分子生物學分子生物學的常規(guī)技術(shù)六第1頁/共129頁基因文庫：

也稱DNA文庫，是指某一生物體全部或部分基因的集合。某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫(genelibrary)。第2頁/共129頁基因文庫（Genelibrary）：

由大量的含有基因組DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體，稱之為基因文庫。一個完全的基因文庫，應(yīng)該能夠保證從中篩選到目的基因。即Genomiclibrary第3頁/共129頁基因文庫:

外源DNA片段載體宿主等3個部分組成。第4頁/共129頁

構(gòu)建基因文庫的基本程序：

①提取研究對象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；②DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA；③重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞或體外包裝后侵染受體菌；④陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。第5頁/共129頁

基因文庫(外源DNA片段的來源)分為：

基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)第6頁/共129頁基因組DNA文庫:

是指將某生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細胞獲得的所有陽性菌落。將龐大的基因組分解成許多片段，每段包含一個或幾個基因。第7頁/共129頁cDNA文庫:

cDNA文庫代表生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平上的基因群體。由于基因表達具有組織和發(fā)育時期特異性，因此cDNA文庫所代表的基因組具有同樣的時空特性，它僅包含所選材料在特定時期里表達的基因，并不包括該生物的全部基因，且這些基因在表達豐度上存在很大差異。第8頁/共129頁

基因組文庫與cDNA文庫最大的區(qū)別：

cDNA文庫有時空特異性。

cDNA文庫反映了特定組織(或器官)在某種特定環(huán)境條件下基因的表達譜，因此對研究基因的表達、調(diào)控及基因間互作是非常有用的。不包含基因間隔序列、內(nèi)含子及基因的調(diào)控區(qū)．基因組文庫包含了基因的全部信息，如編碼區(qū)及非編碼區(qū)．內(nèi)含子和外顯子、啟動子及其所包含的調(diào)控序列等．第9頁/共129頁常用的文庫篩選方法有：核酸探針雜交法抗體免疫法差異雜交法。

第10頁/共129頁

必須根據(jù)所研究基因的各種信息，如表達豐度、蛋白質(zhì)特性和DNA序列等，以及基因文庫的特點和類型選擇適當?shù)暮Y選方法。第11頁/共129頁一、載體的選擇第一節(jié)基因組DNA文庫的構(gòu)建可裝載的外源DNAPlasmid<10kbPhage0-23kbCosmid45kbBAC100kbYAC300kb-1.2MbPl噬菌體載體

P1人工染色體載體(PAC)。

第12頁/共129頁

粘?？寺∷璧目寺∽訑?shù)是phage的一半，如需700000時，cosmid需350000個因cosmid在構(gòu)建文庫和貯存文庫比phage困難得多，如無特殊需要(如單個phage不能包容靶基因片段或要分離一系列跨過染色體DNA特大區(qū)段的重疊克隆時)一般不采用cosmid。第13頁/共129頁

YAC可用于克隆500kb以上，甚至幾Mb的DNA片段

BAC可減少DNA分子間的重組第14頁/共129頁

二、基因組DNA文庫的類型

1．質(zhì)粒文庫

質(zhì)粒是最早用于構(gòu)建基因組文庫的載體，現(xiàn)已發(fā)展了數(shù)十種適用于基因克隆、表達和測序等不同目的的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體所容納的外源DNA片段一般在10kb以內(nèi)。這類基因組DNA文庫一般應(yīng)用于“鳥槍法”全基因組測序研究利用于構(gòu)建亞克隆文庫或亞基因組文庫。第15頁/共129頁

2．噬菌體文庫

噬菌體文庫是以細菌噬菌體基因組衍生的一系列載體系統(tǒng)構(gòu)建的；常用的有λ噬菌體載體，M13單鏈噬菌體載體，P1噬菌體載體及由噬菌體衍生的質(zhì)粒載體(phagemid或phasmid)。

M13載體所容納的外源片段較小，一般用于構(gòu)建cDNA文庫或BAC和PAC亞克隆文庫。噬菌體文庫中應(yīng)用最廣的是λ噬菌體。由于其有利于利用分子雜交的方法進行篩選，用λ噬菌體構(gòu)建的基因組DNA文庫在小基因組物種的基因克隆中起著重要的作用．第16頁/共129頁phagevectors早期（70年代后期）使用，如Charon4A和gt-WES，克隆15～20kb目前用EMBL系列,2001，DASH，Charon38-40，GEM-11等置換型載體，插入片段的最大值可達20-24kb第17頁/共129頁3.黏粒文庫

黏粒又稱柯斯質(zhì)粒，是由λ噬菌體的cos序列、質(zhì)粒的復(fù)制序列和抗生素抗性基因構(gòu)建而成的一類特殊的質(zhì)粒載體。黏粒載體主要用于構(gòu)建小基因組物種的基因組DNA文庫。有時也用于構(gòu)建大基因組物種的基因組DNA文庫，利用它們的某一區(qū)段，如基因組DNA某一特定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段。第18頁/共129頁4.人工染色體文庫包括酵母人工染色體文庫、細菌人工染色體文庫和P1人工染色體文庫。又稱大片段基因組DNA文庫，容納外源DNA片段為100kb-1Mb.

用于大基因組物種基因克隆、物理圖譜構(gòu)建和基因組測序。第19頁/共129頁5.亞基因組文庫

——文庫對象是基因組的某一區(qū)段。

1）通過Southern雜交可以判斷出攜帶目的基因的DNA片段大小，此時可以利用內(nèi)切酶對基因組DNA進行消化并回收這一大小的DNA片段來構(gòu)建文庫進行基因的篩選；

2）利用原位雜交等技術(shù)將基因定位于某一條染色體，然后通過顯微切割的方法分離單條染色體來構(gòu)建亞基因組文庫；

3）先將基因定位于一個YAC或BAC克隆，再構(gòu)建該克隆的亞基因組文庫．一般而言，亞基因組文庫主要應(yīng)用在基因組較小的物種基因克隆或大基因組物種的后期研究。第20頁/共129頁6基因組文庫的發(fā)展

