脂質體的應用與制備第一頁，共二十四頁，2022年，8月28日脂質體—結構

英國科學家龐漢姆等在1965年進行生物膜研究時，發(fā)現(xiàn)磷脂分子在水中分散后能夠自發(fā)的形成一種囊泡體，這種囊泡體具有類似于細胞膜的雙分子層結構，他將這種囊泡體稱為脂質體。20世紀70年代初用脂質體作為藥物載體包埋淀粉葡萄糖苷酶治療糖原沉積病首次獲得成功后,脂質體便引起了廣泛關注。第二頁，共二十四頁，2022年，8月28日磷脂分子具有一個親水的極性頭部和一個疏水的非極性尾部，因此在組成脂質體時，磷脂的親水極性頭部位于脂質體雙分子層的外部，疏水的非極性尾部朝向脂質體雙分子層的中間。脂質體(liposome)是單層或多層脂質雙分子膜以同心圓的形式包封而成,類似細胞膜的微球體。第三頁，共二十四頁，2022年，8月28日脂質體按照不同的直徑大小以及內囊數(shù)目可分為以下幾種類型：√直徑小于100nm的小單層脂質體(SUV)√直徑大于100nm的大單層脂質體(LUV)√多層同心的多層脂質體(MLV)√非同心多囊泡脂質體(MVL)第四頁，共二十四頁，2022年，8月28日作用：脂質體的囊泡結構能夠充當藥物分子或其他物質等的載體。親脂性的藥物可以儲存在磷脂雙分子層中，親水性的藥物可以存儲在脂質體的內囊中。脂質體—分類應用

第五頁，共二十四頁，2022年，8月28日√長循環(huán)脂質體長循環(huán)脂質體是指經(jīng)過修飾作用的具有一定空間穩(wěn)定性的脂質體，常見的修飾物有聚乙二醇（PEG）、神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）等。因其具有空間穩(wěn)定性，所以長循環(huán)脂質體可在體內長時間駐留，進而使藥物的作用時間得到延長，發(fā)揮出長效作用。GM1能夠增強脂質體膜的剛性，減少單核吞噬細胞系統(tǒng)（MPS）對長循環(huán)脂質體的吞噬率。PEG可以在脂質體的表面產(chǎn)生空間位阻層，以使長循環(huán)脂質體不被內皮網(wǎng)狀系統(tǒng)（RES）吞噬，進而延長藥物作用時間。第六頁，共二十四頁，2022年，8月28日√熱敏脂質體熱敏脂質體又叫溫度敏感脂質體，其所使用的磷脂具有比人體體溫稍高的相變溫度，在當環(huán)境溫度達到相變溫度時，脂質體雙分子層會由“膠晶態(tài)”轉變?yōu)槟ち鲃有愿鼜姷摹耙壕B(tài)”，從而促使脂質體所包封藥物的釋放率加大。在研究中，有學者提出將腫瘤等病灶部位升溫，使局部溫度能夠高于熱敏脂質體的相變溫度，可以使抗腫瘤藥物在腫瘤病灶部位快速釋放，來提高脂質體的靶向治療作用。熱敏脂質體已被廣泛的應用于核酸、抗生素和抗腫瘤藥物等的載體研究，尤其在抗腫瘤藥物載體方向的研究已經(jīng)取得了較深入的成果。第七頁，共二十四頁，2022年，8月28日√pH敏感脂質體pH敏感脂質體是基于腫瘤間質處的pH值比正常組織低的特點而設計的一種具有細胞內靶向和控制藥物釋放作用的脂質體。目前常用的PH敏感脂質體為二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。當脂質體處于中性pH環(huán)境時,DOPE的羧基離子可提供有效靜電進行排斥,使脂質體保持穩(wěn)定,當pH改變時,雙層脂質體可轉變成六角相,引發(fā)脂質體膜不穩(wěn)定、聚集、融合、釋放內容物。從而將包封物導入細胞質并主動靶向到病變組織,提高藥物的靶向性。第八頁，共二十四頁，2022年，8月28日√免疫脂質體脂質體的表面連接上抗體或受體，則可通過特異性結合作用，使脂質體的移動具有靶向性，這樣的脂質體叫做免疫脂質體。由于其具有運載量大、靶向性強和毒副作用小等優(yōu)點，也被學者研究來用于腫瘤靶向治療?！檀判灾|體磁性脂質體是在脂質體中摻入鐵磁性物質制成,在體外磁場的作用下,把抗腫瘤藥物選擇性地輸送和定位于靶細胞,從而降低藥量,減少毒性，提高療效。在交變磁場作用下,到達靶區(qū)的磁場粒子能迅速升溫至有效治療溫度,導致腫瘤組織壞死,而無磁性脂質體的正常組織則不受損傷。第九頁，共二十四頁，2022年，8月28日脂質體—制備√實驗原理常見的磷脂分子結構中有兩條較長的疏水烴鏈和一個親水基團。將適量的磷脂加至水或緩沖溶液中，磷脂分子定向排列，其親水基團面向兩側的水相，疏水的烴鏈彼此相對締和為雙分子層，構成脂質體。用于制備脂質體的磷脂有天然磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂等；合成磷脂，如二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿等。常用的附加劑為膽固醇。膽固醇也是兩親性物質，與磷脂混合使用，可制得穩(wěn)定的脂質體，其作用是調節(jié)雙分子層的流動性，降低脂質體膜的通透性。其他附加劑有十八胺、磷脂酸等，這些附加劑能改變脂質體表面的電荷性質，從而改變脂質體的包封率、體內外穩(wěn)定性、體內分布等其他相關參數(shù)。第十頁，共二十四頁，2022年，8月28日2.實驗方法

