分子生物學(xué)檢查第1頁(yè)/共42頁(yè)分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史1871年Miesscher首次從萊茵河鮭魚(yú)精子中分離到DNA1953年Watson和Ｃrick闡明DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1958年Meselson和Stahl提出DNA半保留復(fù)制模型1965年發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒1966年Nirenberg等破譯全部遺傳密碼1970年Smith分離到第一種核酸內(nèi)切限制酶1973年Boyer和Cohen建立DNA重組技術(shù)1977年Sanger以及Maxam和Gilbert發(fā)明快速DNA測(cè)序技術(shù)1981年P(guān)almiter和Brinster成功獲得第一只基因小鼠1985年P(guān)CR方法問(wèn)世；Watson出任“人類基因組計(jì)劃”首席科學(xué)家1990年美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)體細(xì)胞基因治療方案第2頁(yè)/共42頁(yè)分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史1995年英國(guó)“自然”雜志發(fā)表人類基因組全物理圖1997年英國(guó)愛(ài)丁堡羅斯林研究所培養(yǎng)出第一只克隆羊多莉1999年中國(guó)正式加入“人類基因組計(jì)劃（HGP）”2000年全部人類基因組測(cè)序工作宣告完成，進(jìn)入后基因組計(jì)劃時(shí)代(基因克隆計(jì)劃、基因組多樣性計(jì)劃、

cDNA計(jì)劃、蛋白質(zhì)計(jì)劃、細(xì)胞計(jì)劃）第3頁(yè)/共42頁(yè)分子生物學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一、分子生物學(xué)在發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用

1阿爾茲海默?。ˋD）的基因定位

2生物活性多肽及蛋白質(zhì)mRNA研究

確證腎素血管緊張素系統(tǒng)在遺傳性高血壓發(fā)病中起重要作用

3對(duì)某些病毒致病作用的研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞DNA整合有HBV-DNA，認(rèn)為乙肝與肝癌發(fā)病密切相關(guān)4認(rèn)識(shí)了某些遺傳疾病的發(fā)病機(jī)制地中海貧血是或基因缺失或點(diǎn)突變所致第4頁(yè)/共42頁(yè)二、分子生物學(xué)在疾病診斷中的作用發(fā)病過(guò)程：基因突變---mRNA---蛋白質(zhì)（激素）---細(xì)胞病變---組織器官病變---臨床癥狀根據(jù)基因突變檢測(cè)、基因連續(xù)性分析、mRNA檢測(cè)三種途徑，使用核酸分子雜交和PCR技術(shù)，進(jìn)行分子生物學(xué)檢查，使遺傳性疾病、感染性疾病和腫瘤等的診斷提前到基因和mRNA水平第5頁(yè)/共42頁(yè)

三、分子生物學(xué)在疾病治療中的應(yīng)用基因治療：將目的基因加以修飾，轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞中，以達(dá)到治療作用應(yīng)用：?jiǎn)位蜻z傳病、腫瘤、心血管、自身免疫疾病及病毒感染等危害較大且目前無(wú)有效治療途徑的疾病四、重組DNA技術(shù)與新藥研究

重組微生物、基因疫苗、細(xì)胞因子合成、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等第6頁(yè)/共42頁(yè)分子生物學(xué)的一般原理和研究方法第7頁(yè)/共42頁(yè)一、核酸的結(jié)構(gòu)和功能1核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)：磷酸二酯鍵連接成的核苷酸鏈核苷酸：戊糖、磷酸基團(tuán)、堿基堿基：DNA：A、G、T、CRNA：A、G、U、C核酸是極性分子，5’端為磷酸基團(tuán)，3’端為羥基，核酸序列的習(xí)慣寫(xiě)法是5’端3’端第8頁(yè)/共42頁(yè)核酸的結(jié)構(gòu)和功能2DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)：著名的雙螺旋結(jié)構(gòu)兩條核苷酸鏈通過(guò)堿基間氫鍵相連（A—T，C—G），走向相反。DNA的變性與復(fù)性：誘導(dǎo)因素：加熱、酸、堿、乙醇、丙酮、高鹽等

應(yīng)用：分子雜交的基礎(chǔ)第9頁(yè)/共42頁(yè)核酸的結(jié)構(gòu)和功能3DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)：DNA雙螺旋和核小體