90年代，一些高等真核生物基因組研究計劃啟動，建以大片段克隆重疊群為基礎(chǔ)的染色體物理圖譜．由于構(gòu)建果蠅、擬南芥以及人等的染色體物理圖譜的需要，先后發(fā)展了多種可容納大片段的克隆載體，如YAC、P1、BAC和PAC，它們可以容納70－1000kb的外源DNA片段．由于具有裝載的外源DNA片段大，操作方便、很少出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象等優(yōu)點，BAC利PAC是目前基因組研究中最為常用的兩種載體．在植物基因組研究中，往往需要構(gòu)建含目的基因的大片段DNA的亞克隆文庫，再從中分離出含目的基因的亞克隆并轉(zhuǎn)化植物，驗證目的基因的功能。為加快研究速度，省去構(gòu)建亞克隆文庫和篩選亞克隆的麻煩，現(xiàn)在已發(fā)展了一些可直接轉(zhuǎn)化植物的大片段文庫載體如BIBAC和TAC等，這些載體都包含轉(zhuǎn)基因所需的T-DNA序列．第21頁/共129頁三、文庫的代表性和隨機性代表性：

文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段可以覆蓋整個基因組，可以從該文庫中分離任何一段基因組DNA．代表性是衡量文庫質(zhì)量的一個重要指標。第22頁/共129頁提高文庫的代表性的策略：一是采用部分酶切或隨機切割的方法來打斷染色體DNA，以保證克隆的隨機性，保證每段基因組DNA在文庫中出現(xiàn)頻率均等；二是增加文庫的總?cè)萘?，提高覆蓋基因組的倍數(shù)。文庫總?cè)萘坑赏庠雌蔚钠骄L度和重組克隆的數(shù)量共同決定，外源片段的長度受所選用的載體體系限制．從經(jīng)濟的角度考慮，重組克隆的數(shù)量并不是越多越好，因此選用一個合適的重組克隆數(shù)量是很有必要的。第23頁/共129頁1976年ClarkandCarbon提出了一個完全的基因文庫所需克隆的計算公式

n=ln(1-p)/ln(1-f)

n:一個完全基因文庫所應(yīng)包含的重組體克隆數(shù)

p:所期望的目的基因在基因文庫中出現(xiàn)的幾率

f:插入片段的平均大小與基因組DNA大小的比值第24頁/共129頁哺乳動物3×109kb若p=99%平均克隆片段20kb

f=20kb/3×109

n=690773.2E.coli4639221bp

p=99%f=20kb/4600kb

n=1056.9

p=99%f=10kb/4600kb

n=2116第25頁/共129頁四、基因組DNA文庫的構(gòu)建流程基因組DNA文庫的構(gòu)建程序包含5個部分：

①載體的制備；②高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA（HMWDNA)的提??；③HMWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細胞⑤重組克隆的挑取和保存．第26頁/共129頁

1．基因組DNA文庫的載體制備制備的載體要求純度高、去磷酸化效果好。載體去磷酸化是為了提高連接效率，在同一個連接組分中，載體自身連接速度遠大于與外源片段的連接速度。如果載體去磷酸化不徹底，會出現(xiàn)大量不含外源片段的克隆，嚴重影響文庫的質(zhì)量。如果載體純度不高，含有大量細菌基因組DNA，則會出現(xiàn)大量的插入片段為細菌基因組DNA的假陽性菌落，也影響文庫的質(zhì)量．第27頁/共129頁BAC類載體：

拷貝數(shù)低，難于提取足量的質(zhì)粒；

近年來發(fā)展了多拷貝的BAC載體(如pCUGIBACl等)，它將pBeloBACll載體和常用的多拷貝載體pBluescript融合在一起，而構(gòu)建的文庫質(zhì)量沒有區(qū)別。

插入片段大，去磷酸化的要求也更嚴格。

以BAC載體pBeloBACll為例，要構(gòu)建一個高質(zhì)量的文庫，需要1mg左右的質(zhì)粒用于氯化銫梯度離心分離超螺旋狀態(tài)的組分，至少要從1～4L處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物提取質(zhì)粒才能滿足需要．第28頁/共129頁

2.高質(zhì)量大相對分子質(zhì)量基因組DNA的提取和部分酶切

構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對DNA相對分子質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA相對分子質(zhì)量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的3－5倍。提取的基因組DNA相對分子質(zhì)量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。第29頁/共129頁真核生物基因組DNA提取方法有：液相法固相法。第30頁/共129頁液相法：

如CTAB法，可以提取100kb左右的DNA，基本可以滿足構(gòu)建各種小插入片段基因組文庫的要求。固相:

大相對分子質(zhì)量(HMW)基因組DNA提取方法很復(fù)雜，一般采用的是在固相環(huán)境下對游離的單個細胞進行操作，避免了移液和搖動等造成的剪切力，保護了DNA的完整。大相對分子質(zhì)量DNA提取方法，利用了低熔點瓊脂糖包埋固定的方法。將細胞固定在低熔點瓊脂糖凝膠中，并浸泡在含有EDTA的緩沖液中。在這種包埋狀態(tài)下對細胞進行破壁、去除蛋白和雜質(zhì)、清洗，之后進行酶切反應(yīng)。第31頁/共129頁大分子DNA提取有2個主要步驟：第一是將提供的材料制備成單個細胞的懸浮液第二是將DNA包埋并且純化出HMWDNA。

除于DNA被固定之外，包埋在低熔點瓊脂糖中的HMWDNA的部分酶切反應(yīng)和普通的部分酶切沒有什么不同。酶切后的DNA要經(jīng)過分級分離，大片段基因組DNA文庫主要是通過PFGE法回收對應(yīng)大小區(qū)段的DNA，小片段基因組DNA文庫則常用蔗糖密度梯度離心法回收酶切的DNA。第32頁/共129頁第33頁/共129頁

3.外源DNA的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染

連接反應(yīng)是將部分酶切后回收的DNA同載體在T4DNA連接酶的作用下連接在一起的過程。在連接體系中同時存在著至少4種連接方式：載體自連載體和基因組DNA片段之間的連接基因組DNA片段的自連基因組DNA片段之間的連接。第34頁/共129頁提高連接效率是關(guān)鍵：

在連接酶、載體和外源基因組DNA已經(jīng)確定，可通過調(diào)整載體與基因組DNA的比例來達到較好的效果．

在構(gòu)建大片段基因組DNA文庫時，大量連接前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例。在轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細胞和最佳的轉(zhuǎn)化條件或效價高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白。第35頁/共129頁

