但者用脂固介蓋在胞，防放病在體質中動固介的度病的小定，病用度低介，病用濃較的質以將斑生速控制適的圍。蝕需顯鏡觀，1-10mm的蝕可肉計。為便肉觀，用性等料色。病細不收性，變胞便呈無蝕。毒液滴以毫升斑成位(PFU/ml)來示例如，3個細瓶平蝕是58接種為0.2ml，病的稀度則毒液的度：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105(PFU/ml)(二術用

蝕斑術以用分病的隆(無性繁殖純系)、病毒或清的滴，可蝕形和小究毒的物特。病毒物純biological

在進血中試時常會現標病株滴下，而響試驗準性,這情多于煤毒?？赡苡稍镜碾s,或者已有許變病粒存其甚至出現量多的陷毒致這有必要把手上握標毒進純,應用病毒斑術挑出個同純病,亦“隆”。克隆后病經敏細胞增測定滴選用合適毒用血中試。了更效進純,必在蓋營瓊之用養(yǎng)洗單細上未吸的毒同要制稀的度一培瓶的斑目好不超過10個，取其近10mm是康胞的蝕。取的毒傳代兩以上一認，性染會于“光敏”作用抑病蝕的成破宿細胞因，了性覆層培物在暗培。蝕斑少和驗(PlaqueReductionNeutralizationTest)

蝕斑少和驗檢測清和體一敏性高方法試以蝕數少50％血稀度作其的價試驗使用定的毒(100PFU)與不同稀釋的量清合

后感,接種先備的層胞,再覆蓋上營養(yǎng)脂37℃二氧化碳培箱養(yǎng)數后別計斑,用Karber法計算該清蝕中效。操作理傳統血中試大相。由于試的作較鎖目前國極應用,國上沒把作一種國都接的斷法僅OIE國際動物衛(wèi)生典(第六版)中為裂熱規(guī)定斷方之。(三作例赤羽病(AKV)的滴或化于55mm直的菌料養(yǎng)中養(yǎng)猴細，形單。胞培養(yǎng)間3－4天，接種量約為2000000/ml個胞選單細胞部蓋不留空的養(yǎng)用試。用細胞培養(yǎng)液AKV病毒10倍倍稀至10-7并存4。每個稀釋度的毒接3個平皿接種前棄去細培液用5mlPBS或細培液洗層胞,然后去洗液。每個平皿分別入0.2ml病毒稀釋液對組用胞養(yǎng)代，37℃二氧化培箱附小，15分鐘動次以使毒勻布。按第4步沖未吸的病毒。取2倍濃的胞養(yǎng)液入量1.5％瓊(預熱)中，個平皿加7ml置平待卻固于37二化碳培養(yǎng)培約2天平需置(取2倍縮細培液加等的2％脂(預熱中每平加5ml，置平臺待卻固于37℃二氧碳養(yǎng)中養(yǎng)至次日結果計算

求每三培皿蝕平數組蝕斑的異符稀度的規(guī)(即10-2組平均100個斑則10-3平應個右)，否則考慮重試。平蝕數以毒釋的數乘5，為毫升病毒液蝕斑。

(10)選取征的干斑分以頭管瓊脂層下取斑收病，后分接到先備單細培瓶中行殖傳。(11)本試采BHK21細胞可用牛行病毒(BEFV)。藍舌病血清型鑒試(紙片法抗體紙片制備①取已各血型毒以1×107蝕斑形單接綿接種周血離血清②制備徑0.5mm的性紙，121℃15分種滅菌后存干環(huán)。③取上濾片入不血型免血后空干,保存于4℃冰箱備用，用前滅水潤病毒接種①用直6cm的料養(yǎng)培BHK21或Vero細成層。②以103PFU/0.2ml被藍舌病接于胞,吸附1h。③洗去被附病毒棄洗。覆蓋瓊脂①取2倍縮細胞養(yǎng)加等的1.5％瓊，每平加7ml，置平臺卻凝。②在瓊面按花形案上同的清紙做記。③把平放在37℃二氧化培箱養(yǎng)2天④真空出皿的濾片⑤取2倍縮細胞養(yǎng)加等的2%瓊脂每平加5ml重置37℃

二氧碳養(yǎng)培2-3天,待明顯斑制環(huán)現結果判定

出現顯制斑成(即紙位置仍持細被色)的疫血即該檢毒血型注驗方法同可用于鹿流性血病與舌病(BTV)的鑒別。新城病毒(NDV)離取疑似患病禽組用胞培液漿,心淀取清液用16孔微量培板備成維代胞細胞長成單層吸培液，每滴被病料37℃吸附2小后棄液制備1％脂BME，置40－50℃水待。吸取上述瓊脂入養(yǎng)各孔每，冷凝固成覆層把培養(yǎng)板倒置在37℃二氧碳養(yǎng)培48h。制備含％性的1%瓊脂BME，40－50℃水浴待。(吸上述脂入養(yǎng)各，孔0.5ml，冷凝固成第覆層把培養(yǎng)板倒置在37℃二氧碳養(yǎng)繼培，48小內察果(10)挑出斑的胞病的一增和定。注：試方在品病含少情況比純細培分要感試驗各成的制細胞營養(yǎng)液用稀病)10倍199保存液4ml牛血0.8ml

3%碳酸氫鈉2.4ml雙蒸32.8ml40ml兩倍濃縮細胞養(yǎng)(配首瓊脂用)10倍199保存液20ml牛血4ml3％碳酸氫12ml1％二乙氨乙10ml(可選)雙蒸54ml100ml(置40－45℃水浴用)％脂精制脂1.5g雙蒸加至100ml(0.112MPa高滅15分鐘置40－45℃水浴備用。含中性紅兩倍縮胞養(yǎng)液(配制第二瓊用)10倍199保存液20ml牛血10ml3％碳酸氫12ml0.5％性6ml雙蒸52ml100ml(置40－45℃水浴用)說明在二瓊中中紅最濃度為1:5000－。2％瓊精制脂2g雙蒸加至100ml(0.112MPa高滅15分鐘置40－45℃水浴備用。（6）晶溶配：

Crystalstain:stock=1g.crystalviolet99ml20%EtOHworkingsoluion=mlstock40ml95%EtOH150water---------------------------------------------------------------------------Crystalviolet-Formaldehydestain:100ml10mlformalin90mldH2O0.4gNaH2PO4(monobasic)0.65gNa2HPO4(dibasic)0.1gcrystalviolet計數Pfu/ml(oforiginalstock)=1/dilutionfactorxnumberofplaquesx1/(mlofinoculum/plate)----------------------------------EV71Plaqueassay.RDcells(1105)in200μlRPMI1640wereseededineachwell24Serialdilutionsofthedifferentviralsuspensionswereaddedtothewellsfor18hofAfterfor1hat37°C,thevirussupernatantreplacedwithDMEMcontaining2%FBSand0.8%methylcelluloseforh.Aftertheoftheanda15-minfixationstep4%formalinPBS,theplaqueswerereadbybeingstainedwith1%crystalCountswereexpressedasPFUperm