串珠裝狀的核小體壓縮成螺旋形，進(jìn)一步折疊成染色單體，DNA長(zhǎng)度因此縮短10000倍4DNA功能

攜帶和傳遞遺傳信息，體現(xiàn)遺傳過(guò)程的相對(duì)保守性遺傳的中心法則

DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制

轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制（病毒）翻譯第10頁(yè)/共42頁(yè)核酸的結(jié)構(gòu)和功能5DNA的半保留復(fù)制原則第11頁(yè)/共42頁(yè)核酸的結(jié)構(gòu)和功能6RNA：

rRNA：組成核糖體

mRNA：傳遞遺傳信息由核內(nèi)至胞漿的核糖體

tRNA：轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸密碼子：共64個(gè)密碼子，有61個(gè)用于編碼20個(gè)氨基酸，另外還有3個(gè)作為終止密碼(UAA、UAG、UGA)第12頁(yè)/共42頁(yè)二、基因及其表達(dá)調(diào)控基因：合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列。一個(gè)基因不僅包括編碼序列，還包括所需的調(diào)控序列、5’端不翻譯序列、內(nèi)含子和3’非翻譯序列等所有核酸序列基因組：一個(gè)生物體的所有基因。人類指23對(duì)染色體中的所有基因第13頁(yè)/共42頁(yè)基因及其表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控：多層次

DNA及染色體水平轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄后水平翻譯水平蛋白質(zhì)加工水平第14頁(yè)/共42頁(yè)三、人類基因缺陷的主要類型突變指突變體中DNA結(jié)構(gòu)的任何改變，致使基因作用（結(jié)構(gòu)蛋白、酶等），以致個(gè)體表型改變（一）點(diǎn)突變：?jiǎn)蝹€(gè)核苷酸的置換（1）同義突變：GAUGAC均是天門(mén)冬氨酸密碼子（2）錯(cuò)義突變：翻譯出的氨基酸改變（3）無(wú)義突變：產(chǎn)生提前出現(xiàn)的終止密碼子（4）延長(zhǎng)突變：終止密碼子突變?yōu)榘被崦艽a子第15頁(yè)/共42頁(yè)人類基因缺陷的主要類型（二）缺失或插入小的缺失或插入，堿基數(shù)量非3的整倍數(shù)，稱移碼突變，若為3的整倍數(shù)，出現(xiàn)密碼子的插入或缺失（三）染色體畸變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)發(fā)生大范圍改變：倒位、缺失、插入、易位第16頁(yè)/共42頁(yè)四、基因工程基因工程

是指在體外的條件下，人工將DNA分子“剪切”并重新“拼接”，形成一個(gè)新的雜合的DNA分子，然后將它導(dǎo)入微生物或真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，使該基因在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，從而產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物或改造、創(chuàng)造新的生物類型第17頁(yè)/共42頁(yè)基因工程基因工程的基本程序（1）帶有目的基因的

DNA片段的獲得（2）DNA片段與載體

DNA連接（體外重組）（3）連接產(chǎn)物導(dǎo)入宿主細(xì)胞（4）重組體的擴(kuò)增、篩選與鑒定（5）目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)（6）表達(dá)產(chǎn)物的分離、鑒定等第18頁(yè)/共42頁(yè)基因工程

（一）基因工程的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

核酸修飾酶：連接酶、聚合酶、核酸酶、堿性磷酸酶等（二）基因工程的宿主細(xì)胞和載體原核細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌宿主細(xì)胞真核細(xì)胞：哺乳動(dòng)物細(xì)胞

大腸桿菌：質(zhì)粒、噬菌體衍生載體常用載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞：?jiǎn)捂準(zhǔn)删w載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒

第19頁(yè)/共42頁(yè)基因工程（三）目的基因的分離

已知基因的獲得：限制性內(nèi)切酶酶切法

PCR法、RT-PCR法、人工合成DNA片段法基因文庫(kù)篩選法未知基因的獲得：蛋白質(zhì)DNA策略

第20頁(yè)/共42頁(yè)基因工程（四）目的基因與載體的連接工具：DNA連接酶產(chǎn)物：重組體（五）重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞

轉(zhuǎn)化：導(dǎo)入細(xì)菌轉(zhuǎn)染：導(dǎo)入噬菌體、病毒宿主菌必須是限制酶缺陷型和DNA重組缺陷型第21頁(yè)/共42頁(yè)基因工程（六）重組體的篩選直接篩選法：借助遺傳表型進(jìn)行篩選插入失活法：pBR322質(zhì)粒結(jié)合氨芐青霉素（Ap）和四環(huán)素（Tc）抗性基因，插入后失活Tc

插入表達(dá)法：pTR262質(zhì)粒的四環(huán)素抗性（Tcr）基因上游cI基因，插入后cI基因失活，抗性表達(dá)（七）克隆基因的表達(dá)第22頁(yè)/共42頁(yè)基因工程