4．文庫的質(zhì)量檢測

文庫質(zhì)量是由文庫所含克隆的數(shù)目、平均插入片段的長度、插入效率、基因組覆蓋度和覆蓋倍數(shù)等因素決定的?？寺?shù)越多，平均插入片段越長，插入效率和基因組覆蓋度越高，文庫質(zhì)量就越好。在實際應(yīng)用中，克隆數(shù)目可以通過多次轉(zhuǎn)化累加。但并不是越多越好，只要達到一定的基因組覆蓋倍數(shù)和覆蓋度就行，一般要求達到4～6倍覆蓋率．第36頁/共129頁

在文庫的質(zhì)量檢測中，除了克隆子數(shù)目是可以確定的，其他值都是估算的．文庫的平均插入片段長度是通過PFGE電泳檢測一定數(shù)目的重組子的插入片段大小所得平均值。對于大片段文庫而言，平均插入片段大小是衡量文庫質(zhì)量的一個重要依據(jù)。對BAC文庫，一般要求植物的片段在130kb左右，而動物的片段在150kb左右。插入效率表示有插入片段的克隆在所檢測的克隆中所占的比例，也是通過此法檢測的。第37頁/共129頁基因組覆蓋倍數(shù)的估算方法有2種：一種是用公式計算：基因組覆蓋倍數(shù)＝平均插入片段長度×克隆數(shù)／基因組DNA的長度(一般是約數(shù))；另一種是結(jié)合基因組覆蓋度的檢測來估算。第38頁/共129頁基因組覆蓋度：

是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍；選擇一定數(shù)目的單拷貝基因作探針來篩選文庫，如果所有探針都可從文庫中檢測到陽性克隆，則說明該文庫覆蓋度很高。每個探針篩選的克隆數(shù)目即為該基因位點的覆蓋倍數(shù)，因此，基因組覆蓋倍數(shù)等于所有探針篩到的陽性克隆的總個數(shù)除以使用的總探針數(shù)。

第39頁/共129頁第二節(jié)cDNA文庫的構(gòu)建

一、cDNA文庫的特征和發(fā)展

將來自真核生物的mRNA體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌的過程，稱為cDNA文庫的構(gòu)建。真核生物基因組大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有大量的非編碼區(qū)、基因間間隔序列和重復(fù)序列等，直接利用基因組文庫有時很難分離到目的基因片段。即使分離到DNA片段，也必須同其cDNA序列進行比較，從而確定該基因的編碼區(qū)、非編碼區(qū)、翻譯產(chǎn)物和調(diào)控序列。第40頁/共129頁

mRNA是基因轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，不含有內(nèi)含子和其他調(diào)控序列，結(jié)構(gòu)相對簡單，且只在特定的組織器官、發(fā)育時期表達．因此，在某些情況下從cDNA文庫分離基因比從基因組文庫中分離基因更具優(yōu)勢．

mRNA決定了功能蛋白的初始肽鏈的翻譯，可以用來研究蛋白質(zhì)的功能．自20世紀70年代中期首次合成cDNA以來，運用cDNA文庫進行基因克隆和基因功能研究發(fā)展很快，cDNA文庫巳成為分子生物學研究的一種基本工具。第41頁/共129頁

基因的表達具有時空性和表達量上的差異：時空性取決于cDNA文庫的取材。

構(gòu)建cDNA文庫時最好選取目的基因表達最高的發(fā)育時期或這一時期的特殊組織。表達量的差異決定了構(gòu)建的cDNA文庫要具有合適的容量。

在一定時期的單個細胞中，約有500,000個mRNA分子，可能代表了l-2萬個基因。第42頁/共129頁1.mRNA的完整性

指導合成高分子量蛋白質(zhì)的能力無細胞翻譯體系（源于網(wǎng)織紅細胞）哺乳動物總mRNA可編碼10～100kDa蛋白指導合成目的多肽的能力利用免疫沉淀和SDSmRNA的大小

500bp～8kb大部分1.5～2kb第43頁/共129頁2.mRNA分成3類：高豐度中等豐度低豐度mRNA.

第44頁/共129頁高豐度的mRNA:

約有幾十種，每個細胞中可能含有5000個拷貝;中等豐度的mRNA分子:

可能含有1000～2000種，每個細胞含有約200-300個拷貝；低豐度的mRNA:

種類最多，但每個細胞僅含有1～15個拷貝左右。第45頁/共129頁3．mRNA的富集按大小對mRNA進行分級分離

分離不同大小的mRNA（先變性，如氫氧化甲基汞，后梯度離心，蔗糖）體外翻譯，檢測每份中的比活

cDNA的分級分離

近年來多采用此方法，特別是大mRNA，可避免降解mRNA,agarose分離大小易辯第46頁/共129頁

多聚核糖體的免疫學純化法

用抗體來純化合成的目的多肽的多聚核糖體·

免疫親和柱/A蛋白-Sepharose柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈的多聚核糖體結(jié)合到A蛋白-spharose柱上，隨后用EDTA解離下來，通過oligo(dT)層析分離mRNA。·

此法分離的mRNA只占總mRNA的0.01-0.05%·

并非都可用，根據(jù)材料、來源、特異性來選擇第47頁/共129頁

根據(jù)計算公式，如果要從文庫中篩到每個細胞只含1個mRNA分子的基因(期望值p＝0.99)，cDNA文庫應(yīng)包含5,000,000－10,000,000個重組子，而對于高豐度或中等豐度基因,文庫包含105個克隆子。早期的cDNA文庫多以噬菌體為克隆載體，主要用于篩選單個目的基因。第48頁/共129頁

cDNA文庫可獲得表達序列標簽(expressedsequencetag，EST)，研究特定器官、組織或發(fā)育時期基因的表達譜．發(fā)現(xiàn)新基因。如果能降低高豐度和中等豐度基因在文庫中的冗余度，同時提高低豐度基因在文庫中的代表性，就可大大降低高豐度和中等豐度基因在EST中的重復(fù)次數(shù)，提高發(fā)現(xiàn)新基因的效率，大大降低cDNA測序的成本．為達到這個目的，近年來發(fā)展了均一化cDNA文庫、差減雜交cDNA文庫和選擇性分離全長cDNA等技術(shù)。第49頁/共129頁均一化cDNA文庫(normalizedcDNAlibrary):

是通過一定的策略和方法，將構(gòu)建好的獨立cDNA文庫進行一定的處理，降低高豐度和中等豐度基因在cDNA文庫中的比例，從而使高豐度、中等豐度和低豐度基因在文庫中出現(xiàn)的頻率相對一致．第50頁/共129頁

