DNA的生物合成精簡(jiǎn)第1頁/共67頁大綱原核生物DNA的復(fù)制原核與真核生物DNA復(fù)制的差異逆轉(zhuǎn)錄DNA的損傷與修復(fù)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)分析與PCR技術(shù)（二）DNA的生物合成（三）RNA的生物合成RNA的轉(zhuǎn)錄及加工RNA的復(fù)制RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（一）中心法則第2頁/共67頁（一）中心法則第3頁/共67頁DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，合成出cDNA的過程。轉(zhuǎn)錄酶是DNA指導(dǎo)下的RNA合成酶逆轉(zhuǎn)錄酶是RNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶第4頁/共67頁例題何為中心法則？廣義的中心法則在狹隘的中心法則的基礎(chǔ)上有哪些發(fā)展？南京農(nóng)業(yè)大學(xué)第5頁/共67頁（二）DNA的生物合成2.1原核生物DNA的復(fù)制第6頁/共67頁一、DNA的半保留復(fù)制父鏈子鏈DNA雙鏈解開，以每條單鏈為模板，合成其互補(bǔ)的子鏈，成為兩個(gè)相同的子代DNA，其中每個(gè)子代DNA分子擁有親代和新合成的鏈各一條。1.定義第7頁/共67頁驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：密度梯度離心實(shí)驗(yàn)含15N-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于含14N的普通培養(yǎng)基

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于含14N的普通培養(yǎng)基第二代第8頁/共67頁例題如果放射性標(biāo)記的雙鏈DNA分子在無放射性標(biāo)記的溶液中經(jīng)過兩次復(fù)制，那么所產(chǎn)生的四個(gè)DNA分子，其放射性狀況如何？

A.兩個(gè)分子含有放射性

B.全部含有放射性C.雙鏈中各有一半含有放射性D.所有分子的兩條鏈都沒有放射性2001年上海交大類似題目@2002南農(nóng)大第9頁/共67頁二、DNA的半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈后隨鏈岡崎

片段新鏈按5’-3’方向合成

前導(dǎo)鏈為連續(xù)合成

后隨鏈的合成不連續(xù)，由許多岡崎片段組成第10頁/共67頁例題作出DNA半不連續(xù)復(fù)制示意圖，注明鏈的方向，并畫出復(fù)制叉“看似同向前進(jìn)”的特征。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)第11頁/共67頁全稱：DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶/依賴于DNA的DNA聚合酶簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：①

53

的聚合活性②核酸外切酶活性1.DNA聚合酶（DNApolymease）三、參與DNA復(fù)制的酶第12頁/共67頁5'

ucgagcuag-OH

3'

5'

ucgagcuagDNApoldNTP3'

agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc5'3'

agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc5'catcggatcgcatcgtcacgtgctag

3'(dNMP)n

+dNTP(dNMP)n+1

+PPi

DNA聚合酶DNA模板，Mg2+①

5′3′聚合作用只聚合，不連接。能量來自dNTP中磷酸酐鍵的斷裂和焦磷酸水解產(chǎn)生的能量。第13頁/共67頁5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

35外切酶活性

53外切酶活性?能切除突變的DNA片段和RNA引物。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解，起校對(duì)作用。②

核酸外切酶活性

第14頁/共67頁DNA聚合酶催化活性功能5'→3'聚合3'→5'

外切5'→3'

外切原

核

生

物DNA

聚合酶Ⅰ＋＋＋切除引物，修復(fù)DNA

聚合酶Ⅱ＋＋修復(fù)（活性低）DNA

聚合酶Ⅲ＋＋鏈的延長(zhǎng)

（活性高）E.Coli有至少五種DNA聚合酶第15頁/共67頁DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是1999年新發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，生物體可誘導(dǎo)產(chǎn)生兩種酶，但它們的修復(fù)準(zhǔn)確率低，會(huì)導(dǎo)致生物的高變異率。第16頁/共67頁例題大腸桿菌中催化DNA新鏈延長(zhǎng)的主要酶是（）