在制備含藥脂質體時，根據(jù)藥物裝載的機理不同，可分為“主動載藥”與“被動載藥”兩大類。所謂“主動載藥”，即通過脂質體內外水相的不同離子或化合物梯度進行載藥，主要有K+-Na+梯度和H+梯度(即pH梯度)等。傳統(tǒng)上，人們采用最多的方法是“被動載藥”法?！氨粍虞d藥”即首先將藥物溶于水相或有機相(脂溶性藥物)中，然后按所選擇的脂質體制備方法制備含藥脂質體。

第十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日對于脂溶性的、與磷脂膜親和力高的藥物，“被動載藥”法較為適用。而對于兩親性藥物，其兩相分配系數(shù)受介質的pH值和離子強度的影響較大，包封條件的較小變化，就有可能使包封率有較大的變化，首選“主動載藥”方法。下圖是“主動載藥”中pH梯度法載藥原理示意圖。第十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日H+H+DDDH+DH+insideacidpHoudsideneutralpH第十三頁，共二十四頁，2022年，8月28日被動載藥(1)薄膜分散法將磷脂溶解于適量的氯仿或乙醚等有機溶劑中，在旋轉蒸發(fā)儀上旋轉蒸發(fā)使磷脂干燥，使磷脂在瓶壁上形成一層脂質薄膜。使用合適的溶液來水化已干燥的脂質薄膜，并根據(jù)磷脂的濃度，通過振搖、超聲或渦旋震蕩等方式進行處理，得到的主要是大多室脂質體的混懸液。(2)復乳法先將脂質體的膜材和脂溶性藥物溶于適量有機溶劑中，按比例加入少量水相溶液，通過超聲或震蕩等方法進行處理以得到狀態(tài)穩(wěn)定的W/O乳化液，再加入大量水相溶液進行第二次乳化處理，得到W/O/W乳化液，再通過減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，即得到脂質體懸液。（3）逆相蒸發(fā)法將磷脂等脂溶性成分溶于有機溶劑，再按一定比例與含藥的緩沖液混合、乳化，然后減壓蒸去有機溶劑即可形成脂質體。該法適合于水溶性藥物、大分子活性物質，如胰島素等的脂質體制備，可提高包封率。第十四頁，共二十四頁，2022年，8月28日脂質體包封率的測定評價脂質體質量的指標有粒徑、粒徑分布和包封率等。其中脂質體的包封率是衡量脂質體內在質量的一個重要指標。脂質體包封率是指被包裹物質（如某藥物）在脂質體懸液中占藥物總量的百分量。決定其包封率的因素為藥物與磷脂膜的作用力、膜材的組成、脂質體的內水相體積、脂質體數(shù)目及藥脂比(藥物與磷脂膜材比)等。常見的包封率測定方法有分子篩法、超速離心法、超濾法、陽離子交換樹脂法?！瓣栯x子交換樹脂法”是利用離子交換作用，將荷正電的未包入脂質體中的藥物(即游離藥物)，通過陽離子交換樹脂吸附除去，包封于脂質體中的藥物，由于脂質體荷負電荷，不能被陽離子交換樹脂吸附，從而達到分離目的，進而測定包封率。