在經(jīng)過均一化處理的cDNA文庫中，前兩種類型mRNA分子對應(yīng)的cDNA克隆的比例之和僅為4.6％，相當于降低了13.5倍，低豐度基因在文庫中的比例高達95.4％，相當于提高了2.5倍．在EST測序和cDNA芯片的研究中，可以大幅度降低成本，相對提高一些極低豐度基因出現(xiàn)的頻率。隨著越來越多物種的全基因組測序的完成，需要借助全長cDNA序列進行基因預(yù)測和功能注釋，所以近年又開發(fā)了多種全長cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)。第51頁/共129頁二、cDNA文庫的構(gòu)建

cDNA文庫的構(gòu)建共分4步：

1.細胞總RNA的提取和mRNA分離;2.第一鏈cDNA合成;3.第二鏈cDNA合成;4.雙鏈cDNA克隆進質(zhì)粒或噬菌體載體并導入宿主中繁殖。第52頁/共129頁第53頁/共129頁1．RNA的分離

mRNA是構(gòu)建cDNA文庫的起始材料．總RNA中絕大多數(shù)是tRNA和rRNA，而mRNA只占總RNA的1％-5％，mRNA的含量取決于細胞類型和細胞的生理狀態(tài)。在單個哺乳動物細胞中，大約有360000個mRNA分子，約12000種不同的mRNA，有些mRNA分子占細胞mRNA的3％，而有些mRNA分子只占不到0.01％．這些“稀有”或“低豐度”mRNA分子多達11000種，在每個細胞中只有5-15個分子，占基因總數(shù)的45％．由于mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構(gòu)建cDNA文庫的一個重要步驟。通過降低rRNA和tRNA含量，可大大提高篩選到目的基因的可能性。第54頁/共129頁

真核生物mRNA的3’末端都含有一段poly(A)尾巴，純化mRNA的方法都是在固體支持物表面共價結(jié)合一段由脫氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸[oligo(dT)]鏈，oligo(dT)與mRNA的poly(A)尾巴雜交，將mRNA固定在固體支持物表面，進而可將mRNA從其他組分中分離出來的。由于oligo(dT)鏈和poly(A)都不長，雜交可形成的雜合雙鏈在高鹽離子濃度下可以保持，在低鹽離子濃度下或較高溫度下就會分開，利用這一性質(zhì)從RNA組分中分離純化出mRNA。第55頁/共129頁

2第一鏈cDNA的合成

由mRNA到cDNA的過程稱為反轉(zhuǎn)錄，由反轉(zhuǎn)錄酶催化．常用的反轉(zhuǎn)錄酶有2種:AMV(來自禽成髓細胞瘤病毒)

(42℃)

RNaseH

Mo-MLV(來白Moloey鼠自血病病毒)(37℃)

RNaseH弱長mRNA

二者都是依賴于RNA的DNA聚合酶．有5‘－3’DNA聚合酶活性。目前常用的反轉(zhuǎn)錄酶多是通過點突變?nèi)サ袅薘NaseH活性的Mo-MLV。第56頁/共129頁

反轉(zhuǎn)錄酶是依賴RNA的DNA聚合酶，合成DNA時需要引物引導。常用的引物主要有oligo(dT)引物和隨機引物。

oligo(dT)引物一般包含15-30個脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點的寡核苷酸片段隨機引物,一般是包含6-10個堿基的寡核苷酸短片段。

oligo(dT)引導的cDNA合成是在反應(yīng)體系中加入高濃度的oligo(dT)引物，oligo(dT)引物與mRNA5’末端的poly(A)配對，引導反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成第一鏈cDNA。這種cDNA合成的方法在cDNA文庫構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍。由于cDNA末端存在較長的poly(A)，對后續(xù)的cDNA測序產(chǎn)生一定影響．第57頁/共129頁

隨機引物引導的cDNA合成是采用6-10個隨機堿基的寡核苷酸短片段來錨定mRNA并作為反轉(zhuǎn)錄的起點．由于隨機引物可能在一條mRNA鏈上有多個結(jié)合位點而從多個位點同時發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長的mRNA分子的5’端序列。由于隨機引物法難以合成完整的cDNA片段，因而不適合構(gòu)建cDNA文庫，一般用于RT-PCR和5’-RACE.第58頁/共129頁

3第二鏈cDNA的合成

cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補雙鏈cDNA的過程。第59頁/共129頁cDNA第二鏈合成的方法大致有4種:

自身引導合成法置換合成法引導合成法引物-銜接頭合成法．第60頁/共129頁(1)自身引導合成法

首先用氫氧比鈉消化雜合雙鏈中的mRNA鏈，解離的第一鏈cDNA的3’末端就會形成一個發(fā)夾環(huán)(發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈cDNA合成時的特性，據(jù)推測可能是與帽子的特殊結(jié)構(gòu)相關(guān))，并引導DNA聚合酶復(fù)制出第二鏈，此時形成的雙鏈之間是連接在一起的，再利用S1核酸酶將連接處(僅該位點處為單鏈結(jié)構(gòu))切斷形成平端結(jié)構(gòu)。這樣的處理要求很高純度的Sl核酸酶，否則容易導致雙鏈分子的降解從而喪失部分序列．

1982年前，自身引導合成法是cDNA合成中的常用方法，但由于S1核酸酶的操作很難控制，經(jīng)常導致cDNA的大量損失，現(xiàn)已經(jīng)不常使用．第61頁/共129頁第62頁/共129頁(2)置換合成法

置換合成法是由一組酶共同控制，包括RNaseH，大腸桿菌DNA聚合酶I和DNA連接酶。在mRNA-cDNA雜合雙鏈中，RNaseH在mRNA鏈切出很多切口．產(chǎn)生很多小片段，大腸桿菌DNA聚合酶I以這些小片段為引物合成第二鏈cDNA片段．這些cDNA片段進而在DNA連接酶的作用下連接成一條鏈，即cDNA的第二鏈。遺留在5’末端的一段很小的mRNA也被大腸桿菌DNA聚合酶I的5’－3‘外切核酸酶和RNaseH降解．暴露出與第一鏈cDNA對應(yīng)的3’端部分序列。大腸桿菌DNA聚合酶I的3’－5‘外切核酸酶的活性可將暴露出的第一鏈cDNA的3’端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。這種方法合成的cDNA在5‘端存在幾個核苷酸缺失，但一般不影響編碼區(qū)的完整．第63頁/共129頁