A.DNA連接酶

B.DNA聚合酶IC.DNA聚合酶IID.DNA聚合酶Ⅲ2008年農(nóng)學(xué)聯(lián)考05年中科院考題中，問的是“負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的酶”。E.ColiDNA聚合酶I的酶活性有哪些？該酶在復(fù)制中的主要作用又是什么？2004@南農(nóng)大第17頁/共67頁3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’HO5’3’5’3’作用：催化雙鏈DNA的切口連接成3’,5’-磷酸二酯鍵。注意：此酶不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來。2.DNA連接酶（DNAligase）需能：大腸桿菌中以NADH為能量，動(dòng)物以ATP為能量。第18頁/共67頁作用：通過水解ATP釋放的能量，解開雙鏈DNA中堿基配對(duì)的氫鍵，使DNA變?yōu)閱捂溄庑窤TP3.使DNA雙螺旋解開所需的酶或蛋白質(zhì)（1）DNA解（螺）旋酶（DNAhelicase）第19頁/共67頁大部分解旋酶沿模板DNA一條鏈5’→3’方向移動(dòng)，與復(fù)制叉前進(jìn)同向；rep蛋白等則沿著模板DNA另一條鏈3’→5’方向移動(dòng)，與復(fù)制叉前進(jìn)也是同向。第20頁/共67頁與解開的單鏈DNA結(jié)合，防止重新形成雙鏈防止核酸酶降解單鏈DNASSB（2）單鏈結(jié)合蛋白

（single-strandbindingprotein，SSBP）第21頁/共67頁作用：108

局部解鏈（3）拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）調(diào)節(jié)DNA分子超螺旋類型和數(shù)量第22頁/共67頁拓?fù)洚悩?gòu)酶I拓?fù)洚悩?gòu)酶II使DNA一條鏈斷裂和再連接使DNA兩條鏈斷裂和再連接反應(yīng)無需供能反應(yīng)需要ATP減少負(fù)超螺旋，準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)錄引入負(fù)超螺旋，抵消復(fù)制叉移動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的正超螺旋與轉(zhuǎn)錄有關(guān)與復(fù)制有關(guān)2.類型第23頁/共67頁例題能夠?qū)NA雙鏈解開成單鏈的酶是A.引發(fā)酶B）拓?fù)洚悩?gòu)酶C）限制性內(nèi)切酶D）解螺旋酶南京農(nóng)業(yè)大學(xué)第24頁/共67頁任何DNA聚合酶都不能從頭合成新的DNA鏈，都只能在引物的基礎(chǔ)上延長(zhǎng)DNA鏈。催化這些引物合成的酶稱為引發(fā)酶，由引發(fā)體介導(dǎo)合成。大腸桿菌中的引發(fā)酶是DnaG蛋白4.引發(fā)酶（primase）和引發(fā)體（primosome）引物多為RNA第25頁/共67頁DnaA引發(fā)體由引發(fā)前體與引發(fā)酶組裝而成5′3′3′5′引發(fā)酶DnaC引發(fā)體解螺旋酶作用：a.識(shí)別復(fù)制起點(diǎn)；b.解開DNA雙鏈；c.引發(fā)引物RNA合成。第26頁/共67頁起始延長(zhǎng)終止四、原核生物DNA的復(fù)制過程1、復(fù)制的起始①復(fù)制的起點(diǎn)和方向③RNA引物的合成②

起點(diǎn)的識(shí)別和雙鏈的解開第27頁/共67頁該區(qū)域具有高度保守的重復(fù)序列，并富含AT序列，雙鏈容易分開。①復(fù)制的起點(diǎn)和方向（origin、ori）第28頁/共67頁原核生物只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的。真核染色體DNA有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，形成多個(gè)復(fù)制眼，同時(shí)雙向復(fù)制。ori第29頁/共67頁②起點(diǎn)的識(shí)別和雙鏈的解開a.DnaA蛋白識(shí)別起始位點(diǎn)，形成起始復(fù)合物。

DnaA

DnaB、DnaC拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB3535b.由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶DnaB作用，解開雙鏈。c.SSB結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。稱為引發(fā)前體或預(yù)引發(fā)體第30頁/共67頁3535在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段作為引物，獲得3'-OH。