原理示意圖見下圖。第十五頁，共二十四頁，2022年，8月28日Na+

SO-3Na+

SO-3Na+

SO-3Na+

SO-3Ber+Ber+Ber+Ber+Ber

－－－－－－－－－－－－第十六頁，共二十四頁，2022年，8月28日以龍膽苦苷為例制備龍膽苦苷脂質體。龍膽具有利膽、抗炎、健胃、降壓等作用。龍膽中主含環(huán)烯醚萜苷類成分，龍膽苦苷為其中主要有效成分。實驗步驟：1.提純龍膽苦苷2.制龍膽苦苷標準溶液，作標準曲線（為包封率的測定做準備）3.檢測龍膽苦苷的穩(wěn)定性以及儀器的精密度4.選擇了復乳法、薄膜水化法、逆相蒸發(fā)法等三種脂質體常見制備方法進行制備龍膽苦苷脂質體。第十七頁，共二十四頁，2022年，8月28日√復乳法：準確稱取卵磷脂以及膽固醇于圓底旋蒸瓶中，加入乙醚將其溶解，量取的龍膽苦苷溶液與之混合，用超聲波細胞粉碎儀進行超聲處理，形成W/O型乳化液，加入超純水作為外水相，繼續(xù)超聲處理，形成W/O/W型乳化劑，將其置于旋轉蒸發(fā)儀上，在水浴、真空的條件下旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，定容。即得到脂質體懸液。 √薄膜水化法準確稱取卵磷脂以及膽固醇于圓底旋蒸瓶中，加入乙醚將其溶解置于旋轉蒸發(fā)儀上，在水浴、真空的條件下旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑直至圓底旋蒸瓶的瓶壁上形成均勻的脂質薄膜，量取龍膽苦苷溶液與之混合，在漩渦混合器上振搖后，并用超聲波細胞粉碎儀進行超聲處理，定容。即得到脂質體懸液。第十八頁，共二十四頁，2022年，8月28日√逆相蒸發(fā)法準確稱取卵磷脂以及膽固醇于圓底旋蒸瓶中，加入乙醚將其溶解，取龍膽苦苷溶液與之混合，并用超聲波細胞粉碎儀進行超聲處理，形成W/O型乳化液，將其置于旋轉蒸發(fā)儀上，在水浴、真空條件下旋轉蒸發(fā)至生成反膠束凝膠，繼續(xù)維持真空度旋蒸至反膠束凝膠塌陷生成水混懸液，定容。即得到脂質體懸液。第十九頁，共二十四頁，2022年，8月28日5.包封率的測定分別量取相同體積脂質體懸液置于兩支離心管中。向其中一支離心管加入的曲拉通溶液并置于水浴中進行破乳，按標準曲線測定方法進行測定，并根據(jù)標準曲線計算溶液中龍膽苦苷的總濃度C總。向另一支離心管中加入的魚精蛋白溶液，混勻后靜置，用臺式冷凍離心機進行離心，取上清液定容，按標準曲線測定方法進行測定，根據(jù)標準曲線計算溶液中游離的龍膽苦苷的濃度C游離。然后使用公式：EE（%）=（C總-C游離）/C總×100%6.儲存—水相的選擇。脂質體通常以靜脈注射作為給藥途徑，合適的水相選擇是必要的。第二十頁，共二十四頁，2022年，8月28日影響脂質體制備的因素：藥液濃度，膽固醇與卵磷脂質量比，有機相與內水相體積比，超聲功率，水浴溫度，減壓蒸發(fā)時間等。第二十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日結語新型脂質體的研究已從單一脂質體向多功能脂質體如pH敏感免疫脂質體、熱敏感長循環(huán)脂質體等方向發(fā)展.這些脂質體在穩(wěn)定性、靶向性和療效方面都比傳統(tǒng)脂質體有明顯改善,但成本，簡化完善制備工藝仍是脂質體在藥物載體應用上的關鍵問題。第二十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日參考文獻：[1]姚新武.脂質體的制備及應用研究[D].北京化工大學,2012.[2]楊彤.新型脂質體的研究進展[J].醫(yī)藥導報,2009,03:336-338.[3]朱斌,許時嬰,夏書芹.薄膜水化法制備輔酶Q_(10)脂質體[J].食品與機械,20