有效無須進一步純化不需用S1酶，否則會導致cDNA的大量損失問題：如何脫帽以便進入載體

5’端cDNA不能合成（少幾個Nt）有可能仍形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)第64頁/共129頁

(3)引導合成法制備一端帶有poly(dG)的片段II和帶有poly(dT)的載體片段I;

用片段I來代替oligo(dT)進行cDNA第一鏈的合成在第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈cDNA的3’端加上一段poly(dC)的尾巴用限制性內(nèi)切酶創(chuàng)造出一個黏性末端，與片段II一起形成環(huán)化體環(huán)化了的雜合雙鏈在RNaseH、大腸桿菌DNA聚合酶I和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA．第65頁/共129頁第66頁/共129頁主要特點：

合成全長cDNA的比例較高缺點：

操作比較復(fù)雜，形成的cDNA克隆中部帶有一段poly(dC)/(dA)，對重組子的復(fù)制和測序都不利．第67頁/共129頁(4)引物-銜接頭合成法由引導合成法改進而來的。第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈cDNA的3’端加上一段poly(dC)的尾巴，

dC后用一段帶接頭序列的poly(dG)短核苷酸鏈作引物合成互補的cDNA鏈，按頭序列可以是適用于PCR擴增的特異序列或方便克隆的酶切位點序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成PCR法構(gòu)建cDNA文庫的常用方法。第68頁/共129頁

4．雙鏈cDNA連接到質(zhì)?；蚴删w載體并導入大腸桿菌中繁殖

由于平端連接的效率低，雙鏈cDNA在和載體連接之前，要經(jīng)過同聚物加尾、加接頭等一系列處理，其中添加帶有限制性酶切位點接頭是最常用的方法。第69頁/共129頁添加帶有限制性酶切位點接頭有兩種方式:1)是添加單酶切位點接頭在第一鏈cDNA合成時不引入接頭，而直接在第二鏈上通過平端連接導入接頭。當導入的黏端接頭已經(jīng)去磷酸化，則可以在分級分離后直接用于連接．當導入的黏端接頭帶有活性磷酸基團時，要求接頭帶有對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶，且加接頭之前須對雙鏈cDNA進行甲基化修飾以免被限制酶切割，加接頭后再用接頭帶有對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化雙鏈cDNA，創(chuàng)造黏端用于連接。第70頁/共129頁2)是在cDNA的5‘和3’末端分別引入不同的限制性內(nèi)切酶位點在第一鏈合成時在cDNA的5‘端引入一稀有酶切位點(如NotI)，在雙鏈cDNA平端連接去磷酸化的黏端接頭(如SalI)，然后用NotI酶切創(chuàng)造出另一端的黏端，這樣可以與對應(yīng)雙酶切載體連接．雙酶切法連接的cDNA插入方向是固定的。第71頁/共129頁

雙鏈cDNA在連接之前最好經(jīng)過cDNA分級分離，回收大于500bp的cDNA用于連接。在未處理的雙鏈cDNA中，有很多小于500bp的分子，包括引物、接頭以及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種不完整的cDNA產(chǎn)物，這些組分都會影響cDNA文庫的質(zhì)量，如造成很多假陽性的重組子，重組子的插入片段太小。分級分離最簡單的、應(yīng)用最廣的是層析柱法，它可以方便快速地去除組分中小于500bp的分子，提高文庫的質(zhì)量．第72頁/共129頁

cDNA文庫的載體選擇

因為一般cDNA的長度范圍多在0.5-8kb之間，常用的質(zhì)粒載體或噬菌體類載體都能滿足要求。一般而言，噬菌體cDNA文庫比質(zhì)粒文庫篩選方便，如單個培養(yǎng)皿內(nèi)可以鋪展更多的重組子，復(fù)制用于雜交的膜方便快捷，雜交背量低等。但質(zhì)粒文庫在后續(xù)操作上更加方便且用途更廣。第73頁/共129頁三、cDNA文庫均一化處理

構(gòu)建均一化cDNA文庫上要看兩條途徑：

1)基因組DNA飽和雜交法

2)基于復(fù)性動力學原理的均一化。第74頁/共129頁

1．基因組DNA飽和雜交法

盡管細胞內(nèi)mRNA的豐度差異很大，但是編碼這些mRNA的基因在基因組中對應(yīng)的拷貝數(shù)卻不存在差異或差異很小(極少數(shù)在基因組中存在很高拷貝的基因除外)。利用不同表達水平的基因?qū)?yīng)的基因組拷貝數(shù)相對一致的特點，可以對cDNA文庫進行均一化。第75頁/共129頁該方法包含3個部分：

將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化固定，消化后的基因組DNA變性為相對較短的單鏈且最大可能地覆蓋基因組分離純化獨立cDNA文庫的混合質(zhì)粒；文庫DNA與固定的基因組DNA充分飽和雜交，固定住相應(yīng)的cDNA，并將它洗脫重新轉(zhuǎn)化受體菌．第76頁/共129頁

理論上，通過cDNA與基因組DNA的飽和雜交，基因組DNA上結(jié)合的cDNA克隆的數(shù)目是一致的．重新轉(zhuǎn)化后，它們在文庫中出現(xiàn)的頻率基本相近。該法應(yīng)用起來非常簡單，且沒有儀器上的限制，具有很好的均一化效果。第77頁/共129頁該法也有不足:

一是由于基因組DNA相對復(fù)雜，很難獲得覆蓋基因組的單鏈DNA片段，導致文庫內(nèi)基因的丟失．

采用不同的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，構(gòu)建兩個獨立、互補的均一化文庫可以一定程度地彌補上述不足。二是在基因組DNA與文庫DNA雜交的過程中，文庫DNA自身雜交的速度會很快，導致基因丟失．

將cDNA文庫制備成單鏈后再與固定的基因組DNA雜交來克服這一不足．第78頁/共129頁2．基于復(fù)性動力學原理的均一化方法雙鏈DNA在加熱變性后再復(fù)性形成雙鏈DNA的速率遵循二次復(fù)性動力學原理。與組分中的單鏈DNA的濃度相關(guān)，濃度越小，復(fù)性所需的時間越長。

cDNA文庫中高豐度cDNA復(fù)性所需的時間較短，低豐度cDNA復(fù)性所需的時間較長。通過控制復(fù)性時間可使高豐度cDNA復(fù)性成雙鏈狀態(tài)，而低豐度cDNA仍保持單鏈狀態(tài)．利用羥基磷灰石柱很容易將單鏈和雙鏈cDNA分開。再用得到的單鏈cDNA轉(zhuǎn)化宿主細菌，即可得到均一化cDNA文庫。第79頁/共129頁主要優(yōu)點:

幾乎不會導致起始文庫中cDNA的丟失;

均一化的效果更為明顯.不利:

操作更為復(fù)雜受多參數(shù)控制，需要多次的嘗試與摸索方能成功。

目前，基于這兩種原理的均一化處理方法應(yīng)用非常廣泛，數(shù)據(jù)庫有越來越多的EST序列來自均一化文庫。第80頁/共129頁四、扣除雜交cDNA文庫

在某些情況下，目的基因在特定發(fā)育時期的器官或組織、在一定環(huán)境下特異表達。這些基因表達量很低，從普通的cDNA文庫或均一化文庫中篩選起來很難?？鄢s交文庫是在扣除雜交基礎(chǔ)上構(gòu)建的cDNA文庫。第81頁/共129頁扣除雜交技術(shù)(subtractivehybridization)：

是將含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為待測樣本(tester)

將基因表達譜相似或相近但不含目的基因的組織或器官的mRMA群體作為對照樣本(driver)

將tester和driver的cDNA進行多次雜交，去掉在二者之間都表達的基因，而保留二者之間差異表達的基因，使低豐度基因在文庫中的比例大大提高，篩選到差異表達基因的可能性也大大提高。第82頁/共129頁扣除cDNA文庫技術(shù)有以下2種：

1.抑制性扣除雜交

2．mRNA-cDNA雜交第83頁/共129頁

1.抑制性扣除雜交

(suppressionsubtractivehybridization，SSH)Diatchenko.L等于1996年提出了一種可以有效克服基因上調(diào)表達所造成不利后果的克隆基因的新方法——抑制性扣除雜交（SSH）。該方法運用了雜交二級動力學原理，即豐度高的單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA。從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達到基本一致。而所謂抑制PCR，則是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)先于鏈間退火，從而使非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增。其具體過程第一步與RAD相同，酶切后得到Tester與Driver樣本的平末端cDNA片段。第84頁/共129頁過程：首先，含目的基因的cDNA稱為“供體(tester)”，不含目的基因的cDNA稱為“驅(qū)動”(driver)，它們是由對應(yīng)的mRNA組分在體外獨立反轉(zhuǎn)錄而來同時利用識別4個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶RsaI將這些cDNA消化成平末端的小片段。將供體一分為二，分別加上2種不同的接頭(接頭1和接頭2)。在第一輪雜交中，用過量的驅(qū)動cDNA分別與帶2種不同接頭的供體cDNA雜交，在2個獨立的雜交體系中，供體與驅(qū)動cDNA就會形成4種類型的cDNA片段。第85頁/共129頁第86頁/共129頁

其中：

a代表供體中既沒有與供體雜交，又沒有與驅(qū)動雜交的cDNA分子，這些cDNA一般濃度很低，不能和與自己互補的鏈雜交：

b代表供體中自身雜交的cDNA分子；

c代表供體和驅(qū)動中共同表達的基因雜交形成的雙鏈cDNA分子，

d代表驅(qū)動中自身雜交和不能與自身或供體雜交的cDNA分子，如同供體的a和b。整個雜交(復(fù)性)過程遵循復(fù)性動力學原理，由于驅(qū)動濃度遠大于供體的量，供體中與驅(qū)動同源的cDNA理論上全部形成了類型c，而a中所聚集的主要是差異表達的基因。第87頁/共129頁

然后進行第二輪雜交：

將第一輪雜交的兩個體系混合，再加入過量的驅(qū)動cDNA，進行第二輪雜交。雜交的結(jié)果會進一步形成a、b、c和d，同時帶不同接頭的a會復(fù)性形成新類型e。將第二輪雜交的產(chǎn)物進行末端補平，再進行兩輪PCR擴增。在PCR擴增過程中，由于a和d沒有引物結(jié)合位點而不能被擴增，由于b的兩端帶有相同的接頭序列，大多數(shù)的b會形成鍋柄結(jié)構(gòu)而不能進行指數(shù)擴增；c只有1個引物結(jié)合位點，只能被線性擴增．只有e帶有2個不同的引物接頭，可以進行指數(shù)擴增．只有e是均一化的、差異表達的基因．接著用巢式引物進行第一輪PCR，降低PCR產(chǎn)物的背景．富集差異表達的基因。最后，將第二輪PCR產(chǎn)物用T/A克隆載體進行克隆．構(gòu)建扣除雜交cDNA文庫。第88頁/共129頁

第一次PCR是基于其抑制效應(yīng)，只有兩端分別是接頭1和接頭2的具差別表達的序列片段得以指數(shù)擴增。第二次PCR極大提高擴增的特異性，使得差異表達的目的基因片段得到大量富集，并可用于后續(xù)的篩選工作。第89頁/共129頁SSH優(yōu)勢主要表現(xiàn)在:

1)極大降低了假陽性率由于SSH方法采用兩次扣除雜交和兩次PCR,保證了該方法具有較高特異性。據(jù)有關(guān)報道證明SSH方法假陽性率可降至6%;

2)具高度靈敏性由于在反應(yīng)中將豐度不同的單鏈分子含量歸一化,保證了低豐度mRNA檢測成功;

3)SSH法在一次反應(yīng)中,可同時分離出上百個差異表達的基因,這一點遠勝于DDRT-PCR和RAD。

而其缺點與RAD類似。第90頁/共129頁

2．mRNA-cDNA雜交

mRNA-cDNA雜交方法的原理是用過量的驅(qū)動mRNA與供體的cDNA文庫質(zhì)粒反復(fù)多輪雜交，去除驅(qū)動和供體共同表達的基因，構(gòu)建均一化的、扣除雜交cDNA文庫。第91頁/共129頁第92頁/共129頁

先用多克隆位點順序相反的質(zhì)粒載體分別構(gòu)建供體和驅(qū)動的cDNA文庫然后提取供體cDNA文庫的混合單鏈質(zhì)粒，同時提取驅(qū)動cDNA文庫的質(zhì)粒利用生物素標記的引物和T7DNA聚合酶(或SP6DNA聚合酶)，以驅(qū)動cDNA文庫的混合質(zhì)粒為模板在體外轉(zhuǎn)錄出對應(yīng)的mRNA(末端生物素標記)．第93頁/共129頁