插入失活法篩選重組體示意圖第23頁(yè)/共42頁(yè)基因診斷一、基因診斷的基本原理運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能是否正常，從而對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷。基因診斷檢測(cè)的靶物是DNA或mRNA第24頁(yè)/共42頁(yè)基因診斷二、基因診斷的特點(diǎn)1高度特異性2高靈敏度及精確性：PCR方法克檢測(cè)出pg級(jí)水平靶基因3早期快速：結(jié)合桿菌培養(yǎng)需幾周，痰涂片染色陽(yáng)性率低，PCR方法一個(gè)工作日確診4被測(cè)基因不一定處于活化狀態(tài)三、基因診斷的臨床意義1優(yōu)生優(yōu)育3預(yù)防醫(yī)學(xué)

2器官移植4感染性疾病第25頁(yè)/共42頁(yè)核酸分子雜交技術(shù)定義：依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性原理，用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針檢測(cè)樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同源核酸序列的方法第26頁(yè)/共42頁(yè)核酸分子雜交技術(shù)一、探針的特征和種類探針是一段與被測(cè)核苷酸序列互補(bǔ)的帶標(biāo)記的核苷酸片段特征：1要加以標(biāo)記，帶示蹤物

2單鏈3選取基因編碼序列

4高度特異性5長(zhǎng)度十幾到幾千堿基

6標(biāo)記探針高靈敏度、穩(wěn)定，標(biāo)記方法簡(jiǎn)便、安全種類：基因組DNA探針、cDNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針

第27頁(yè)/共42頁(yè)核酸分子雜交技術(shù)二、探針的標(biāo)記物放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I非放射性物質(zhì)：生物素、地高辛、熒光素、酶（辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶等）及金屬Hg等三、核酸分子雜交方法液相雜交；固相雜交固相載體：硝酸纖維素膜、尼龍膜、乳膠、磁珠等第28頁(yè)/共42頁(yè)核酸分子雜交技術(shù)雜交基本程序第29頁(yè)/共42頁(yè)核酸分子雜交技術(shù)幾種固相核酸分子雜交方法：1Southern印跡雜交法：

DNA分子經(jīng)酶切核瓊脂糖凝膠電泳后，放入堿溶液中變性，將變性后的單鏈DNA從凝膠上吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上用與雜交第30頁(yè)/共42頁(yè)核酸分子雜交技術(shù)2Northern印跡雜交法：經(jīng)典的RNA分析法，類似Southern印跡，主要區(qū)別是在變性劑存在下，以瓊脂糖凝膠電泳分離RNA3斑點(diǎn)或狹縫雜交4原位雜交：核酸分子探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交第31頁(yè)/共42頁(yè)核酸分子雜交技術(shù)四、雜交信號(hào)的檢測(cè)

1放射自顯影：X光片檢測(cè)放射性核素標(biāo)記物2非放射性探針檢測(cè)：（1）偶聯(lián)（2）顯色：酶促、熒光、化學(xué)發(fā)光第32頁(yè)/共42頁(yè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

1985年KaryBM創(chuàng)建了聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)，又稱體外基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)可擴(kuò)增核酸靶序列，增加106倍，極大提高檢測(cè)靈敏度原理：利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，模仿體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程，在附加的一對(duì)引物之間誘發(fā)聚合酶反應(yīng)。PCR全過(guò)程由DNA模板變性、模板與引物結(jié)合及引物延伸三個(gè)步驟組成第33頁(yè)/共42頁(yè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR反應(yīng)的原理示意圖1DNA模板變性2

模板與引物結(jié)合3引物延伸第34頁(yè)/共42頁(yè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR條件的優(yōu)化1模板核酸：

來(lái)源廣泛、需部分純化、去除DNA聚合酶抑制劑

一般宜用ng級(jí)的克隆DNA，g水平的染色體DNA或104拷貝的待擴(kuò)增模板用于檢測(cè)目的，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一般不超過(guò)500bp，以100-300bp為好2引物應(yīng)純化，濃度不宜過(guò)高一般終濃度為0.2-1.0mol/L第35頁(yè)/共42頁(yè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）3緩沖液目前最常用PCR反應(yīng)的緩沖液體系為10-50mmol/LTris-HCl（PH8.3-8.8，20°C）偏堿性有利于TaqDNA聚合酶作用緩沖液中50mmol/LKCl利于引物退火

Mg2+對(duì)產(chǎn)量和特異性有顯著影響，過(guò)高特異性下降；過(guò)低產(chǎn)量減少。在各種dNTP濃度為200mol/L時(shí)Mg2+為1.5-2.0mmol/L較合適第36頁(yè)/共42頁(yè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）4dNTP濃度

常采用50-200mol/L的dNTP4種dNTP濃度要一致5TaqDNA聚合酶用量在100l總反應(yīng)液中，一般所需TaqDNA聚合酶用量為0.5-5U，通常加入2.5U，足以達(dá)到每分鐘延伸1000-4000個(gè)核苷酸速度第