引物3'HO5'引物酶③引物的合成第31頁/共67頁引物合成后，由DNApolⅢ催化，按堿基配對(duì)原則，將dNTP逐一添加到引物3’末端，形成磷酸二酯鍵，使新合成的鏈不斷延長(zhǎng)。2、復(fù)制的延長(zhǎng)

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol第32頁/共67頁與復(fù)制叉前進(jìn)同向的子代DNA合成是連續(xù)的，叫先導(dǎo)鏈（領(lǐng)頭鏈）；與復(fù)制叉前進(jìn)反向的子代DNA合成是不連續(xù)的，叫后隨鏈（岡崎片段）半不連續(xù)復(fù)制第33頁/共67頁引物酶在復(fù)制原點(diǎn)附近合成一段RNA引物；

DNA

polⅢ在引物的3'末端逐個(gè)添加脫氧核苷酸。隨著復(fù)制叉的推進(jìn)，親代DNA雙螺旋不斷被解開，先導(dǎo)鏈也不斷延伸。

①先導(dǎo)鏈的合成復(fù)制叉的推進(jìn)第34頁/共67頁②后隨鏈的合成引物的合成

岡崎片段的合成后隨鏈的每個(gè)岡崎片段都需要合成RNA引物。DNA聚合酶Ⅲ在引物的3'末端使DNA鏈延伸，直至抵達(dá)其下游的另一個(gè)岡崎片段的RNA引物的5'端。第35頁/共67頁RNA引物DNApolIDNApolIDNA連接酶岡崎片段的連結(jié)：第36頁/共67頁前導(dǎo)鏈后隨鏈3’5’3’5’延長(zhǎng)5’5’5’3’3’5’3’3’5’SSBDNAPolymerase岡崎片斷RNA引物引物酶5’3’5’TOPOⅡ解旋酶第37頁/共67頁雙向復(fù)制的環(huán)狀DNA分子，匯合點(diǎn)就是復(fù)制終止點(diǎn)；在DNA聚合酶I的作用下，切除引物RNA，填補(bǔ)空缺DNA；在連接酶作用下，連接各子鏈DNA。3、復(fù)制的終止第38頁/共67頁

小結(jié)主要成員主要作用解旋酶斷開氫鍵，解開DNA雙鏈SSB穩(wěn)定解開的單鏈DNA引發(fā)酶合成RNA引物。與引發(fā)前體形成引發(fā)體。

拓?fù)洚悩?gòu)酶

使DNA解旋DNA聚合酶

水解引物、DNA復(fù)制、修復(fù)作用DNA連接酶催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接問答題：請(qǐng)從參與E.coliDNA復(fù)制所需的酶和因子中，選取五種不同功能的酶或因子，列表說明各自的作用。2002@南農(nóng)大第39頁/共67頁起始：

DnaA識(shí)別起點(diǎn)

→拓?fù)洚悩?gòu)酶、DnaB和SSB等配合解開雙鏈

→引發(fā)酶合成RNA引物DNA的復(fù)制過程

（半不連續(xù)復(fù)制）終止：

DNA聚合酶I切除引物并填補(bǔ)空缺

→DNA連接酶連上缺口延伸：DNA聚合酶Ⅲ催化延長(zhǎng)