然后，將過量的驅(qū)動mRNA與供體cDNA的單鏈質(zhì)粒雜交，二者共同表達的基因通過雜交形成cDNA-mRNA雜合雙鏈，進而可以通過結(jié)合了生物素抗體的磁珠將雜合子去除，保留供體中特異表達的，沒有雜交的單鏈質(zhì)粒DNA。經(jīng)過如此多輪雜交，盡可能多地去除驅(qū)動和供體中共同表達的基因，富集供體中特異表達的cDNA。最后，將沒有雜交的單鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌即得到扣除雜交的cDNA文庫。第94頁/共129頁

抑制性扣除雜交系統(tǒng)主要依賴PCR反應(yīng)過程，不涉及到體外反轉(zhuǎn)錄和純化的過程，操作起來相對簡單，而且已經(jīng)有商品化的試劑盒。但該系統(tǒng)相對比較復(fù)雜，尤其雜交的過程非常靈敏，稍不注意就會導致構(gòu)建的差異文庫中出現(xiàn)大量的“假陽性”克隆，而后一種方法可以通過多次的雜交來克服這一缺點．另外，抑制性扣除雜交文庫中的cDNA是打斷了的片段，一般在200～800bp之間，而后一種方法獲得的cDNA相對比較完整．第95頁/共129頁五、全長cDNA文庫（重點）

全長cDNA在基因克隆和基因功能定性研究中有很重要的作用但用置換合成法、引導合成法以及引物-銜接頭法構(gòu)建的cDNA文庫中，全長cDNA克隆的比例比較低;

因此提高cDNA文庫中全長cDNA比例即構(gòu)建全長cDNA文庫（full-lengthcDNAlibrary)就顯得非常重要．第96頁/共129頁導致cDNA不完整的原因：

1.cDNA第二鏈合成過程中聚合酶的外切核酸酶活性。

2.mRNA的降解

mRNA很容易從5’端開始降解，涉及的因素有很多，包括起始的生物材料、抽提和純化過程中RNase的污染、機械斷裂等．

3.反轉(zhuǎn)錄酶的合成特性即便是去除了RNaseH活性的反轉(zhuǎn)錄酶在反轉(zhuǎn)錄全長的mRNA時，其合成的也是全長和非全長反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的混合物．這一方面與mRNA分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與反轉(zhuǎn)錄酶從轉(zhuǎn)錄復(fù)合體上脫落有關(guān)。第97頁/共129頁

要想構(gòu)建真正意義上的全長cDNA文庫，不僅要考慮如何確保第二鏈的完整合成，還要考慮如何避開反轉(zhuǎn)錄或mRNA本身的影響。從理論上分析，如果有一種方法能夠在合成cDNA之后對全長cDNA進行選擇，就可以大幅度提高全長cDNA克隆的比例。第98頁/共129頁

1．SMART全長cDNA文庫的構(gòu)建法

在第一鏈cDNA合成時，由于反轉(zhuǎn)錄酶帶有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，當其到達mRNA5‘端時會自動在第一鏈cDNA的3’末端加上幾個d(C)。加入帶有3個d(G)的特異性引物，該引物會與全長cDNA第一鏈互補結(jié)合，然后繼續(xù)以該引物為模板合成互補鏈。第99頁/共129頁

1)全長cDNA的比例得到大幅提高。

2)錯配造成假全長cDNA的可能性較大所以該法還不是理想的全長cDNA文庫構(gòu)建的方法．由于其已經(jīng)商品化，操作起來方便，目前應(yīng)用非常廣泛。第100頁/共129頁2.Cap-Trapper法構(gòu)建全長cDNA文庫生物素標記和甲基化標記。首先利用3’帶錨定堿基的oligo(dT)12引物引導合成第一鏈cDNA。合成第一鏈cDNA時用dm5CTP代替dCTP，使所有的胞嘧啶都被5-甲基-dCTP取代．以保護cDNA不被隨后的限制性內(nèi)切酶消化。其次在mRNA的5’和3’末端標記上生物素，并用RNaseI消化單鏈RNA。由于全長第一鏈cDNA與mRNA形成的雜合雙鏈分子中不存在單鏈mRNA，而不完整的第一鏈cDNA與mRNA形成的雜合雙鏈分子中mRNA的5’末端仍然處于單鏈狀態(tài)，可用RNaseI將單鏈部分的mRNA消化掉，從而也將標記的生物素切割掉．第101頁/共129頁

然后利用偶聯(lián)了生物素抗體的磁珠分離出生長的cDNA-mRNA雜合雙鏈，水解mRNA鏈后再利用加尾法在第一鏈cDNA末端加上oligo(dG)，并合成第二鏈cDNA。最后用合適的限制性內(nèi)切酶消化雙鏈cDNA，與載體連接，包裝后感染大腸桿菌即可以獲得全長的cDNA文庫。利用這種方法構(gòu)建的全長cDNA文庫中有88.1%-95%的克隆包含子ATG；第102頁/共129頁第103頁/共129頁

3.煙草酸焦磷酸酶法構(gòu)建全長cDNA文庫

煙草酸焦磷酸酶(TAP)能特異地識別真核生物mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu)并將其去除，暴露出切口5’端的磷酸基團，可以在該切口處連接一段特異的接頭來引導cDNA第二鏈的合成。在反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈前對mRNA進行去磷酸化處理，使不完整的mRNA分子中暴露的5’端磷酸被去掉；然后在反應(yīng)中加入TAP，特異性地去掉完整mRNA分子5’末端的帽子結(jié)構(gòu)，暴露出5’端磷酸基團。在T4RNA連接酶的作用下，可以在5’端連接上一段特異的RNA接頭．不完整的mRNA分子中由于缺少磷酸基團而不能連接上接頭，因此只有添加了接頭的全長mRNA分子才能在該接頭引導下合成第二鏈cDNA合成.第104頁/共129頁第105頁/共129頁

理論上講，用此方法合成的cDNA都是全長的cDNA。在cDNA第二鏈合成時，可以通過對應(yīng)RNA接頭的序列和oligo(T)中序列，設(shè)計引物作巢式PCR將完整cDNA擴增出來。第106頁/共129頁

六.其他cDNA文庫表達載體和全長cDNA文庫的結(jié)合產(chǎn)生了表達cDNA文庫，可以在蛋白質(zhì)水平對基因進行免疫學篩選。將表達文庫與酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)合使用，利用酵母作宿主的融合蛋白cDNA文庫已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學研究的重要工具。上述的文庫構(gòu)建策略都是基于連接酶將外源cDNA片段和載體連接在一起的，為提高連接效率，都存在著利用酶切來創(chuàng)造黏性末端的操作。雖然通常選擇稀有酶來避免切斷cDNA，但不可避免存在著切斷的可能性，而且通過連接獲得的cDNA對于下游的操作很不方便。為避免這些缺點，DNA重組技術(shù)被引入到cDNA文庫構(gòu)建策略中，即在合成的雙鏈cDNA片段兩個末端分別引進重組酶的識別序列attPl和attP2，用重組酶將cDNA片段定向重組至相應(yīng)的載體上，避免了消化和連接過程．第107頁/共129頁

這類文庫的一個顯著優(yōu)點是，可以方便地將cDNA片段在含有該識別位點的各類載體之間平行轉(zhuǎn)移，方便進行體外表達載體和RNAi等載體的構(gòu)建．另外，cDNA文庫雖然代表著表達的基因，但不代表基因組編碼的全部基因．有人在酵母上進行了新的嘗試，先將帶有強啟動子和一個外顯子(其中包含了剪切位點)的插入序列隨機插入酵母基因組，構(gòu)建酵母突變體庫。當插入序列插入到基因前或基因中間，就會轉(zhuǎn)錄攜帶有該外顯子的融合基因．從突變?nèi)后w中分離這種特殊的嵌合序列mRNA構(gòu)建文庫，該cDNA文庫中就代表著很多可能正常狀態(tài)下不表達的基因。理論上，由于插入序列是隨機的，當突變?nèi)后w足夠大時，獲得的表達序列就會覆蓋基因組的所有基因．第108頁/共129頁第三節(jié)基因克隆的篩選策略

一般來說，從基因文庫中篩選目的基因的難易程度主要取決于所采用的基因克隆方案和目的基因的性質(zhì)與來源。如果目的基因是原核生物的特殊功能基因(如抗性基因、殺蟲基因或者是啟動子/復(fù)制子等功能元件)時．就很容易通過這些基因的特殊功能來篩選．真核生物的基因篩選要復(fù)雜得多。已經(jīng)發(fā)展了一系列方便快捷、可靠性高的篩選方法，包括特異性探針的核酸雜交、特異性抗原的免疫學檢測和PCR篩選法等。第109頁/共129頁一、表型篩選法

表型篩選法就是在宿主菌表達目的基因，使宿主產(chǎn)生新的表型或使宿主恢復(fù)其突變基因的表型來篩選目的基因。表型篩選法對具有明顯形態(tài)學特征或比較容易檢測的生化性狀的基因篩選是非常有效的，比如營養(yǎng)缺陷型相關(guān)的基因和抗生素抗性基因．該方法要求宿主為不攜帶該目的基因或是該基因的缺失突變體。第110頁/共129頁

該法要求篩選的基因在宿主(一般是原核生物或酵母)中表達，而真核生物編碼的基因，尤其是基因組DNA編碼的基因很難在原核宿主中表達，因此表型篩選法主要用于原核生物的基因篩選。經(jīng)過長期的積累，原核生物(尤其是大腸桿菌)已經(jīng)擁有相當數(shù)量的表型突變體.

目前，在酵母中也已經(jīng)成功運用該法鑒定了一些未知功能的基因，如編碼擬南芥的脂肪酸延長酶l(FAE1)基因，其cDNA在酵母中表達可導致芥酸的合成．另外，表型篩選法還在一些基因功能元件(如啟動子、復(fù)制起點)。如將DNA片段與不含啟動子的報告基因連接構(gòu)建文庫，可以根據(jù)文庫中報告基因的表達來篩選相應(yīng)的啟動子元件。第111頁/共129頁二、雜交篩選和PCR篩選當目的基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表達的真核生物的基因時，可以利用核酸探針來篩選。探針的來源成為篩選的核心。探針可以根據(jù)該基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白質(zhì)產(chǎn)物(如通過測定其N-末端氨基酸序列設(shè)計簡并寡核苷酸引物)來設(shè)計，或利用遺傳定位的性質(zhì)通過與基因緊密連鎖的一些分子標記設(shè)計探針。雜交篩選法是應(yīng)用最為廣泛的篩選目的基因克隆的一種方法，常用的有菌落雜交和噬菌斑雜交，分子雜交的靈敏度很高，因此為減少假陽性出現(xiàn)的幾率．探針的特異性要非常高．第112頁/共129頁

用已知基因為大片段DNA文庫中篩選目的基因時，還可以采用更加簡單快捷的方法——混合池PCR篩選法。

首先，根據(jù)已知序列設(shè)計基因特異性引物，然后將文庫質(zhì)粒進行有序的混合。如果一個文庫貯藏在10個384孔培養(yǎng)板中，先將整個文庫以培養(yǎng)板為單位混合，構(gòu)成10個“主混合池”；再將這10個培養(yǎng)板分別控“行”和“列”混合，構(gòu)成16個“行混合池”和24個“列混合池”．以10個“主混合池”為模板進行的PCR反應(yīng)可以確定陽性克隆所在的培養(yǎng)板，以“行混合池·和“列混合池”為模扳進行的PCR可以確定陽性克隆在各個培養(yǎng)板上所在的行和列．這樣，通過50個PCR反應(yīng)，即可從3840個克隆中篩選出陽性克隆。在具體應(yīng)用中，一旦“主混合池”、“行混合池”和“列混合池”構(gòu)建好以后，PCR篩選將非常方便，每天可以做大量的PCR反應(yīng)，篩選大量的標記．第113頁/共129頁三、免疫篩選

如果能得到目的基因產(chǎn)物對應(yīng)的抗體，就可以通過免疫學方法來篩選。免疫篩選法使用的探針是特異性抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細胞中存在抗原蛋白的表達，用于篩選的DNA文庫必須是表達文庫，通常是原核生物的基因組DNA文庫和真核生物的cDNA表達文庫。而且，所檢測的對象為宿主中不編碼的基因或宿主中缺失表達的基因。第114頁/共129頁根據(jù)檢測方法的不同，免疫篩選法可以分為兩種方式:

原位檢測