先導(dǎo)鏈：5’-3’方向連續(xù)合成；

后隨鏈：岡崎片段的不連續(xù)合成第40頁/共67頁例題DNA復(fù)制時(shí)兩條鏈的合成方式有區(qū)別嗎？

如果有，區(qū)別是什么？2007年中科院DNA復(fù)制中有哪些確保準(zhǔn)確性的措施？2005年南農(nóng)大第41頁/共67頁2.2原核與真核生物DNA復(fù)制的差異第42頁/共67頁相同點(diǎn)都是半保留復(fù)制都是半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制方向第43頁/共67頁原核真核單點(diǎn)復(fù)制（一個(gè)復(fù)制子）可多次連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制多點(diǎn)復(fù)制（多個(gè)復(fù)制子）一個(gè)細(xì)胞周期僅復(fù)制一次主要復(fù)制酶為DNApolⅢ有多種聚合酶引物和岡崎片段長(zhǎng)引物和岡崎片段短有端粒和端粒酶無核小體DNA與組蛋白構(gòu)成核小體第44頁/共67頁2.3逆轉(zhuǎn)錄第45頁/共67頁DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄）：以RNA為模板，按RNA中的堿基順序進(jìn)行堿基配對(duì)合成cDNA（complementaryDNA）。第46頁/共67頁例題勞氏肉瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是

A.DNA

B.cDNAC.ccDNAD.Ts-DNA2009年農(nóng)學(xué)聯(lián)考第47頁/共67頁逆轉(zhuǎn)錄酶模板：RNA

引物：DNA或RNA

底物：dNTP，需Mg2+和Mn2+按5’-3’方向合成DNA新鏈不具有3’-5’校正的外切核酸酶活性，合成錯(cuò)誤率很高。第48頁/共67頁例題逆轉(zhuǎn)錄酶是一類（）

A.DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶

B.DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶C.RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶D.RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶2003年西南農(nóng)業(yè)大學(xué)第49頁/共67頁催化三種反應(yīng)：

①逆轉(zhuǎn)錄酶活性：

RNA指導(dǎo)合成與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈(cDNA)；

②RNaseH活性：

水解RNA-DNA雜合分子上的RNA；

③DNA聚合酶活性：

以新合成的DNA鏈為模板合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，即DNA指導(dǎo)的DNA合成。第50頁/共67頁例題一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的單鏈RNA堿基組成摩爾百分比為：A,15；U,25;G,25;C:35。由該病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成的雙鏈DNA的堿基組成是多少？2007年中科院第51頁/共67頁逆轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義補(bǔ)充和豐富了中心法則幫助人類疾病的預(yù)防

如：HIV、狂犬病毒成為基因組的不穩(wěn)定因素，促進(jìn)基因組重組；第52頁/共67頁2.4DNA的損傷與修復(fù)第53頁/共67頁物理因素：如紫外線、電離輻射等；化學(xué)因素：如堿基類似物（5-溴尿嘧啶）

堿基修飾劑（亞硝酸、烷化劑）

嵌入染料（溴化乙啶）；損傷的結(jié)果：突變或死亡突變的表現(xiàn)：堿基對(duì)置換、插入堿基和堿基缺失一、DNA損傷的類型及產(chǎn)生的原因轉(zhuǎn)換、顛換移碼突變

例如吖啶類化合物第54頁/共67頁例題：DNA分子的下列突變中最有可能使生物致死的是：A.插入一個(gè)或丟失一個(gè)核苷酸B.同時(shí)丟失三個(gè)核苷酸C.在某部位發(fā)生堿基替換D.插入一個(gè)和在相近部位丟失一個(gè)核苷酸2007@南農(nóng)博士入學(xué)第55頁/共67頁環(huán)丁烷基二聚體DNA同一條鏈上相連的胸腺嘧啶受紫外線照射的刺激下，以環(huán)丁基環(huán)的結(jié)構(gòu)形成嘧啶二聚體（TT）。UV雙鏈間H鍵作用被破壞，引起了DNA變形，妨礙了DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等作用。第56頁/共67頁1.直接修復(fù)（1）光修復(fù)

可見光（400700nm）可激活光復(fù)活酶切開嘧啶二聚體，恢復(fù)成正常DNA結(jié)構(gòu)的過程。注意：只適合于紫外光引起的DNA嘧啶二聚體損傷；高等哺乳動(dòng)物沒有！二、修復(fù)的方式與機(jī)制第57頁/共67頁（2）其它酶直接修復(fù)如：O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

當(dāng)堿基G烷基化形成O6-甲基鳥嘌呤時(shí)，該酶可以識(shí)別并將O6位的甲基轉(zhuǎn)移到酶自身基團(tuán)上，使G恢復(fù)正常。第58頁/共67頁UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA連接酶ATP